突觸后支架蛋白Preso 在顱腦沖擊傷誘導(dǎo)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙中的作用機(jī)制

摘要： 將36 只雄性C57 小鼠隨機(jī)分為對照組（ Sham 組） 、3.5 MPa 顱腦沖擊傷（ blast-related traumatic brain injury，bTBI）組、4.5 MPa bTBI 組、5.5 MPa bTBI 組、4.5 MPa bTBI+生理鹽水組（bTBI+SA 組）、4.5 MPa bTBI+小分子多肽組（bTBI+TAT-FERM 組） ，每組6 只；將12 只 Preso -/-小鼠隨機(jī)分為Sham 組和 4.5 MPa bTBI 組，每組6 只。對小鼠進(jìn)行bTBI 造模，完成后常規(guī)飼養(yǎng)2 周，4.5 MPa bTBI+生理鹽水組和4.5 MPa bTBI+TAT-FERM 組在bTBI 造模后每天通過尾靜脈給藥1 次，連續(xù)給藥5 d。與對照組相比， 3.5 MPa bTBI 組小鼠焦慮抑郁行為改變不顯著； 4.5 MPa bTBI 和5.5 MPa bTBI 組小鼠出現(xiàn)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（ posttraumatic stress disorder， PTSD）樣癥狀。與對照組相比， 4.5 MPa bTBI 組Preso/mGluR1 復(fù)合體形成增加，使用TAT-FERM 可阻斷Preso 與mGluR1 的相互作用，可在不改變Preso/mGluR1 復(fù)合體組成分子蛋白表達(dá)的情況下抑制Preso/mGluR1 復(fù)合體形成，并且改善bTBI 所導(dǎo)致的PTSD 癥狀。bTBI 促進(jìn)Preso/mGluR1 復(fù)合體形成是bTBI 誘致PTSD 癥狀的重要分子病理機(jī)制，通過阻斷Preso 與mGluR1 相互作用可減輕bTBI 對PTSD 的影響，進(jìn)而為治療bTBI 相關(guān)的PTSD 提供了潛在靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞： 顱腦沖擊傷；創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；突觸后支架蛋白；代謝性谷氨酸受體；小分子多肽

中圖分類號： O383 國標(biāo)學(xué)科代碼： 13035 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

顱腦損傷（traumatic brain injury， TBI）是現(xiàn)代戰(zhàn)爭中最主要的創(chuàng)傷類型，其中炸藥、炮彈等爆炸所產(chǎn)生的沖擊波是引起顱腦損傷的重要原因[1]。美軍有關(guān)退伍軍人的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，顱腦沖擊傷（blast-related traumatic brain injury， bTBI）的發(fā)生率接近10%，且有15% 的 bTBI 傷員會在退伍后產(chǎn)生一系列創(chuàng)傷后的心理應(yīng)激反應(yīng)，以創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder， PTSD）最典型[2-3]。PTSD 是一種在重大創(chuàng)傷事件后出現(xiàn)的嚴(yán)重精神疾病，表現(xiàn)出對創(chuàng)傷記憶的過度反應(yīng)、恐懼消退受損等臨床特征，對家庭和社會造成極大的負(fù)擔(dān)。目前，對于bTBI 與PTSD 之間產(chǎn)生相關(guān)性的具體機(jī)制仍不清楚，導(dǎo)致缺少有效的診斷標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)。

大量的研究表明，TBI 導(dǎo)致的神經(jīng)元興奮性毒性損傷是引起繼發(fā)性腦損害的重要機(jī)制之一，與突觸后谷氨酸能受體功能異常密切相關(guān)[4]。Preso（也稱Preso1）是近期發(fā)現(xiàn)的一種突觸后支架蛋白分子，可通過其FERM 結(jié)構(gòu)域與代謝性谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor， mGluR）形成突觸后蛋白復(fù)合體，在神經(jīng)元突觸可塑性的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[5]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，TBI 后Preso 促進(jìn)mGluR1介導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性毒性損傷，其具體機(jī)制與Preso/mGluR1 復(fù)合體的形成有關(guān)[6]。但是，Preso/mGluR1復(fù)合體在bTBI 誘導(dǎo)PTSD 樣焦慮抑郁行為中的作用尚不明確。因此，本研究在構(gòu)建小鼠bTBI 模型的基礎(chǔ)上，探討Preso/mGluR1 復(fù)合體在bTBI 相關(guān)PTSD 中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)采用約8 周齡的雄性C57 小鼠和Preso 基因敲除（Preso-/-）小鼠，分別由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心和上海南方模式生物科技公司提供。小鼠飼養(yǎng)在20～25 ℃ 的環(huán)境中，明暗交替時間為12 h∶12 h，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食與飲水。將36 只C57 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對照組（Sham 組）、3.5 MPabTBI 組、4.5 MPa bTBI 組、5.5 MPa bTBI 組、4.5 MPa bTBI+生理鹽水組（bTBI+SA 組）和4.5 MPabTBI+小分子多肽組（bTBI+TAT-FERM 組），每組各6 只；將12 只Preso-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為Sham 組和4.5 MPa bTBI 組，每組各6 只。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，許可證號為20210419。

1.2 方法

1.2.1 沖擊波模型的建立

本實(shí)驗(yàn)采用BST-Ⅰ型生物激波管（陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院）模擬bTBI。每組6 只小鼠麻醉后放于生物激波管末端動物固定架上，距離激波管末端擋板10 cm 處，且均位于同一垂直平面上，右側(cè)頭部朝向沖擊波來源方向，同時通過激波管爆炸沖擊波（驅(qū)動段壓力分別為3.5、4.5 或5.5 MPa）造成單次bTBI。

1.2.2 藥物干預(yù)

實(shí)驗(yàn)所使用的小分子干擾多肽TAT-FERM 由南京金斯瑞公司合成，通過小鼠尾靜脈注射的方式將TAT-FERM 以3 nmol/g（小鼠體重）/天10 μg/g 的劑量給藥，4.5 MPa bTBI 造模后連續(xù)給藥5 d。

1.2.3 曠場實(shí)驗(yàn)

每個曠場試驗(yàn)箱的尺寸為40 cm × 40 cm × 35 cm，測試前首先將曠場反應(yīng)箱底部、放置物以及側(cè)壁用75% 酒精清理消毒，防止之前小鼠所殘留的氣味、大小便等影響測試準(zhǔn)確性；將小鼠從飼養(yǎng)籠里取出，背向?qū)嶒?yàn)者放在曠場的中央?yún)^(qū)域，拉上簾子后實(shí)驗(yàn)者迅速離開，任由小鼠在曠場反應(yīng)箱中自由活動；測試結(jié)束后要用75% 酒精清理消毒整個曠場箱體，等待晾干后更換小鼠繼續(xù)重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)（在測試下一只小鼠前需將酒精完全揮發(fā)）。利用Smart 3.0 視頻分析軟件進(jìn)一步分析小鼠在15 min 內(nèi)在中心位置的次數(shù)和運(yùn)動距離百分比。如果小鼠更傾向于在曠場試驗(yàn)箱中間運(yùn)動，被認(rèn)為是抗焦慮行為，反之則是焦慮行為。

1.2.4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

高架十字迷宮裝置通常由兩段開臂和兩段閉臂構(gòu)成，距離地面高度51 cm，各臂長66 cm，寬5 cm，閉臂臂高15 cm，測試前要用75% 酒精清理確保整個高架十字迷宮裝置的清潔，盡可能創(chuàng)造一個干凈、無味道的理想試驗(yàn)環(huán)境；將小鼠從飼養(yǎng)籠里取出，背向?qū)嶒?yàn)者將小鼠輕輕放在高架十字迷宮裝置的中央?yún)^(qū)域，并使其面向開臂，拉上簾子后迅速安靜的離開；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將其取出放回飼養(yǎng)籠，做好實(shí)驗(yàn)完成動物的標(biāo)記信息，用75% 酒精和紙巾清潔迷宮，等待晾干后更換小鼠繼續(xù)重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。用Smart 3.0 視頻軟件進(jìn)一步分析，記錄小鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)（open arm entry， OE， noe）和進(jìn)入開臂的時間（arm openingtime， OT， tot），進(jìn)入閉臂的次數(shù)（closed arm entry， CE， nce）和進(jìn)入閉臂的時間（arm closing time， CT， tct），計算小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)的百分比γnoe =（noe/noe +nce）×100%以及進(jìn)入開臂時間的百分比γtot =（tot／tot +tct）×100%。

1.2.5 免疫印記雜交（Western blot）

bTBI 造模后第17 d 每組取3 只小鼠進(jìn)行免疫印記雜交實(shí)驗(yàn)。提取蛋白時，在新鮮的小鼠皮層腦組織樣品中加入RIPA 裂解液并勻漿，離心后取上清，制備好的蛋白樣品于?80 ℃ 保存。使用BCA 法測定蛋白樣品濃度，在10% 的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，5% 脫脂牛奶封閉2 h。一抗Preso（1∶1 000，Abclonal）、mGluR1（1∶800，Abcam）、β-actin（1∶1 000，Proteintech）于4 ℃ 孵育過夜，在常溫下二抗孵育2 h，在發(fā)光儀（ChemiDoc Touch，Bio-Rad）對條帶發(fā)光。

1.2.6 蘇木精-伊紅（Hamp;E） 染色

bTBI 造模后第17 d 每組取3 只小鼠進(jìn)行Hamp;E 染色。將石蠟包埋好的腦組織切成10 μm 薄片，然后放入甲醇中脫脂2 min，再依次浸入95% 乙醇、70% 乙醇和蒸餾水中進(jìn)行脫水處理，每次均為2 min。將脫水后的切片依次浸入hematoxylin 染料、蒸餾水、酸性洗滌劑和eosin 染料中10 min，再次脫水后進(jìn)行透明化處理并封片。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)值以x±s 表示，利用GraphPad Prism 9.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析與作圖。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齊性，則用Turkey 檢驗(yàn)法進(jìn)行兩組間比較，以P＜0.05 表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 bTBI 可誘導(dǎo)小鼠PTSD 樣焦慮抑郁行為

分別使用驅(qū)動段壓力為3.5、4.5 和5.5 MPa 的爆炸沖擊波建立小鼠bTBI 模型，波形曲線（圖1）顯示，小鼠頭部實(shí)際受到的沖擊波超壓峰值分別為225、360 和410 kPa。在造模后第15 d 和第16 d 分別對各組小鼠進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)檢驗(yàn)。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表1），與Sham 組相比，3.5 MPa bTBI 組進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)和中心區(qū)域運(yùn)動距離百分比無明顯差異；4.5 和5.5 MPa bTBI 組進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)和中心區(qū)域運(yùn)動距離百分比均顯著降低（P＜0.05）。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表2），與Sham 組相比，bTBI 各組進(jìn)入開臂次數(shù)百分比（γnoe）和進(jìn)入開臂時間百分比（γnot）均顯著降低（P＜0.05）。在造模后第17 d Hamp;E 染色顯示（圖2），與Sham 組相比，3.5 MPa bTBI 組小鼠未見明顯組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷；4.5 和5.5 MPa 組皮層組織出現(xiàn)部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。以上結(jié)果表明，bTBI 可誘導(dǎo)小鼠PTSD樣焦慮抑郁行為。

2.2 Preso-/-動物bTBI 造模后未見明顯焦慮抑郁樣行為

Zhang 等[6] 前期已建立Preso-/-動物，實(shí)驗(yàn)表明Preso 基因敲除不影響健康成年小鼠的運(yùn)動、焦慮和空間記憶。為了確定Preso 是否與bTBI 誘導(dǎo)的PTSD 樣焦慮抑郁行為有關(guān)，選擇驅(qū)動段壓力為4.5 MPa的爆炸沖擊波建立bTBI 模型，通過曠場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)對Preso-/-小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢驗(yàn)。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，與Sham 組相比，bTBI 組進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)和中心區(qū)域運(yùn)動距離百分比無明顯差異。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，與Sham 組相比，bTBI 組γnoe和γnot無明顯差異。以上結(jié)果表明，Preso 可能是bTBI 誘導(dǎo)PTSD 樣焦慮抑郁狀態(tài)的關(guān)鍵因素。

2.3 Preso/mGluR1 復(fù)合體在bTBI 后的表達(dá)變化

bTBI 損傷后，對C57 小鼠腦組織進(jìn)行Western blot 檢測，結(jié)果顯示bTBI 組中的Preso 和mGluR1 與Sham 組相比表達(dá)無顯著性差異（圖3（a））。進(jìn)一步的免疫共沉淀結(jié)果顯示bTBI 組中Preso 與mGluR1 之間的相互作用顯著增多（P＜0.05，圖3（b））。以上結(jié)果提示，bTBI 并不影響Preso/mGluR1 復(fù)合體中相關(guān)分子的表達(dá)變化，而是會增加Preso 與mGluR1 之間的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)Preso/mGluR1 復(fù)合體的形成。

2.4 TAT-FERM 可阻斷bTBI 后Preso 與mGluR1 之間的相互作用

針對Preso 與mGluR1 之間的相互作用位點(diǎn)設(shè)計小分子干擾多肽TAT-FERM（GRKKRRQRRRPQKTLYNVEEE），阻斷Preso 的FERM 結(jié)構(gòu)與mGluR1 的結(jié)合。Western blot 結(jié)果顯示，bTBI+TAT-FERM 組與bTBI+生理鹽水（SA）組相比，Preso 和mGluR1 的表達(dá)未見明顯改變（圖4（a）），但Preso 與mGluR1 的相互作用顯著減少（P＜0.05，圖4（b）），這表明TAT-FERM 有效阻斷了Preso 與mGluR1 之間的結(jié)合。

2.5 TAT-FERM 減輕bTBI 對小鼠PTSD 樣焦慮抑郁狀態(tài)的影響

建立C57 小鼠bTBI 模型后連續(xù)5 d 給其尾靜脈注射小分子多肽TAT-FERM 和生理鹽水（SA），隨后通過曠場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行行為學(xué)檢驗(yàn)。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表5）顯示，與SA 組相比，TAT-FERM 組進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)無明顯差異，但中心區(qū)域運(yùn)動距離百分比顯著升高（P＜0.05）。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表6）顯示，與SA 組相比，TAT-FERM 組的γnoe和γnot均顯著升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，bTBI 造模能誘致小鼠PTSD 樣焦慮抑郁狀態(tài)。

3 討 論

既往的研究發(fā)現(xiàn)，TBI 不但會引起急性神經(jīng)系統(tǒng)損傷，其致傷效應(yīng)還會不斷累積，進(jìn)而導(dǎo)致遠(yuǎn)期神經(jīng)功能障礙，以認(rèn)知障礙、情緒改變和創(chuàng)傷后應(yīng)激等為典型癥狀[7]。bTBI 作為一種較特殊的TBI 類型，多見于經(jīng)歷戰(zhàn)場環(huán)境的軍事作業(yè)人員，主要以輕型顱腦損傷為主[8]。雖然這種沖擊波引起的損傷效應(yīng)并未導(dǎo)致明顯的腦組織結(jié)構(gòu)性損害，但通過對退伍軍人的流行病學(xué)調(diào)查研究表明， bTBI 會顯著提高PTSD 的發(fā)生率[9]。

本研究通過小鼠動物模型模擬了不同致傷強(qiáng)度沖擊波的腦損傷效應(yīng)，結(jié)果顯示，3.5 MPa 沖擊波所造成的腦損傷程度較輕，小鼠焦慮抑郁行為改變不顯著；經(jīng)歷過4.5 和5.5 MPa bTBI 的實(shí)驗(yàn)動物PTSD 樣改變更顯著，且與之對應(yīng)的腦組織HE 染色結(jié)果表明存在部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。然而，bTBI 誘致PTSD 的生物學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性毒性損傷是TBI 后繼發(fā)性腦損害形成的重要機(jī)制，其中谷氨酸受體異常激活是其中關(guān)鍵的分子病理改變。mGluR1 是重要的谷氨酸受體亞型，在之前的研究中顯示其異常激活在TBI 后可加重神經(jīng)元損傷[10]。此外，mGluR1 相關(guān)抑制劑可以在精神和心理疾病的治療中發(fā)揮潛在治療作用[11]。但是，一系列臨床研究表明，直接將mGluR1 作為干預(yù)靶點(diǎn)進(jìn)行治療，并未在TBI 后PTSD 患者中發(fā)揮預(yù)期的效果，同時還帶來了許多副作用[12]。由此可見，深入探索mGluR1 在TBI 中的作用機(jī)理，對于尋找新的干預(yù)措施具有重要意義。

作為一種多結(jié)構(gòu)域的突觸后支架蛋白， Preso 含有1 個FERM 結(jié)構(gòu)域、1 個WW 結(jié)構(gòu)域和2 個PDZ 結(jié)構(gòu)域，其中FERM 結(jié)構(gòu)域可與mGluR1 之間發(fā)生相互作用[5， 13]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，bTBI 造模未引起Preso-/-動物明顯的焦慮抑郁樣行為，而bTBI 造模對C57 小鼠Preso 和mGluR1 的表達(dá)也無顯著影響，但引起Preso 與mGluR1 之間的相互作用增強(qiáng)，從而促進(jìn)Preso/mGluR1 復(fù)合體形成。Zhang 等[6] 的研究提示，調(diào)控Preso 與mGluR1 之間的相互作用能夠阻斷TBI 引起的急性神經(jīng)元損傷。由此推測，bTBI 促進(jìn)Preso/mGluR1 復(fù)合體形成極有可能是其誘致PTSD 癥狀的重要機(jī)制。

通過藥理學(xué)手段干預(yù)復(fù)合體形成，是探索突觸后蛋白復(fù)合體作用機(jī)制和發(fā)現(xiàn)干預(yù)靶點(diǎn)的重要方式。為了進(jìn)一步明確Preso/mGluR1 復(fù)合體的作用，本研究針對Preso 與mGluR1 發(fā)生相互作用的FERM 結(jié)構(gòu)域合成了小分子干擾多肽TAT-FERM。研究結(jié)果顯示，TAT-FERM 可以阻斷bTBI 后Preso 與mGluR1之間的相互作用，減少Preso/mGluR1 復(fù)合體形成。進(jìn)一步的干預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，TAT-FERM 可以顯著改善bTBI 引起的PTSD 癥狀。這些結(jié)果不但證實(shí)了Preso/mGluR1 復(fù)合體在bTBI 相關(guān)PTSD 中的關(guān)鍵作用，同時也為開發(fā)潛在的藥物治療靶點(diǎn)提供了新的突破點(diǎn)。

4 結(jié) 論

顱腦沖擊傷（bTBI）可通過促進(jìn)突觸后蛋白復(fù)合體Preso/mGluR1 形成，誘導(dǎo)bTBI 相關(guān)PTSD 樣行為學(xué)改變，而小分子多肽TAT-FERM 阻斷Preso/mGluR1 復(fù)合體形成可改善bTBI 誘導(dǎo)的PTSD 癥狀。

感謝陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院張安強(qiáng)副教授團(tuán)隊和清華大學(xué)莊茁教授團(tuán)隊對實(shí)驗(yàn)的支持和幫助。

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（責(zé)任編輯 張凌云）

基金項目： 國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2020-JCJQ-ZD-254-04）；國家自然科學(xué)基金（82171321）