沉默Ras同源物家族成員C對(duì)唾液腺腺樣囊性癌增殖、侵襲和遷移的影響

[摘要]目的 探討沉默Ras同源物家族成員C（RhoC）對(duì)唾液腺腺樣囊性癌（SACC）增殖、凋亡、侵襲、遷移和上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響及其分子機(jī)制。方法 選擇2019年1月1日-2024年3月1日于青島市市立醫(yī)院手術(shù)切除的SACC病灶和正常唾液腺組織各27例，通過蛋白免疫印跡（Western blot）和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)RhoC的表達(dá)水平。針對(duì)RhoC基因序列設(shè)計(jì)3條小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染至SACC-LM和SACC-83細(xì)胞系中并評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。通過Western blot比較RhoC、Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶1（ROCKl）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、扭曲家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1（TWISTI）、E-鈣黏蛋白（Ecadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的蛋白表達(dá)水平。CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、傷口愈合實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的差異。生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)RhoC可能的上游微小RNA（miRNA）及其在SACC中的表達(dá)情況，雙熒光紊酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證二者的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果RhoC在SACC中的表達(dá)顯著上升（Plt;0.05）。沉默RhoC后，實(shí)驗(yàn)組ROCK1、p-p38MAPK、TWIST1、N-cadherin、Vimentin的表達(dá)顯著下降，E-cadherin的表達(dá)顯著上升（Plt;0.05）；p38MAPK的表達(dá)無明顯差異（Pgt;05）；細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力顯著下降，凋亡率顯著上升（Plt;0.05）。miR-138-5p在SACC中低表達(dá)，miR-138-5p micmic可以顯著下調(diào)轉(zhuǎn)染RhoC野生型質(zhì)粒后293T細(xì)胞的熒光素酶活性（Plt;0.05）。結(jié)論RhoC在SACC中高表達(dá)，沉默RhoC可能靶向下游ROCKl/p38MAPK/TWISTI信號(hào)通路從而抑制SACC的增殖、侵襲、遷移和EMT，同時(shí)促進(jìn)其凋亡。miR-138-5p在SACC中低表達(dá)，是RhoC潛在的上游基因，二者可能存在結(jié)合位點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]唾液腺腺樣囊性癌；Ras同源物家族成員C；Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶1；上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；mR-138-5p

[中圖分類號(hào)]R782[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[doi]10.7518/hxkq.2024.2024092

唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是一種常見的上皮來源的惡性腫瘤，占唾液腺惡性腫瘤的10％，占頭頸部惡性腫瘤的1％。該腫瘤具備高度神經(jīng)浸潤(rùn)性、極易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性標(biāo)志，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)10年總生存率可驟降52％。目前對(duì)于SACC的治療方法是以手術(shù)為主的綜合序列治療，但難以抑制腫瘤的擴(kuò)散和復(fù)發(fā)。因此，探究SACC進(jìn)展的分子機(jī)制并加以干預(yù)具有重要的臨床意義。

Ras同源物家族成員C（Ras homolog familymember C.RhoC）是一種常見的致癌基因，該基因編碼的RhoC蛋白屬于Rho GTP酶家族，可在三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）和二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）結(jié)合態(tài)之間切換，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，影響肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白活性，從而調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、極性和分裂等多種功能。近年來多項(xiàng)研究證實(shí)，RhoC既可影響Rho相關(guān)蛋白激酶（Rho-associated protein kinases，ROCK）和絲切蛋白（cofilin，CFL）等下游信號(hào)來促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移，同時(shí)又受到miR106b、miR-93等上游基因的調(diào)控。本課題組既往研究證實(shí)該家族成員RhoA可促進(jìn)SACC的惡性生物學(xué)行為，但有關(guān)RhoC對(duì)SACC影響的研究仍然較少。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察RhoC在SACC中的表達(dá)情況，采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）將其沉默后觀察下游信號(hào)和SACC增殖、凋亡、侵襲、遷移及上皮，間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的改變，同時(shí)通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)RhoC可能的上游微小RNA（micro RNA，miRNA），以期為SACC的分子靶向治療提供新思路。

1材料和方法

1.1材料和試劑

1.1.1組織樣本

液氮凍存的SACC標(biāo)本及正常唾液腺組織各6例來自2024年1月1日-3月1日于青島市市立醫(yī)院口腔頜面外科行手術(shù)切除的6名患者。其中5例來自腮腺，1例來自腭腺?；颊吣挲g為41～74歲，中位數(shù)為61歲；男4例，女2例。免疫組化所需SACC石蠟組織切片及正常唾液腺組織各21例，取自2019年1月1日-2024年3月1日于青島市市立醫(yī)院病理科明確診斷的21名SACC患者。其中14例來自腮腺，4例來自腭腺，3例來自舌下腺?；颊吣挲g為41～81歲，中位數(shù)為66歲；男12例，女9例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）手術(shù)切除原發(fā)灶；2）術(shù)前未經(jīng)放化療；3）腫瘤組織經(jīng)組織病理學(xué)診斷為SACC；4）正常唾液腺組織經(jīng)組織病理學(xué)檢查未見癌變。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）原發(fā)灶已行放化療或其他非手術(shù)治療；2）既往有惡性腫瘤病史或全身伴隨其他惡性腫瘤；3）嚴(yán)重糖尿病、腎衰竭或其他系統(tǒng)性疾病，全身情況差，無法耐受手術(shù)者；4）臨床及病理資料不完整者。本研究已得到青島市市立醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2024-LW-023），所有患者均已知曉手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)與標(biāo)本用途，并簽署知情同意書。

1.1.2細(xì)胞系

人SACC-LM細(xì)胞系購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司；人SACC-83細(xì)胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司；人胚胎腎細(xì)胞293 （HEK293T）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。

1.1.3其他材料

RPMI-1640培養(yǎng)基、青，鏈霉素、0.25％胰蛋白酶（Thermo Fisher公司，美國）；胎牛血清（BI公司，以色列）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Amersco公司，美國）；SteadyPure通用型RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒、SYBR GreenPro Taq HS預(yù)混型實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerasechain reachon，RT-qPCR）試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；siRNA-RhoC（上海吉瑪公司）；引物磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）、RhoC（上海生工生物工程有限公司）；抗RhoC、抗Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCKl）、抗p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK）、抗磷酸化p38MAPK （p-p38MAPK）、抗GAPDH （Cell Signaling Technology公司，美國）；抗扭曲家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1（twist family bHLHtranscription factor 1，TWISTl）、抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、抗N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、抗波形蛋白（Vimentin）、辣根過氧化物酶二抗（Ab-cam公司，英國）；CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；流式細(xì)胞術(shù)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；TransweU小室（Conung公司，美國）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SACC細(xì)胞培養(yǎng)

將SACC-LM和SACC-83細(xì)胞置于含10％胎牛血清和1％青-鏈霉素的4mL RPMI-1640培養(yǎng)基中，并于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)80％-90％后，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入2 mL胰酶消化3min后，加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min離心5min后，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液，最后以1：3比例傳代。

1.2.2RhoC在SACC中的表達(dá)測(cè)定

向分別盛放有6例SACC標(biāo)本和正常唾液腺組織的研缽中加入液氮并反復(fù)研磨直至均勻，粉末置于1.5 mL無菌EP管并于-80℃下保存，提取總蛋白后采用Western blot檢測(cè)RhoC在SACC標(biāo)本和正常唾液腺組織中的表達(dá)。采用一步法配膠，上樣量每孔5 uL，Marker 2.5 uL。120V電泳時(shí)間1h，400 mA轉(zhuǎn)膜時(shí)間30 min，TBST洗膜3次后5％脫脂牛奶封閉。加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫?fù)u床孵育1h。TBST洗膜3次后顯影，拍照并分析灰度值。以GADPH為內(nèi)參，RhoC抗體配制濃度為1：1 000，GAPDH抗體配制濃度為1：5 000。將免疫組化所需的SACC標(biāo)本和正常唾液腺組織各21例蠟塊于實(shí)驗(yàn)前一日進(jìn)行切片、烘片。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日脫蠟后采用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）修復(fù)液修復(fù)，過氧化物阻斷劑阻斷10 min，PBS清洗，5％山羊血清封閉15-20 min，加入RhoC-抗（配制濃度1： 400）于37℃恒溫箱處理1h，PBS清洗3次后加入PV-6000二抗避光處理20 min，加入DAB顯色液，蘇木素染色細(xì)胞核，脫水并封片。顯微鏡下統(tǒng)計(jì)著色率和著色強(qiáng)度，RhoC以細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕褐色為陽性表達(dá)。統(tǒng)計(jì)著色率時(shí)，0-5％記0分，6％-25％記1分，26％-50％記2分，51％-75％記3分，76％-100％記4分。統(tǒng)計(jì)著色強(qiáng)度時(shí)，不著色記0分，淡黃色記1分，黃色記2分，棕褐色記3分。將著色率與著色深度得分相加，總和0-1分記為陰性（-），2-3分記為弱陽性（+），4-5分記為陽性（++），6-7分記為強(qiáng)陽性（+++）。其中弱陽性、陽性和強(qiáng)陽性均視為陽性。

1.2.3轉(zhuǎn)染siRNA及效率測(cè)定

根據(jù)RhoC基因序列設(shè)計(jì)3條siRNA和1條陰性對(duì)照（表1）。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前24 h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且適量傳代的SACC細(xì)胞以密度為2x10個(gè)／孔接種于6孔板。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60％～80％時(shí)開始轉(zhuǎn)染。取1.5 mL無菌EP管2支，分別加入200 uL RPMI-1640無血清培養(yǎng)基，再分別加入GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑和RNA oligo各7.5 uL，靜置5 min后，將GP-trans-fect-Mate培養(yǎng)基混合物滴加至RNA oligo培養(yǎng)基混合物中，再次靜置15-20 nun后，立刻轉(zhuǎn)染。6孔板每孔采用PBS沖洗后，加入上述轉(zhuǎn)染試劑混合物與1 585 uL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，至反應(yīng)終體系為2 000LiL，RNA oligo終濃度為75 nmol·L-1。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，RT-qPCR測(cè)RhoC的表達(dá)水平。使用SteadyPure通用型RNA提取試劑盒于各組細(xì)胞中提取總RNA，去除基因組DNA并以紫外分光光度儀檢測(cè)RNA純度及濃度后，采用EvOM-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄，各組均取2 u互補(bǔ)DNA為模板，SYBR GreenPro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒處理后行擴(kuò)增。每組設(shè)置3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參。RhoC上游引物序列為5’-AAGTTCCCTTTGCCCGTCTG-3’，下游引物序列為5’-ACAGTGGCAACTCAAGGGTC-3’；GAPDH上游引物序列為5’-TGAAATGTGCA-CGCACCAAG-3’，下游引物序列為5’-GGGAAG-CAGCATTCAGGTCT-3’。PCR程序設(shè)置：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2-△△a法比較轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中RhoC mRNA的表達(dá)差異。選擇沉默效率最高的組別作為實(shí)驗(yàn)組（siRNA-RhoC），同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC基因和只加入轉(zhuǎn)染試劑，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4Westemblot檢測(cè)RhoC下游信號(hào)通路及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

各組細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液處理后提取總蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度后測(cè)定RhoC下游RO-CKl/p38MAPK/TWISTl信號(hào)通路及EMT相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，方法同1.2.2。ROCKl、p38MA-PK、p-p38MAPK、TWISTl、E-cadherin、N-cad-herin、Vimentin抗體配制濃度為1：1 000；GAPDH為1：5 000。

1.2.5CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

沉默目的基因24h后，以1.5×10個(gè)/孔細(xì)胞密度將SACC-LM和SACC-83接種于96孔板，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組僅加入培養(yǎng)液消除其對(duì)光密度（optical density，OD）值的影響。在避光環(huán)境下以10％CCK-8染色劑和90％RPMI-1640培養(yǎng)基配制反應(yīng)液。在接種0、24、48、72 h后分別加人上述孔板并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。通過酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm的OD值，每組設(shè)5個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

沉默目的基因24 h后，加入胰酶消化，PBS沖洗后重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為5X10個(gè)/mL。取1 mL細(xì)胞懸液，300 g離心5min，棄上清，加入500 uL稀釋的Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞。細(xì)胞懸液中加入5 uL Annexin V-FITC Reagent和5 uL PI Reagent（50 ug/mL）。渦旋混勻后，室溫避光孵育15～20 min，立即上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將基質(zhì)膠置于4℃冰箱中過夜解凍并與預(yù)冷的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1：8比例配制。取60 uL基質(zhì)膠垂直均勻加入上室，避免產(chǎn)生氣泡和貼壁，培養(yǎng)箱中孵育3h后聚合成膜，棄上室余液。上下室每孔加入500 uL RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，培養(yǎng)2h使膜水化。轉(zhuǎn)染后24 h取各組細(xì)胞，以RPMI-1640無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2.5x10個(gè)/mL，下室加入600 uL含20％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，上室加入200 uL上述細(xì)胞懸液并培養(yǎng)48h。棄上下室液體，PBS沖洗，4％多聚甲醛固定15 min，0.1％結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗，棉棒輕擦上室。隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域顯微鏡下拍照，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

沉默目的基因24h后，將SACC-LM及SACC-83細(xì)胞以5x10個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)80％～90％時(shí)，用同一支1 000 uL移液槍頭垂直孔板底部按直線劃痕。PBS沖凈劃下細(xì)胞，每孔加入2 mL RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以消除細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。而后分別于培養(yǎng)后0、24、48h在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞遷移情況，每組取上、中、下3個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量并記錄各組細(xì)胞的相對(duì)愈合率。計(jì)算公式：相對(duì)愈合率=（Oh劃痕寬度-24h或48 h劃痕寬度）／0 h劃痕寬度。

1.2.9生物信息學(xué)預(yù)測(cè)SACC中RhoC的上游mi-RNA

從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中GEO（Gene Expression Omnibus）（https：//www.ncbi.nlmnih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫下載包含SACC患者miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的GSE59700和GSE117275數(shù)據(jù)集。使用RNA相互作用數(shù)據(jù)庫（Encyclopedia ofRNAinteractomes，ENCORI，Starbase） （https：//rnasysu.com/encori/），miRNA靶向預(yù)測(cè)綜合分析網(wǎng)站（miRmap） （https：//mirmap.ezlab.org）查詢與RhoC可能存在靶向關(guān)系的miRNA，與上述數(shù)據(jù)庫取交集并繪制韋恩（Venn）圖。選擇差異明顯（llogFCIgt;1，Plt;0.05）且miRmap score較高者繪制火山圖。使用ENCORI預(yù)測(cè)RhoC與上游miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.10雙熒光索酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證RhoC與上游miRNA的結(jié)合位點(diǎn)

針對(duì)ENCORI預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)報(bào)告基因質(zhì)粒。將293T細(xì)胞以1X10個(gè)/孔接種于24孔板，每組設(shè)置3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)分4組：1）RhoC野生型報(bào)告基因質(zhì)粒+m1R-138-5p mimic；2）RhoC野生型報(bào)告基因質(zhì)粒+miR-138-5p mimic對(duì)照；3）RhoC突變型報(bào)告基因質(zhì)粒+miR-138-5pmimlc；4）RhoC突變型報(bào)告基因質(zhì)粒+miR-138-5p mimic對(duì)照。各組細(xì)胞分別于無血清RPMI-1640中共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6h后更換完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，棄液，PBS沖洗。每孔加入100 uL Passive Lysis Buffer裂解液處理15 min。裂解液收集至1.5 mLEP管中，12 000 r-min-l離心1 min，上清液收集至新EP管中。不透光96孔板中加入100 uL LARⅡ，再加入20 uL裂解上清液，混勻后測(cè)量Firefly luciferase值為報(bào)告基因發(fā)光值。加入100 uL Stop＆Glo Reagent，混勻后測(cè)定記錄Renilla luciferase值為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 18.0及GraphPad Prism 8.0分析各組結(jié)果。K-S檢驗(yàn)（Kolmogorov-Smirnov test）對(duì)正態(tài)性進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)使用萊文檢驗(yàn)（Levene test）檢驗(yàn)方差齊性。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間比較；方差齊者選擇LSD-t檢驗(yàn)行進(jìn)一步的兩兩比較，方差不齊者則選用Games-Howell法。符合偏態(tài)分布者用M（P25，P75）表示，選擇Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較，進(jìn)一步比較選擇用Bonferroni校正的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1RhoC在SACC中的表達(dá)

Westem blot結(jié)果顯示：RhoC在6例SACC中的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于6例正常唾液腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖1）。免疫組化結(jié)果顯示：RhoC主要表達(dá)在細(xì)胞漿，在SACC中的陽性表達(dá)率為66.67％ （14/21），顯著高于正常唾液腺組織的28.57％ （6/21），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖2）。由此說明，RhoC在SACC中過表達(dá)。

2.2siRNA的轉(zhuǎn)染效率

qRT-PCR結(jié)果顯示：在SACC-LM與SACC-83兩種細(xì)胞系中，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后siRNA-RhoC 1#組、siRNA-RhoC 2#組和siRNA-RhoC 3#組RhoC mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖3）。同時(shí)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖3），由此說明轉(zhuǎn)染成功。其中siR-NA-RhoC 3#組轉(zhuǎn)染效率最高，選擇為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3RhoC下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

Westem blot結(jié)果顯示：在SACC-LM與SACC，83兩種細(xì)胞系中，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后RhoC、ROCK1、p-p38MAPK、TWIS-Tl的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖4）；p38MAPK的蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖4）。同時(shí)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖4）。由此說明，沉默RhoC可能抑制其下游ROCKl/p38MAPIOTWISTI信號(hào)通路而對(duì)SACC惡性行為產(chǎn)生影響。

2.4EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

Westem blot結(jié)果顯示：在SACC-LM與SACC83兩種細(xì)胞系中，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后N-cadherin、Vimentin的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降，E-cadherin的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05，圖5）。同時(shí)空白對(duì)照維和陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖5）。由此說明，沉默RhoC可顯著抑制SACC的EMT水平。

2.5沉默RhoC對(duì)SACC增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在SACC-LM和SACC-83中，接種Oh后，實(shí)驗(yàn)組的OD值與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的OD值相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；接種24、48、72 h后，實(shí)驗(yàn)組的OD值均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，表2）。同時(shí)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，表2）。由此說明，沉默RhoC可顯著抑制SACC的增殖能力。

2.6沉默RhoC對(duì)SACC凋亡的影響

Annexin FITC/PI染色結(jié)果顯示：在SACCLM中，轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率（11.30％±0.87％）顯著高于空白對(duì)照組（4.40％±0.21％）和陰性對(duì)照組（5.22％±0.82％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖6）；在SACC-83中，轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率（11.45％±0.78％）顯著高于空白對(duì)照組（5.25％±1.01％）和陰性對(duì)照組（5.43％±0.88％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖6）。同時(shí)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖6）。由此說明，沉默RhoC可顯著促進(jìn)SACC的凋亡。

2.7沉默RhoC對(duì)SACC侵襲的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在SACC-LM中，轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞數(shù)量（348.73±39.00）顯著低于空白對(duì)照組（797.07±36.58）和陰性對(duì)照組（766.67±49.89），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖7）；在SACC-83中，轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞數(shù)量（266.60±43.32）顯著低于空白對(duì)照組（512.20±45.37）和陰性對(duì)照組（524.40±38.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖7）。同時(shí)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖7）。由此說明，沉默RhoC可顯著抑制SACC的侵襲能力。

2.8沉默RhoC對(duì)SACC遷移的影響

傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在SACC-LM中，處理后24 h實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)愈合率（19.38％±7.15％），顯著低于空白對(duì)照組（39.55％±3.75％）和陰性對(duì)照組（43.08％±3.42％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖8）；處理后48 h實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)愈合率（40.82％±5.14％）顯著低于空白對(duì)照組（77.06％±2.46％）和陰性對(duì)照組（77.05％±2.82％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖8）。在SACC-83中，處理后24 h實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)愈合率（25.65％±1.99％）顯著低于空白對(duì)照組（34.82％±3.57％）和陰性對(duì)照組（36.28％±3.03％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖8）；處理后48 h實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)愈合率（49.69％±4.27％）顯著低予空白對(duì)照維（74.51％±2.89％）和陰性對(duì)照組（72.00％±2.44％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖8）。同時(shí)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，圖8）。由此說明，沉默RhoC可顯著抑制SACC的遷移能力。

2.9RhoC與上游靶點(diǎn)miR-138-5p存在結(jié)合位點(diǎn)

ENCORI、miRmap、GSE59700和GSE117275數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，miR-17、miR-31、miR-93、miR-138-5p、miR-9、miR-150、miR-106b、miR-331、miR-486和miR-455共10種miRNA可能與RhoC存在結(jié)合位點(diǎn)（圖9）。其中miR-138-5p的可能性最強(qiáng)（miRmap score=88.51），且在SACC中表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（logFC=-2.41，Plt;0.05，圖10）。ENCORI分析顯示RhoC與miR-138-5p可能存在結(jié)合位點(diǎn)（圖11）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：miR-138-5p mimic可以顯著下調(diào)轉(zhuǎn)染RhoC野生型質(zhì)粒的293T細(xì)胞的熒光素酶活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），而對(duì)轉(zhuǎn)染RhoC突變型質(zhì)粒的293T細(xì)胞的熒光素酶活性沒有影響（Pgt;b0.05），且miR-138-5p mimic對(duì)照對(duì)轉(zhuǎn)染RhoC野生型及突變型質(zhì)粒的293T細(xì)胞的熒光素酶活性均無影響（Pgt;0.05）。由此說明，miR-138-5p可靶向結(jié)合RhoC，可能成為后者的調(diào)控靶點(diǎn)（圖12）。

3討論

SACC是一種兼具嗜神經(jīng)生長(zhǎng)、極易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的唾液腺上皮腫瘤，手術(shù)、放化療等療法對(duì)治療其效果不佳，且國際上關(guān)于復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性SACC尚無獲批的靶向藥物，上述多種原因?qū)е耂ACC死亡率高、預(yù)后較差。因此，研究SACC的病因及其分子機(jī)制，積極探索高特異性治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高其臨床診療水平具有關(guān)鍵意義。

Rho家族屬于RAS超家族，該家族成員由20個(gè)小信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白組成，與癌癥的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。Rho家族蛋白具有結(jié)合GDP和GTP的特性，定位于細(xì)胞膜時(shí)可被鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEF）激活為GTP結(jié)合態(tài)，隨后充當(dāng)“分子開關(guān)”激活下游效應(yīng)蛋白如p21活化激酶（p21-activated kinases，PAK）和ROCK，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和外滲，進(jìn)而調(diào)控惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。作為Rho家族中最常見的一種異構(gòu)體，RhoC已被證實(shí)在胰腺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中過表達(dá)，并促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展州。而在本研究中，RhoC在SA-cc中同樣高表達(dá)，提示該基因可能促進(jìn)SACC的惡性生物學(xué)行為。

ROCK1是一種屬于AGC超家族的絲氨酸，蘇氨酸蛋白激酶，也是作用于Rho家族蛋白下游的關(guān)鍵因子，在多種癌癥中表達(dá)顯著升高。該蛋白可通過Rho蛋白依賴性的方式被激活，誘導(dǎo)下游信號(hào)如肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）和磷脂酰肌醇受體磷酸化，刺激Ca2+內(nèi)流，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移；而抑制該蛋白可降低肌動(dòng)蛋白收縮性和調(diào)節(jié)其細(xì)胞骨架，使細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)而不規(guī)則的扁平態(tài)，這種變化會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的集落形成并誘導(dǎo)其凋亡。本研究中，沉默RhoC后ROCK1的表達(dá)顯著下降，同時(shí)細(xì)胞增殖、遷移能力下降，凋亡率上升。說明沉默RhoC可能通過抑制ROCK1的Rho依賴性激活，繼而對(duì)SACC的惡性行為起負(fù)向調(diào)控作用。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶（Mito-gen-activated protein kinases，MAPK）家族，與多種癌癥密切相關(guān)。該蛋白能將細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)相聯(lián)系，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化等多種生物過程。p38MAPK的激活由激酶級(jí)聯(lián)介導(dǎo)，即MAP3K激活MAPK2K，后者又激活p38，MAPK，p38MAPK上具有能結(jié)合特定底物的激活基序，能與多種底物如脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2（Li-poca-lin 2，LCN2）上的特異性對(duì)接結(jié)構(gòu)域結(jié)合，影響癌細(xì)胞的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種惡性行為。有研究表明，Rho家族蛋白中細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，Cdc42）可與絲裂原活化蛋白激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase klnase 1，MEKl）結(jié)合，MEK1可作為MAP3K的上游激活物達(dá)到激活p38MAPK的目的。在本研究中，沉默RhoC后ROCK1與p38MAPK的表達(dá)同時(shí)下降，提示RhoC的低表達(dá)可能抑制ROCK-1級(jí)聯(lián)介導(dǎo)的p38MAPK激活，繼而起到抑制SA-cc的作用。

TWIST1是堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，該家族蛋白擁有一段堿性氨基酸的E-box結(jié)合域，在上皮細(xì)胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，通過體內(nèi)外研究證明敲除TWIST1可顯著抑制乳腺癌的惡性行為。在腫瘤形成過程中，凋亡主要由ARF/p53信號(hào)通路觸發(fā)，而TWIST1不僅與p53啟動(dòng)子的有效反式激活劑HOXA5發(fā)生相互作用并抑制其活性，還能抑制ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factors，ARF）的表達(dá)及穩(wěn)定性從而阻止其翻譯后修飾，繼而抑制細(xì)胞凋亡㈣。EMT是指極化、不易運(yùn)動(dòng)的上皮細(xì)胞經(jīng)一系列復(fù)雜生化過程，如細(xì)胞骨架重組，轉(zhuǎn)變?yōu)榉菢O化、易運(yùn)動(dòng)的間充質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)獲得高侵襲性和抗凋亡能力的過程。TWIST1已被證實(shí)可誘導(dǎo)E-cad-herin下調(diào)，并增加間質(zhì)標(biāo)記物如Vimentin和N-cadherin的表達(dá)，其主要機(jī)制是通過與E-cad-herin啟動(dòng)子中的多個(gè)E-box結(jié)合域結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄。本研究中，沉默RhoC后p-p38-MAPK、TWIST1、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)均下降，E-cadhenn的表達(dá)顯著上升，同時(shí)SACC侵襲能力減弱，凋亡率上升。由此推測(cè)，沉默R-hoC可能會(huì)阻止p38MAPK與底物TWIST1上特異性對(duì)接結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，減弱后者對(duì)ARF/p53等下游通路的抑制作用以及與EMT相關(guān)蛋白上E-box結(jié)合域的結(jié)合能力，最終促進(jìn)SACC的凋亡，抑制其侵襲和EMT。

近年來，隨著競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA假說的提出和大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，學(xué)者們愈發(fā)重視IncRNA-miRNA-mRNA三者互作在癌癥中的重要調(diào)控作用，該理論認(rèn)為miRNA可以與多個(gè)靶基因的mRNA上3'UTR區(qū)域結(jié)合并將其沉默，抑制單個(gè)miRNA可能導(dǎo)致多個(gè)致癌基因的表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)揮顯著的抗癌作用。由于SACC的罕見性，國內(nèi)對(duì)其miRNA-mRNA互作的研究甚少。本研究在觀察RhoC及其下游信號(hào)對(duì)SACC的影響之外，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了RhoC的上游miRNA，以期為SACC的分子靶向治療提供新思路。

綜上所述，本研究利用siRNA沉默SACC-LM和SACC-83中的RhoC基因，觀察到其下游信號(hào)通路ROCKl/p38MAPK/TWISTl及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著降低，SACC的惡性生物學(xué)行為顯著減弱。由此推測(cè)，沉默RhoC后ROCK1的Rho依賴性激活減少，使得下游p38MAPK的激酶級(jí)聯(lián)激活受到抑制，p38MAPK無法與TWIST1的特異性對(duì)接結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致后者與細(xì)胞凋亡及EMT相關(guān)蛋白上E-box結(jié)合域的結(jié)合減弱，最終起到抑制SACC增殖、侵襲、遷移和EMT的作用。本研究在分析RhoC下游信號(hào)的同時(shí)預(yù)測(cè)其上游信號(hào)，為其成為SACC靶向治療的重要位點(diǎn)提供了依據(jù)，而有關(guān)RhoC在SACC中的具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。