鵝掌楸LcPIN1a基因的克隆及其對植株生長發(fā)育的影響

摘要：【目的】PIN-FORMED（PIN）屬于生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠介導(dǎo)生長素的極性運(yùn)輸，在植物的生長和發(fā)育過程中扮演著關(guān)鍵角色。本研究旨在解析鵝掌楸PIN1基因?qū)χ参锷L和發(fā)育的影響。【方法】通過蛋白序列同源比對、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建以及蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測的方法，鑒定鵝掌楸中PIN1的同源蛋白LcPIN1s。然后，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解析LcPIN1s基因的組織特異性表達(dá)情況，并通過實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）方法研究LcPIN1s在不同苗齡再生植株的根、莖和葉組織中的表達(dá)動態(tài)。此外，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解析LcPIN1s基因在低溫、高溫以及干旱脅迫條件下的時序動態(tài)表達(dá)，并進(jìn)一步利用RT-qPCR方法研究LcPIN1s響應(yīng)干旱脅迫與內(nèi)源ABA合成之間的關(guān)聯(lián)。最后，通過克隆鵝掌楸葉片中高表達(dá)的PIN1同源基因LcPIN1a，構(gòu)建由CaMV35S啟動子驅(qū)動的過表達(dá)載體（35S：LcPIN1a），通過異源轉(zhuǎn)化擬南芥（Arabidopsis thaliana）和同源轉(zhuǎn)化雜種鵝掌楸（Liriodendron × sinoamericanum），篩選并獲得的異源過表達(dá)（LcPIN1a-HO）和同源過表達(dá)（LcPIN1a-OE）陽性再生植株，分別進(jìn)行生長和發(fā)育性狀的測定和分析?！窘Y(jié)果】通過生物信息學(xué)方法在鵝掌楸基因組中成功鑒定到了3個PIN1同源蛋白，分別命名為LcPIN1a、LcPIN1b和LcPIN1c。組織特異性表達(dá)分析顯示，LcPIN1a主要在葉片中高表達(dá)，而LcPIN1b和LcPIN1c主要在莖和根以及成年后的雌蕊中高表達(dá)。另外，鵝掌楸3個PIN1同源基因均受到低溫（4 ℃）和干旱（質(zhì)量分?jǐn)?shù)15% PEG6000）處理的誘導(dǎo)而表現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)模式，但在高溫（40 ℃）脅迫下則會急劇下調(diào)表達(dá)。利用聚乙二醇（PEG）、脫落酸（ABA）以及ABA合成抑制劑氟啶酮（Flu）處理，發(fā)現(xiàn)LcPIN1s在響應(yīng)干旱誘導(dǎo)時表現(xiàn)出不同的模式，即LcPIN1a不依賴于內(nèi)源ABA的合成，而LcPIN1b和LcPIN1c則依賴于內(nèi)源ABA的合成。最后，通過對擬南芥異源過表達(dá)株系（LcPIN1a-HO）再生植株的生長性狀統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，其在根長和株高方面均顯著低于野生型，同時雄蕊數(shù)發(fā)生顯著變異，從野生型的6枚雄蕊變?yōu)橐?枚為主。在雜交鵝掌楸過表達(dá)株系（LcPIN1a-OE）中，其體胚成苗率顯著降低，并且成苗后的再生植株在根長和株高方面均顯著低于野生型，同時根系結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，主根不明顯?！窘Y(jié)論】鵝掌楸PIN1蛋白在植株的營養(yǎng)和生殖生長方面發(fā)揮重要作用，過量表達(dá)不利于植株的正常生長和發(fā)育。

關(guān)鍵詞：鵝掌楸；生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；PIN1基因；生長發(fā)育

中圖分類號：S718;S68"""nbsp;"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

文章編號：1000-2006（2024）06-0051-11

Cloning of the" Liriodendron chinense LcPIN1a genes and its effect on plant growth and development

HAO Zhaodong，MA Xiaoxiao，WANG Dandan，LU Ye，SHI Jisen，CHEN Jinhui*

（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， College of Forestry and Grassland， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China）

Abstract： 【Objective】This study aimed to explore the role of the auxin transporter PIN1 in plant growth and development in Liriodendron chinense.【Method】Three PIN1 homologous proteins were" identified in the Liriodendron genome using bioinformatic methods， and expression pattern analyses of the three LcPIN1s genes were performed in different tissues and response to various abiotic stresses. An overexpression vector driven by the CaMV35S promoter was then constructed and transformed into Arabidopsis and Liriodendron×sinoamericanum， followed by phenotypic determination of growth and developmental traits in the transgenic positive lines.【Result】Three PIN1 homologous proteins were identified in the Liriodendron genome， named LcPIN1a， LcPIN1b" and LcPIN1c. Expression pattern analyses showed that LcPIN1a was mainly expressed in leaves， while LcPIN1b and LcPIN1c were primarily expressed in roots and stems and stigmas when the plantlets transitioned into reproductive growth. In addition， all three LcPIN1 genes transcriptionally responded to drought stress， with LcPIN1b and LcPIN1c showing dependence on the biosynthesis of endogenous ABA， while LcPIN1a does not. Root length and plant height were significantly reduced in LcPIN1a-heterologous overexpression （LcPIN1a-HO） lines compared to wild-type Arabidopsis. The number of stamens was predominantly five in LcPIN1a-HO lines， whereas wild-type Arabidopsis typically contained six stamens. The regeneration of plantlets in LcPIN1a-overexpressing （LcPIN1a-OE） Liriodendron×sinoamericanum" was significantly reduced compared to wild-type plants. In addition， the root length and plant height of LcPIN1a-OE regenerated seedlings were" significantly lower than those of the wild type. The root structure of LcPIN1a-OE plants was significantly changed， with the taproot being less distinct.【Conclusion】The PIN1 proteins of L. chinense play a crucial role in vegetative and reproductive growth. Overexpression of LcPIN1 genes can be detrimental to normal plant growth and development.

Keywords：Liriodendron chinense; auxin transporter; PIN1 gene; growth and development

生長素（auxin）是一類植物激素，在植物生長發(fā)育的各個方面均發(fā)揮重要作用[1]。由生長素參與的生物學(xué)過程主要受到3個層面的調(diào)控，即生長素代謝（包括合成與失活）、運(yùn)輸以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]。其中，生長素的極性運(yùn)輸作用于植物細(xì)胞間生長素濃度梯度的建立，從而調(diào)控生長素的作用[3]。生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括PIN-FORMED（PIN）、ATP 結(jié)合盒B家族（ABCB）以及AUXIN1/LIKE AUXIN1（AUX1/LAX）[4]。其中，PIN蛋白主要作用于細(xì)胞內(nèi)生長素的外排，通過其自身在細(xì)胞內(nèi)的極性定位影響植物組織器官中生長素極大或極小值點(diǎn)的建立，進(jìn)而調(diào)控由生長素介導(dǎo)的植物器官模式建成和向性運(yùn)動[5-7]。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）中存在8個PIN蛋白成員，分別為AtPIN 1—8，其中AtPIN1是第一個被鑒定的生長素外排載體，參與維管組織的發(fā)育和側(cè)生器官的形成[8]。隨后，越來越多的研究顯示擬南芥中PIN家族成員廣泛參與植物生長和發(fā)育的各個方面。比如，AtPIN1和AtPIN7參與胚胎發(fā)生中頂—基軸的建立[9]，AtPIN2和AtPIN3參與根的向重力性響應(yīng)[10-11]，AtPIN4參與根的模式建成[7]，AtPIN5和AtPIN8一起作用于生長素內(nèi)穩(wěn)態(tài)和花粉發(fā)育[12]，AtPIN6介導(dǎo)的生長素轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)作用于側(cè)根和不定根器官發(fā)生[13]。

在所有擬南芥PIN基因中，AtPIN1突變后的表型缺陷最為嚴(yán)重，整個花序莖只有莖，沒有莖生葉和花器官，形態(tài)就像一個大頭針（pin），這也是pin-formed1（pin1）名字的由來[14]。后續(xù)有關(guān)AtPIN1的研究顯示，該基因廣泛參與維管組織發(fā)育[8]、葉脈模式建成[15]、向光和向重力性[16]、早期胚胎發(fā)生[9]等多個生長發(fā)育過程。然而，在除擬南芥以外的大多數(shù)植物中，PIN1基因一般存在多個同源拷貝，相互之間存在功能分化。比如，水稻（Oryza sativa）中存在4個OsPIN1基因（OsPIN1a—1d），其中OsPIN1a/b主要作用于根、莖和花序的發(fā)育，OsPIN1c/d則主要在稻穗形成中發(fā)揮功能[17]。

鵝掌楸屬（Liriodendron）是木蘭科（Magnoliaceae）單屬植物，包含2種，即鵝掌楸（L. chinense）和北美鵝掌楸（L. tulipifera）。鵝掌楸天然分布于東亞地區(qū)[18]，而北美鵝掌楸天然分布于北美東部地區(qū)[19]，二者之間分化1 000萬～1 600萬年[20]，組成了一對東亞-北美東部洲際間隔分布的姊妹樹種。鵝掌楸屬種間雜交可育，且雜交種具有生長快、抗性強(qiáng)、材性優(yōu)等特點(diǎn)，是重要的速生造林和園林景觀樹種[21-22]。Chen等[23]于2019年成功破譯了鵝掌楸全基因組，并在雜交鵝掌楸中建立了經(jīng)由體胚發(fā)生途徑的高效離體再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系[24-25]，為鵝掌楸屬植物重要基因挖掘和基因功能鑒定提供了參考。

有關(guān)鵝掌楸PIN基因鑒定和功能研究還處于起步階段。Hu等[26]基于鵝掌楸基因組鑒定了LcPIN基因家族，發(fā)現(xiàn)該家族包含11個成員，并通過轉(zhuǎn)錄組和熒光實(shí)時定量發(fā)現(xiàn)LcPIN3和LcPIN6a可能作用于雄蕊和花瓣發(fā)育，LcPIN2可能作用于根伸長，以及LcPIN5和LcPIN8可能作用于非生物脅迫響應(yīng)，但缺乏直接證據(jù)。Li等[27]發(fā)現(xiàn)鵝掌楸LcPIN3主要在鵝掌楸根尖中表達(dá)，并通過在擬南芥中異源過表達(dá)發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)根的伸長，并能夠回補(bǔ)atpin1在根長生長和花器官形成方面的缺陷。

作為最早被發(fā)現(xiàn)的PIN家族成員，有關(guān)PIN1在植物生長和發(fā)育中的功能報道最多，其在單雙子葉植物廣泛參與組織器官的發(fā)育和形態(tài)建成，但LcPIN1在鵝掌楸生長發(fā)育中的作用還不清楚。本研究通過對鵝掌楸LcPIN1基因的生物信息學(xué)鑒定、表達(dá)模式分析，以及在擬南芥和鵝掌楸中的過表達(dá)分析，初步揭示其對于植物生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鵝掌楸葉片采自于南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保存于南京林業(yè)大學(xué)下蜀林場（119°13′E，32°7′N）的鵝掌楸廬山種源材料。雜種鵝掌楸（Liriodendron×sinoamericanum）3個月瓶苗和2年生大苗均為同一實(shí)驗(yàn)室分別保存于南京林業(yè)大學(xué)新莊校區(qū)和白馬校區(qū)的材料。擬南芥為同一實(shí)驗(yàn)室保存于南京林業(yè)大學(xué)新莊校區(qū)的哥倫比亞型。

1.2 LcPIN1基因的生物信息學(xué)鑒定

鵝掌楸參考基因組序列從國家基因庫（https：//www.cngb.org）下載，以從TAIR數(shù)據(jù)庫檢索獲得的AtPIN1序列作為提交序列[28]，利用blastP搜索鵝掌楸蛋白庫[29]，篩選參數(shù)E期望值（Evalue）小于0.000 1，一致性大于50%。然后將篩選獲得的序列作為提交序列，利用blastP搜索擬南芥蛋白庫，最佳比對為AtPIN1的蛋白作為鵝掌楸PIN1候選蛋白。

利用同樣的鑒定方法，從Phytozome數(shù)據(jù)庫中鑒定小立碗蘚（Physcomitrium patens）、毛果楊（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）、無油樟（Amborella trichopoda）等物種的PIN1同源蛋白[30]。利用Clustal-omega軟件進(jìn)行多序列比對[31]，然后利用RAxML軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[32]，最后分別使用TBtools和iTOL進(jìn)行多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的可視化[33-34]。另外，利用Protter軟件（http：//wlab.ethz.ch/protter/start/）在線預(yù)測鵝掌楸PIN1同源蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)[35]。

1.3 LcPIN1基因的表達(dá)模式分析

3月齡瓶苗和2年生大苗雜交鵝掌楸的根、莖和葉片于現(xiàn)場采集后立即用液氮速凍，然后保存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中。另外，3月齡瓶苗用于質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的PEG6000、50 mg/L的ABA以及20%的PEG和50 μmol/L氟啶酮組合處理，分別于處理前及處理后12和24 h收集植株材料，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。

總RNA提取和cDNA合成分別使用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit和HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time reverse transcription PCR，RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)的引物見表1。LcPIN1基因的RT-qPCR使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），內(nèi)參基因選擇α-tubulin和18S RNA[36]，相對表達(dá)量計算使用2-ΔΔCt方法[37]。所有RT-qPCR實(shí)驗(yàn)均為3次生物學(xué)重復(fù)、3次技術(shù)重復(fù)，即每個樣本共9次重復(fù)。

1.4 LcPIN1a基因的克隆

利用CTAB法提取鵝掌楸葉片DNA[38]，根據(jù)鑒定到的LcPIN1a基因序列設(shè)計引物（表1），合成引物后使用高保真DNA聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行克隆，最后使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進(jìn)行目的片段的切膠回收。

1.5 LcPIN1a基因過表達(dá)載體構(gòu)建

首先，將克隆到的LcPIN1a cDNA片段連接中間載體pClone007 blunt vector（南京擎科生物科技有限公司）。然后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞[天根生化科技（北京）有限公司]，挑單菌落進(jìn)行測序驗(yàn)證。對測序驗(yàn)證正確的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并利用質(zhì)粒小提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取質(zhì)粒DNA。設(shè)計同源重組引物（表1），從含目的片段的中間載體中擴(kuò)增目的片段，后利用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行同源重組，將LcPIN1a構(gòu)建到CaMV35S啟動子介導(dǎo)的植物表達(dá)載體pBI121上，獲得 35S：LcPIN1a載體。

1.6 LcPIN1a基因在擬南芥中的過表達(dá)

將經(jīng)過測序驗(yàn)證正確的 35S：LcPIN1a質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株（上海唯地生物技術(shù)有限公司），采用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥[39]，獲得轉(zhuǎn)基因T1代種子。對T1代種子萌發(fā)出的擬南芥幼苗進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并收集轉(zhuǎn)基因陽性植株的T2代種子。進(jìn)一步對T2代種子進(jìn)行播種，根據(jù)孟德爾遺傳定律，收集純合的T3代種子，播種后用于生長和生殖相關(guān)性狀的表型測量和統(tǒng)計分析。

1.7 LcPIN1a基因在雜交鵝掌楸中的過表達(dá)

將經(jīng)過測序驗(yàn)證正確的35S：LcPIN1a質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株（上海唯地生物技術(shù)有限公司），以雜交鵝掌楸胚性愈傷為受體材料，進(jìn)行穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化[25]。在抗生素篩選并獲得胚性愈傷后，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，對驗(yàn)證陽性的愈傷進(jìn)行體胚誘導(dǎo)，獲得成熟子葉胚[24]。將獲得的成熟子葉胚接種到基本培養(yǎng)基上，于2月后統(tǒng)計成苗率，后測量生長相關(guān)性狀并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcPIN1基因的鑒定與生物信息分析

為鑒定鵝掌楸中的LcPIN1基因，利用擬南芥中的AtPIN1（AT1G73590）蛋白序列檢索鵝掌楸基因組[23]，共鑒定到5條相似性序列（Evaluelt;0.000 1，一致性大于50%）。進(jìn)一步將這5條相似性序列比對到擬南芥基因組上[28]，發(fā)現(xiàn)其中2條（Lchi05137和Lchi05662）的最佳比對分別為AtPIN2（AT5G57090）和AtPIN3（AT1G70940），剩余3條（Lchi15751、Lchi16330和Lchi17800）的最佳比對均為AtPIN1。

為了進(jìn)一步明確上述鑒定的3條候選基因是否確定為LcPIN1同源基因及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用上述方法鑒定了小立碗蘚、毛果楊、葡萄、水稻、高粱、玉米、無油樟等植物種中的PIN1同源蛋白，并與擬南芥和鵝掌楸PIN1同源蛋白一起，以小立碗蘚PINs蛋白為外群構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1a）。結(jié)果顯示，鵝掌楸中鑒定到的3條候選序列的確能夠與其他物種的PIN1同源蛋白聚為一支，分別命名為LcPIN1a（Lchi15751）、LcPIN1b（Lchi16330）和LcPIN1c（Lchi17800）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，PIN1基因在被子植物共同的祖先發(fā)生過1次基因復(fù)制事件，而后形成了兩個進(jìn)化大支。其中，鵝掌楸LcPIN1a、LcPIN1b與擬南芥AtPIN1同屬一個進(jìn)化支，而LcPIN1c則分屬另外一支（圖1a）。

進(jìn)一步通過對鵝掌楸、擬南芥及水稻PIN1同源蛋白的多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)PIN1蛋白的C端和N端較為保守，而中間區(qū)段則變異程度較大（圖1b）。已有研究顯示，PIN1蛋白為質(zhì)膜定位蛋白，其N端和C端均為疏水結(jié)構(gòu)域，分別含多個跨膜區(qū)[40]。通過對鵝掌楸PIN1同源蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示，LcPIN1a在N端和C端分別含有5個跨膜區(qū)，而LcPIN1b和LcPIN1c在C端的跨膜區(qū)為4個，比N端少1個（圖1c）。

此外，研究表明PIN1蛋白的疏水結(jié)構(gòu)域中包含多個作用于其質(zhì)膜定位及其介導(dǎo)的生長素轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵信號。其中，PIN1蛋白N端165號位的苯丙氨酸（F163）和C端480號位的酪氨酸（Y480）作用于與銜接蛋白復(fù)合物亞基μ-adaptin結(jié)合，從而作用于其蛋白運(yùn)輸和質(zhì)膜定位[41-42]。根據(jù)多序列比對結(jié)果，這2個氨基酸殘基位點(diǎn)在鵝掌楸3個PIN1同源蛋白中較為保守（圖1b）。

另外，PIN1蛋白疏水結(jié)構(gòu)域還存在3個演化上保守的基序TPRXS（N/S），其中絲氨酸殘基的磷酸化對PIN1介導(dǎo)的生長素極性運(yùn)輸至關(guān)重要[43]。根據(jù)多序列比對結(jié)果，鵝掌楸PIN1同源蛋白在這3個基序上的氨基酸較為保守，除了LcPIN1c蛋白的第3個基序由TPRXSN變?yōu)镾PRQSN，但絲氨酸殘基并未發(fā)生突變（圖1b）。

2.2 LcPIN1基因的組織特異性表達(dá)

為了初步明確鵝掌楸LcPIN1基因在植物生長和發(fā)育中的作用，開展了組織特異性表達(dá)模式分析。成年鵝掌楸植株的不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，LcPIN1a在鵝掌楸葉片和芽中表達(dá)量較高，而LcPIN1b和LcPIN1c均相對在雌蕊中表達(dá)量較高（圖2a）。為了進(jìn)一步明確LcPIN1基因的組織特異性表達(dá)，選取3月齡幼苗和2年生大苗的根、莖、葉組織進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示LcPIN1a均在葉片中高表達(dá)，而LcPIN1b和LcPIN1c表達(dá)情況較為復(fù)雜，2月齡時在莖中表達(dá)較高，而在2年生時則在根中表達(dá)相對較高（圖2b、2c）。這些結(jié)果表明，鵝掌楸LcPIN1不同旁系同源基因之間出現(xiàn)了明顯的功能分化，其中LcPIN1a在整個生長周期中主要作用于葉片的發(fā)育，而LcPIN1b和LcPIN1c則在營養(yǎng)生長時期主要作用于莖和根的發(fā)育，而后在生殖生長時期主要作用于雌蕊的發(fā)育。

2.3 LcPIN1基因在非生物脅迫下的表達(dá)

為了進(jìn)一步解析鵝掌楸LcPIN1基因的功能，利用已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，定量了其在干旱（15% PEG6000）、高溫（40 ℃）和低溫（4 ℃）脅迫下的表達(dá)動態(tài)變化（圖3a—3c）。結(jié)果顯示，LcPIN1a基因的表達(dá)水平較高，LcPIN1b基因次之，LcPIN1c基因表達(dá)水平最低，該結(jié)果可能是由于該系列轉(zhuǎn)錄組的樣本取自于脅迫處理后的葉片組織[44-45]，與上述組織特異性表達(dá)的結(jié)果一致（圖2）。在不同非生物脅迫之間，LcPIN1基因?qū)τ诘蜏睾透珊得{迫的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)較為一致，整體趨勢為先上調(diào)再下調(diào)（圖3a、3b），表明其可能在早期脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮功能。相反，在高溫脅迫下，LcPIN1基因的表達(dá)水平會迅速降低，隨后短期內(nèi)有一定的恢復(fù)，但隨后也會迅速降低（圖3c）。

為了驗(yàn)證非生物脅迫下LcPIN1基因的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)以及進(jìn)一步解析其響應(yīng)機(jī)制，利用PEG、ABA以及PEG和ABA合成抑制劑氟啶酮混合處理并進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)（圖3d—3f）。結(jié)果顯示，LcPIN1基因均對ABA處理敏感，尤其是LcPIN1a和LcPIN1c基因，在處理12 h后表達(dá)倍數(shù)增加了3～7倍（圖3d、3f）。另外，PEG處理?xiàng)l件下，LcPIN1基因的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，在處理24 h后，表達(dá)倍數(shù)增加約3倍（圖3d—3f）。在PEG和氟啶酮處理?xiàng)l件下，LcPIN1a基因的表達(dá)與PEG處理并無顯著差異，表明PEG誘導(dǎo)的LcPIN1a基因表達(dá)上調(diào)并不依賴于內(nèi)源的ABA合成（圖3d）。與之相反，LcPIN1b和LcPIN1c基因在PEG和氟啶酮處理?xiàng)l件下要比單獨(dú)的PEG處理表達(dá)水平顯著降低，表明PEG誘導(dǎo)的LcPIN1b和LcPIN1c基因表達(dá)上調(diào)依賴于內(nèi)源的ABA合成（圖3e、3f）。

綜上，這些研究結(jié)果顯示了LcPIN1基因能夠在短期內(nèi)響應(yīng)非生物脅迫而轉(zhuǎn)錄上調(diào)，但是響應(yīng)機(jī)制可能在不同旁系同源基因之間存在差異，進(jìn)而參與鵝掌楸的非生物脅迫響應(yīng)。

2.4 LcPIN1a基因在擬南芥中的過表達(dá)

為了進(jìn)一步解析鵝掌楸LcPIN1基因的功能，選擇并克隆在葉片中高表達(dá)的LcPIN1a基因，通過構(gòu)建CaMV35S啟動子驅(qū)動的過表達(dá)載體，利用花序侵染法異源轉(zhuǎn)化擬南芥，成功獲得了擬南芥LcPIN1a異源過表達(dá)株系（LcPIN1a-HO，圖4a）。在1/2 MS培養(yǎng)基上生長7 d后，野生型根長平均為（22.93 ± 7.65） mm，而LcPIN1a-HO株系的根長[平均（18.03 ± 7.81） mm]顯著短于野生型（圖4b、4c），表明LcPIN1a基因的異源過表達(dá)對擬南芥根生長起抑制作用。另外，通過觀察擬南芥在營養(yǎng)土中生長第25天的表型，發(fā)現(xiàn)LcPIN1a-HO株系平均株高為（26.69 ± 7.95） cm，要顯著矮于野生型擬南芥[平均（29.06 ± 7.15） cm，圖4d、4e]，并且主莖上的分枝數(shù)要顯著低于野生型（圖4d、4f），表明LcPIN1a基因的異源過表達(dá)抑制了擬南芥的高生長和分枝。

另外，由于鵝掌楸LcPIN1基因于生殖生長期間在雌蕊中高表達(dá)，因此進(jìn)一步觀察了LcPIN1a-HO株系在生殖生長時期花器官發(fā)育的表型（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型正常6個雄蕊（占比95%）相比，LcPIN1a-HO株系的雄蕊數(shù)目發(fā)生了明顯的變異，4和5個雄蕊的植株最多，分別占比24%和63%，6個雄蕊的植株僅占比8%（圖5b、5c）。但是，LcPIN1a-HO株系的雌蕊、花瓣和萼片并未觀察到數(shù)目或其他表型上的明顯變異（圖5a）。

2.5 LcPIN1a基因在鵝掌楸中的過表達(dá)

為了進(jìn)一步解析LcPIN1a基因的功能，以雜交鵝掌楸胚性愈傷為受體材料進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，并通過對陽性愈傷的體胚發(fā)生，成功獲得了雜交鵝掌楸LcPIN1a過表達(dá)株系（LcPIN1a-OE）。其中，LcPIN1a-OE株系4中LcPIN1a基因的表達(dá)倍數(shù)最高，達(dá)到了25倍左右（圖6a）。以轉(zhuǎn)基因陽性愈傷為材料進(jìn)行體胚發(fā)生，在獲得成熟子葉胚后接種到基本培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2月后，LcPIN1a-OE-4株系僅能再生出7株幼苗，再生植株轉(zhuǎn)化率低至5%（圖6b、6c）。因此，LcPIN1a-OE-4株系未被納入后續(xù)的表型分析。

通過對再生植株生長性狀的測量與統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)LcPIN1a基因的過表達(dá)導(dǎo)致了雜交鵝掌楸在根長和株高方面都顯著低于野生型（圖6e、6g）。同時，LcPIN1a-OE株系的主根不明顯，能夠從根莖連接處形成多個“不定根”，其平均根尖數(shù)約為2.5個，而野生型為1.7個（圖6d、6f）。綜上，LcPIN1a基因的過表達(dá)對雜交鵝掌楸地上和地下器官的生長均起抑制作用，同時會影響其根系結(jié)構(gòu)。

3 討 論

植物正常的生長發(fā)育是一個復(fù)雜而又精密的過程，其同時受到外源環(huán)境因素和內(nèi)源激素信號的調(diào)控。通常來說，溫度、光照、水分、重力等外源環(huán)境因子需要通過影響生長素、細(xì)胞分裂素等內(nèi)源激素的含量和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控植物生長和發(fā)育，從而實(shí)現(xiàn)可塑性的生長發(fā)育。其中，生長素在植物響應(yīng)環(huán)境的可塑性生長發(fā)育方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[46]。作為生長素外排載體，PIN蛋白活性受到包括生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸、油菜素內(nèi)酯以及獨(dú)腳金內(nèi)酯在內(nèi)的多種激素途徑的調(diào)節(jié)，從而在不同的生長發(fā)育過程中介導(dǎo)生長素的極值點(diǎn)和濃度梯度的建立，最終參與植物生長發(fā)育的調(diào)控[4]。因此，PIN介導(dǎo)的生長素極性運(yùn)輸是一個整合內(nèi)源性和外源性信號的中心樞紐。

鵝掌楸LcPIN1基因存在3個旁系同源基因，其中LcPIN1a主要在葉片中高表達(dá)，而LcPIN1b和LcPIN1c在幼苗時期主要在莖中高表達(dá)，而在2年生大苗中主要在根中高表達(dá)，這些結(jié)果表明，LcPIN1的3個旁系同源基因之間至少存在由于表達(dá)模式的不同而導(dǎo)致的功能分化。進(jìn)一步的干旱脅迫響應(yīng)進(jìn)一步說明了LcPIN1s之間的表達(dá)模式變異，即LcPIN1a不依賴于ABA途徑轉(zhuǎn)錄響應(yīng)干旱處理，而LcPIN1b/c依賴轉(zhuǎn)錄響應(yīng)干旱處理依賴于內(nèi)源ABA的生物合成。該結(jié)果表明鵝掌楸不同LcPIN1基因拷貝之間存在著明顯的轉(zhuǎn)錄分化，進(jìn)而會導(dǎo)致其在生物學(xué)功能上存在一定的分化。類似的結(jié)果同樣存在于水稻的4個LcPIN1旁系同源基因之間，其中OsPIN1a和OsPIN1b主要參與水稻根和莖的發(fā)育，而OsPIN1c和OsPIN1d主要參與稻穗的形成[17]。這些結(jié)果表明，通過基因復(fù)制后的表達(dá)模式變異，進(jìn)而調(diào)控不同的生物學(xué)過程，可能是不同植物種采取的保守演化策略，以確保生長和發(fā)育的穩(wěn)健性[47]。

另外，在PIN1介導(dǎo)的植物非生物脅迫響應(yīng)研究方面，最近有研究報道AtPIN1能夠與細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AZG1互作，從而介導(dǎo)擬南芥根在鹽脅迫下的根系結(jié)構(gòu)塑造[48]。同時，AtPIN1還能夠在干旱和鹽脅迫條件下調(diào)控植物表皮細(xì)胞的發(fā)育，從而介導(dǎo)植株在不同環(huán)境下的發(fā)育穩(wěn)健性和可塑性[49]。綜合鵝掌楸中LcPIN1s對干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)結(jié)果，暗示LcPIN1s可能在鵝掌楸耐旱性中發(fā)揮重要調(diào)控作用，為鵝掌楸的抗逆分子育種提供了一個候選的靶基因，相關(guān)結(jié)果有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在植物正常生長和發(fā)育方面，無論是在擬南芥中，還是在雜交鵝掌楸中，LcPIN1a的過表達(dá)均導(dǎo)致了株高和根長的顯著降低。該結(jié)果與在擬南芥中過表達(dá)AtPIN1在根長方面的表型類似，即導(dǎo)致根長顯著變短[50]。但是，在水稻中過表達(dá)OsPIN1僅會導(dǎo)致株高顯著變矮，而主根根長卻明顯增加[51]。在擬南芥中，AtPIN1過表達(dá)會導(dǎo)致根分生組織中積累更多的生長素[52]，進(jìn)而抑制根的伸長生長[53]。水稻中有關(guān)OsPIN1過表達(dá)增加根長的分子機(jī)制還不清楚，但是鵝掌楸LcPIN1似乎與擬南芥AtPIN1在根長生長方面的功能更為相似。

另外，雖然OsPIN1過表達(dá)并不影響水稻的不定根數(shù)量，但是OsPIN1干擾表達(dá)明顯降低了其不定根的數(shù)量[50]。同時，在柳枝稷（Panicum virgatum）中，PvPIN1過表達(dá)能夠明顯促進(jìn)不定根的形成[54]。此外，在蘋果（Malus domesticu）插條生根過程中，MdPIN1在不定根形成早期被誘導(dǎo)高表達(dá)[55]。結(jié)合LcPIN1a過表達(dá)導(dǎo)致雜交鵝掌楸主根不明顯，出現(xiàn)多個“不定根”的表型，推測PIN1可能參與了由生長素介導(dǎo)的植物不定根形成[56]。相關(guān)研究結(jié)果表明LcPIN1可以作為潛在候選基因，用作未來對鵝掌楸根系生長發(fā)育的進(jìn)一步研究以及根系結(jié)構(gòu)的定向改造。

綜上，本研究通過生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式鑒定，以及基因功能驗(yàn)證，初步鑒定了鵝掌楸PIN1同源基因在植物生長和發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)其廣泛參與了植物地上和地下器官的發(fā)育過程，并且過量表達(dá)不利于植株的正常生長和發(fā)育。

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（責(zé)任編輯 吳祝華）