柑橘黃龍病PCR檢測(cè)技術(shù)優(yōu)化

摘 要：為提高Jagoueix等建立的柑橘黃龍病PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)效率和檢出率，本研究對(duì)基因組DNA提取、PCR體系和PCR程序進(jìn)行優(yōu)化，分析了不同萃取次數(shù)、裂解溫度和抗氧劑組合對(duì)總DNA質(zhì)量的影響，并設(shè)置不同引物濃度梯度和退火溫度梯度，研究其對(duì)檢測(cè)效果的影響。結(jié)果表明，萃取次數(shù)對(duì)DNA質(zhì)量基本無(wú)影響；水浴65 ℃裂解比常溫裂解提取的DNA質(zhì)量更優(yōu)，但總體差別不大；DNA提取液中添加β-巰基乙醇、β-巰基乙醇和PVP或者二者均不加入，對(duì)最終的基因組DNA的質(zhì)量和純度影響不大；引物濃度為0.4～1.0 μmol/L出現(xiàn)穩(wěn)定特征條帶，引物濃度為0.1 μmol/L時(shí)仍會(huì)產(chǎn)生引物二聚體；在66.5 ℃退火溫度下的檢測(cè)結(jié)果最優(yōu)。因此，采取一次萃取、常溫裂解、不添加抗氧化劑可簡(jiǎn)化DNA提取步驟；將引物濃度調(diào)整為0.8 μmol/L效果最佳；退火溫度66.5 ℃可提高檢出率；優(yōu)化后檢測(cè)體系操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、檢測(cè)率高，適于柑橘黃龍病的批量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：柑橘黃龍??；DNA提?。籔CR；檢測(cè)體系

中圖分類號(hào)：S436 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-1038（2024）12-0020-06

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.12.004

Optimization of PCR Detection Technology for Citrus Huanglongbing

YANG Ya1，2，3， SHI Zhuoyi6， ZHOU Run1，2，3， PENG Dingwen1，2，3，4*， ZHU Baode6， WANG Liyan2，7， SUN Qiannan1，2，3，4， TANG Zhimin1，5， HE Yanqing1，2，3，4， SHEN Chaofeng1，3，4

（1. Chenzhou Institute of Agricultural Sciences， Chenzhou 423000， China; 2. Chenzhou Citrus Huanglongbing Inspection and Testing Center， Chenzhou 423000， China; 3. Chenzhou Citrus Detoxification Technology Research and Development Center， Chenzhou 423000， China; 4. Chenzhou Agricultural Molecular Technology Application Research Center， Chenzhou 423000， China; 5. Chenzhou Citrus Huanglongbing （Citrus psyllid） Monitoring and Control Technology Research and Development Center， Chenzhou 423000， China; 6. Xiangnan University， Chenzhou 423000， China; 7. Chenzhou Agriculture and Rural Bureau， Chenzhou 423000， China）

Abstract： In order to improve the efficiency and detection rate of citrus Huanglongbing detection system， the author combined the amplification system established by Jagoueix et al. to optimize DNA extraction， PCR system， and PCR program. This study used different extraction times， different cracking temperatures， and different combinations of antioxidants to study the impact on DNA quality， as well as by setting primer concentration gradients and annealing temperature gradients to study their impact on detection performance. The results showed that the extraction frequency had little effect on DNA quality. The quality of DNA extracted by water bath lysis at 65 ℃ was better than that by room temperature lysis， but the overall difference was not significant. Adding to DNA extraction solution β-Mercaptoethanol β-Mercaptoethanol and PVP， both of which were not added， had little effect on the quality and purity of the final total DNA. Stable characteristic bands appeared at primer concentrations of 0.4-1.0 μmol/L， and primer dimers were still formed at primer concentrations of 0.1 μmol/L The detection results were optimal at an annealing temperature of 66.5 ℃. Therefore， adopting a single extraction， room temperature lysis， and no addition of antioxidants can simplify the DNA extraction process. Adjust the primer concentration to 0.8 μmol/L had the best effect. Annealing temperature of 66.5 ℃ could improve the detection rate. The optimized detection system was easy to operate， stable， and had a high detection rate， making it suitable for batch detection of Huanglongbing.

Keywords： Citrus Huanglongbing; DNA extraction; PCR; detection system

柑橘黃龍病又名青果病、黃梢病，素有“柑橘癌癥”之稱，是影響柑橘生產(chǎn)最嚴(yán)重的檢疫性病害之一[1]，廣泛分布于亞洲、非洲、南美洲和北美洲的40余個(gè)國(guó)家[2]。目前在我國(guó)南方黃龍病日益蔓延，嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)馗涕佼a(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3-4]。柑橘黃龍病的病原已于1994年被確定為韌皮部桿菌屬類細(xì)菌（Candidatus Liberibacter spp）[5]，主要寄生在根系、葉片等器官韌皮部組織的篩管細(xì)胞中，通過(guò)維管束和孢間連絲在樹(shù)體內(nèi)傳播[6]，根據(jù)病原在16S rDNA及β-操縱子基因序列上的差異，將其分為3個(gè)種，即亞洲種Cadidatus Liberibacter asiaticus、非洲種Ca. L. africanus和美洲種Ca. L. americanus[7-8]，中國(guó)的品種主要為亞洲種[9-12]。柑橘樹(shù)感病后潛伏期長(zhǎng)且癥狀復(fù)雜，易與葉片缺鋅等生理性病害的癥狀混淆，根據(jù)癥狀難以對(duì)早期和局部感染的柑橘黃龍病作出及時(shí)準(zhǔn)確的判斷[13-14]，延誤了疫情的防控，造成生產(chǎn)上的巨大損失。因此在早期對(duì)黃龍病進(jìn)行快速準(zhǔn)確的診斷至關(guān)重要。

柑橘黃龍病檢測(cè)有血清學(xué)檢測(cè)、高光譜檢測(cè)等方法，但這些手段成本高、過(guò)程繁瑣[15]。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)方法的流行，基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法逐漸被應(yīng)用，此檢測(cè)方法靈敏度高，可以批量進(jìn)行定量和定性分析，應(yīng)用廣泛[16]。其中qPCR技術(shù)較常規(guī)PCR技術(shù)有更好的靈敏度和特異性，但是所需要的儀器復(fù)雜、昂貴，成本更高[17-18]。Jagoucix等[9]通過(guò)黃龍病病原菌的16S rDNA序列設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物OI1/OI2c，利用常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)亞洲種和非洲種進(jìn)行體外擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度均為1 160 bp的特異性片段?；谶@一原理建立的檢測(cè)技術(shù)是目前我國(guó)常見(jiàn)的檢測(cè)方法之一[19]。但該方法在實(shí)際操作中，檢測(cè)步驟較繁雜，為了優(yōu)化這一問(wèn)題，本研究采用不同萃取次數(shù)、裂解溫度和抗氧劑組合來(lái)研究其對(duì)基因組DNA質(zhì)量的影響，以及通過(guò)設(shè)置引物濃度梯度、退火溫度梯度來(lái)研究其對(duì)檢測(cè)效果的影響，進(jìn)一步優(yōu)化DNA提取、PCR體系和PCR程序，以期建立高效的檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

柑橘品種為‘錦紅’，來(lái)自郴州市永興縣某十五年冰糖橙果園。

1.1.2 儀器與試劑

Scientz-48組織研磨器，寧波新芝公司；3K15離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；K5800C超微量分光光度計(jì)，北京凱奧科技公司；TOne 96常規(guī)PCR儀，德國(guó)耶拿公司；JY-300HC高壓電泳儀、JY-SPCT水平電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備公司；ChampGel 6000凝膠成像儀，北京賽智公司。

DNA提取液：54.9 mmol/L CTAB、100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、20 mmol/L EDTA（pH=8.0）、1.4 mmol/L NaCl、0.1% β-巰基乙醇。氯仿∶異戊醇∶乙醇（V∶V∶V=80∶4∶16）、異丙醇、75%無(wú)水乙醇、3 mol/L NaAc（pH 5.2）、TE緩沖液（pH 8.0），以上試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2×Taq master mix，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA純度檢測(cè)方法

（1）紫外光譜法

利用紫外光譜法檢測(cè)DNA濃度以確定提取總量；以A260/A280來(lái)判定DNA的純度，看是否含有其他雜質(zhì)。

（2）瓊脂糖凝膠電泳法

取2 μL柑橘基因組DNA樣品，在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳20 min，在凝膠成像儀下觀測(cè)。

1.2.2 不同抗氧化劑比較

剪取柑橘葉片中脈組織，在DNA提取時(shí)采取不加抗氧化劑、加抗氧化劑0.1% β-巰基乙醇、加抗氧化劑0.1% β-巰基乙醇和1% PVP-40。DNA提取完成后測(cè)定DNA濃度和吸光度，隨后進(jìn)行基因組DNA電泳，確定最佳抗氧化劑組合。

1.2.3 不同裂解溫度比較

剪取柑橘葉片中脈組織，在DNA提取裂解時(shí)分別在65 ℃水浴裂解10 min和室溫裂解10 min。DNA提取完成后測(cè)定DNA濃度和吸光度，隨后進(jìn)行基因組DNA電泳，確定合適裂解方式。

1.2.4 不同萃取方法比較

剪取柑橘葉片中脈組織，均勻分成兩份，在DNA提取萃取時(shí)采取氯仿∶異戊醇∶乙醇（V∶V∶V=80∶4∶16）一次萃取和兩次萃取?；蚪MDNA提取完成后測(cè)定其DNA濃度和吸光度，隨后進(jìn)行基因組DNA電泳，篩選合適的萃取方法。

1.2.5 不同退火溫度比較

OI1/OI2c引物的復(fù)性溫度為67.0 ℃左右，本研究以0.5 ℃為梯度，從65.0 ℃到69.0 ℃，設(shè)置9個(gè)梯度，以確定引物擴(kuò)增的最適退火溫度。

1.2.6 不同引物濃度比較

在15 μL的PCR反應(yīng)體系下，將10 μL、10 μmol的引物（OI1/OI2c）分別稀釋到1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 μmol，形成6個(gè)濃度梯度。取1 μL的DNA模板分別加入0.5 μL引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，篩選出最適引物濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)采用Excel 2021進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化劑對(duì)DNA濃度和純度的影響

不同抗氧化處理下基因組DNA的濃度與純度見(jiàn)表1，不同抗氧化劑、不同裂解溫度和不同萃取次數(shù)提取基因組DNA的電泳圖譜見(jiàn)圖1。

由表1和圖1可以看出，無(wú)抗氧化劑提取的DNA濃度分別為11.1、40.7、49.7 ng/μL，平均值為33.8 ng/μL，A260/A280比值在1.413～1.468，平均值為1.442；加0.1% β-巰基乙醇提取的DNA濃度均在40 ng/μL以上，平均值為44.7 ng/μL，A260/A280比值為1.422～1.433，平均值為1.428；加0.1% β-巰基乙醇和1% PVP-40提取的DNA濃度均在38 ng/μL左右，平均值為37.9 ng/μL，A260/A280比值在1.465～1.479，平均值為1.472。添加0.1% β-巰基乙醇或1% PVP與二者均加入的DNA提取液相比，無(wú)添加的DNA提取液，提取濃度更高，但是DNA質(zhì)量基本一致。三者基因組DNA降解都不明顯。

表1 不同抗氧化處理下基因組DNA的濃度與純度

Table 1 Concentration and purity of genomic DNA

with different antioxidants

M：Marker；2～4泳道：1次萃取；5～7泳道：2次萃?。?～10泳道：65 ℃水浴裂解；11～13泳道：室溫水浴裂解；14～16泳道：無(wú)抗氧化劑提取液；17～19泳道：0.1% β-巰基乙醇提取液；20～22泳道：0.1% β-巰基乙醇和PVP-40提取液

圖1 基因組DNA的電泳圖譜

Fig.1 Electrophoretogram of genomic DNA

2.2 裂解溫度對(duì)DNA濃度與純度的影響

不同裂解溫度對(duì)柑橘基因組DNA純度的影響如表2和圖1。從表2可以看出，65 ℃水浴裂解的DNA濃度為27.0～41.9 ng/μL，平均值為36.0 ng/μL，A260/A280比值在1.438～1.488，平均值為1.461；室溫裂解的DNA濃度平均值為32.03 ng/μL，A260/A280比值分別為1.425、1.497、1.414，平均值為1.445。由圖1中的第8～13泳道可知，8～10泳道與11～13泳道目標(biāo)條帶亮度相近（第12泳道可能是點(diǎn)樣缺失），因此，水浴65 ℃處理后的比常溫處理提取的基因組DNA濃度更高，純度相對(duì)較高，但總體差別不大。兩者總DNA降解都不明顯。

表2 不同裂解溫度處理下基因組DNA的濃度與純度

Table 2 Concentration and purity of genomic DNA

with different pyrolysis temperatures

2.3 萃取次數(shù)對(duì)DNA濃度和純度的影響

柑橘基因組DNA提取采用不同萃取次數(shù)的結(jié)果如表3和圖1。由表3和圖1可以看出，萃取1次的DNA濃度在36.3～47.8 ng/μL，平均值為43.2 ng/μL，A260/A280比值為1.471～1.492，平均值為1.485；萃取2次的DNA濃度在29.5～33.2 ng/μL，平均值為31.0 ng/μL，A260/A280比值在1.448～1.470，平均值為1.460。萃取2次的DNA濃度低于萃取1次的DNA濃度，但DNA純度無(wú)明顯差異。兩者基因組DNA降解都不明顯。

表3 不同萃取次數(shù)提取基因組DNA的濃度與純度

Table 3 Concentration and purity of genomic DNA

with different extraction times

2.4 退火溫度對(duì)擴(kuò)增效率的影響

以0.5 ℃為梯度，從65.0 ℃到69 ℃，9個(gè)退火溫度擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段的結(jié)果比較如圖2所示。從圖2A可以看出，以0.5 ℃為梯度，在66.5～69.0 ℃之間的6個(gè)退火溫度電泳條帶逐漸減弱，69.0 ℃時(shí)完全沒(méi)有條帶。從圖2B可以看出，以0.5 ℃為梯度，65～67.5 ℃之間的6個(gè)退火溫度亮度逐漸增加，65.0～67.5 ℃出帶亮度比較理想，擴(kuò)增效率較高，因此退火溫度66.5 ℃比較合適。

A：M，Marker；2～7泳道，分別是66.5、67.0、67.5、68.0、68.5、

69.0 ℃這6個(gè)退火溫度下的PCR擴(kuò)增條帶

B：M，Marker；2～3、4～5、6～7、8～9、9～10、11～12泳道，分別是65.0、65.5、66.0、66.5、67.0、67.5 ℃這6個(gè)退火溫度下的PCR擴(kuò)增條帶

圖2 不同退火溫度電泳圖譜

Fig.2 Electrophoretcgram of different annealing temperatures

2.5 引物濃度優(yōu)化

不同引物濃度對(duì)擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段的影響結(jié)果如圖3。從圖3可以看出，隨著引物濃度的降低，亮度呈逐漸減弱趨勢(shì)，0.4 μmol/L以下無(wú)柑橘黃龍病特征條帶出現(xiàn)。在0.1 μmol/L的引物濃度下仍會(huì)產(chǎn)生引物二聚體，0.8 μmol/L以上的引物濃度下出帶較亮。

M：Marker；2～19泳道：1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 μmol這6個(gè)引物濃度下的PCR擴(kuò)增條帶；20～25泳道：1.0～0.1 μmol的6個(gè)引物濃度下清水對(duì)照的PCR擴(kuò)增條帶

圖3 不同引物濃度的電泳圖譜

Fig.3 Electrophoretogram of different primer concentrations

3 結(jié)論與討論

本研究在Jagoucix等[9]建立的柑橘黃龍病檢測(cè)體系基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)采取一次萃取、常溫裂解、不添加抗氧化劑，調(diào)整合適引物和退火溫度，簡(jiǎn)化操作步驟，提高檢出率，提高檢測(cè)體系效率。

柑橘所含的多酚類化合物易氧化、褐變，并與基因組DNA黏附在一起，不利于DNA提取，通常需要在DNA提取液中添加β-巰基乙醇等抗氧化劑，在本研究中不添加抗氧化劑對(duì)基因組DNA質(zhì)量影響不大。由于β-巰基乙醇為有毒試劑，因此，從確保實(shí)驗(yàn)人員安全和降低實(shí)驗(yàn)成本角度來(lái)看，本體系不添加抗氧化劑。在DNA的提取過(guò)程中，通常采用65 ℃水浴裂解，部分研究提取柑橘基因組DNA時(shí)采用室溫裂解，但提取的DNA質(zhì)量差，無(wú)法滿足PCR需求[20-21]，而在本研究中采用室溫裂解所獲得的DNA質(zhì)量與水浴溫度65 ℃裂解差別不大，能滿足PCR擴(kuò)增要求，因此從便捷和實(shí)用的角度考慮，室溫裂解是更好的選擇。此外，本研究中DNA提取時(shí)只萃取一次，在確保DNA質(zhì)量的前提下，簡(jiǎn)化了萃取次數(shù)，減少了有毒化學(xué)試劑氯仿的使用。

PCR的特異性受到退火溫度的影響，在一定范圍內(nèi)退火溫度和擴(kuò)增效率成正比，隨著溫度升高，特異性增強(qiáng)，但超過(guò)一定溫度，引物與模板結(jié)合不牢使擴(kuò)增效率降低；若溫度過(guò)低，則可能使引物與模板發(fā)生錯(cuò)配。一般將退火溫度設(shè)置為45～68 ℃。引物OI1/OI2c的最佳復(fù)性溫度為67 ℃左右，在本實(shí)驗(yàn)中退火溫度為66.5 ℃時(shí)，PCR擴(kuò)增效果相對(duì)較好，這與Jagoucix等[9]的退火溫度72 ℃相差較大，與婁兵海[19]的68 ℃較為接近，這可能是本研究所用的試劑、設(shè)備不同所致。引物濃度是檢出靈敏度的影響因子之一，在本研究中，引物濃度小于0.4 μmol/L沒(méi)有出現(xiàn)黃龍病特征條帶；引物濃度在0.1～1.0 μmol/L之間引物二聚體一直存在，可能是病原DNA在基因組DNA中濃度較低，也可能是DNA模板存在少量雜質(zhì)所致。

在本研究中，雖然DNA提取步驟簡(jiǎn)便和DNA質(zhì)量滿足檢測(cè)需要，但是提取的DNA在紫外波長(zhǎng)A260/A280吸光度比值只有1.45左右，純度較低。這可能是本研究采用常溫研磨有關(guān)，因?yàn)楦涕偃~脈中多酚類化合物在常溫下易于氧化、褐變，會(huì)影響DNA純度。

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收稿日期：2024-09-12

基金項(xiàng)目：郴州市技術(shù)研發(fā)中心項(xiàng)目：郴州市柑橘脫毒技術(shù)研發(fā)中心、郴州市柑橘黃龍?。臼┍O(jiān)測(cè)與防控技術(shù)研發(fā)中心；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題早中熟柑橘大面積豐產(chǎn)增效輕簡(jiǎn)化栽培技術(shù)集成示范（2024YFD2300802）

第一作者簡(jiǎn)介：楊亞（1990—），女，農(nóng)藝師，碩士，主要從事農(nóng)作物脫毒與快繁研究工作

*通信作者簡(jiǎn)介：彭丁文（1978—），男，副研究員，碩士，主要從事農(nóng)作物生物技術(shù)研究與應(yīng)用工作