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    甜瓜蔓枯病生物學(xué)特性及防治藥劑篩選

    2024-12-07 00:00:00李洋趙飛邢鯤鄧潔玉樊思瑩蒲秀蘭楊存第
    中國果菜 2024年12期

    摘 要:為明確甜瓜蔓枯病病原菌的生物學(xué)特性以及篩選出適合防治該病癥的藥劑,本試驗在不同溫度、pH、碳源和氮源條件下對該病原菌進(jìn)行培養(yǎng),確定對該病原菌生長最適溫度、pH、碳源、氮源。采用菌絲生長速率法,用3種殺菌劑與PDA培養(yǎng)基混合制成含藥培養(yǎng)基,測定抑制率,構(gòu)建毒力回歸方程并計算EC50。結(jié)果表明,甜瓜蔓枯病病原菌最適溫度為25 ℃,最適pH為6,最適碳源為葡萄糖,最適氮源為蛋白胨和硝酸鉀。在供試的3種藥劑中,百菌清對其抑制效果最好,EC50為2.097;其次為三唑酮,EC50為2.494;代森錳鋅的作用效果最差,EC50為2.531。探討不同環(huán)境條件對甜瓜蔓枯菌生長的影響,能夠助力環(huán)保有效生物防治藥劑的篩選,為甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

    關(guān)鍵詞:甜瓜蔓枯病;產(chǎn)孢量;生物學(xué)特性;藥劑篩選

    中圖分類號:Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1008-1038(2024)12-0084-06

    DOI:10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.12.014

    Biological Characteristics of Melon Vine Blight and Screening

    of Preventive Agents

    LI Yang1, ZHAO Fei1, XING Kun1*, DENG Jieyu2, FAN Siying2, PU Xiulan3, YANG Cundi3

    (1. College of Plant Protection, Shanxi Agricultural University, Taiyuan 030031, China; 2. Department

    of Biology and Food Engineering, Lyuliang University, Lvliang 033000, China; 3. Fanzhi County

    Agricultural Industry Development Center, Xinzhou 034000, China)

    Abstract: In order to clarify the biological characteristics of the pathogen of melon cran blight and select the drugs suitable for the prevention and treatment of the disease, this test cultured the pathogen under different temperature, pH, carbon source and nitrogen source conditions, and determined the most favorable temperature, pH, carbon source and nitrogen source for the growth of the pathogen. Using the mycelium growth rate method, three fungicides and PDA culture medium were mixed to make a drug-containing culture medium to determine the inhibition rate and build a virulence regression to calculate the EC50. The results showed that the most suitable temperature of melon blight pathogens was 25 ℃, the most suitable pH was 6, the most suitable carbon source was glucose, and the most suitable nitrogen source was protein and potassium nitrate. Among the three agents tested, Bamoxazole had the best inhibition effect, with EC50 of 2.097, followed by Triazolone, with EC50" of 2.494; and the worst effect of Daisen manganese zinc, with EC50 of 2.531. Exploring the effects of different environmental conditions on the growth of Fusarium graminearum could effectively assist in the screening of environmentally friendly and effective biological control agents, providing scientific basis and technical support for the sustainable development of the melon industry.

    Keywords: Melon vine blight; sporulation quantity; biological characteristics; drug screening

    甜瓜(Cucumis melo L.)是葫蘆科黃瓜屬植物,大多起源于非洲[1]。作為我國主要的經(jīng)濟(jì)作物,甜瓜在各地均有種植,其中新疆、山東和河南等地產(chǎn)量較大[2]。據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計,我國甜瓜種植面積與產(chǎn)量均居世界首位,種植面積占全球的36.3%,產(chǎn)量占全球的48.71%[3]。甜瓜蔓枯病又稱黑斑病、黑腐病,是由瓜角斑殼針孢(Stagonosporopsis cucurbitacearum)侵染引起的。甜瓜蔓枯病是甜瓜最主要的病害之一,導(dǎo)致果實表面開裂,莖稈腐爛,甚至死秧,一旦傳染,會對甜瓜的生長發(fā)育造成較大的影響[4]。甜瓜蔓枯病主要為害主蔓和側(cè)蔓,有時也會侵害葉柄和葉片。葉片受害初期,葉緣出現(xiàn)黃褐色“V”字形病斑,輪紋不明顯,之后整個葉片枯萎死亡。葉柄受損初期,出現(xiàn)黃褐色橢圓形至條形病斑,之后會有萎縮現(xiàn)象,柄部以上枝葉枯死[5-6]。

    近年來,數(shù)據(jù)顯示,甜瓜蔓枯病的為害已超過枯萎病等其他土傳病害,田間發(fā)病率極高,可以達(dá)到60%~80%,并且可能導(dǎo)致產(chǎn)量減少超30%[7]。國內(nèi)外學(xué)者對甜瓜蔓枯病預(yù)防和治理的研究已經(jīng)獲得了突破。如夏智杰等[8]采用菌絲生長速率法測定了7種殺菌劑對甜瓜蔓枯病病原菌的室內(nèi)毒力,結(jié)果顯示,啶酰菌胺、咪鮮胺對其抑制效果較好。江蛟等[9]指出在農(nóng)藥敏感性方面,蔓枯病菌對咪鮮胺較為敏感。咪鮮胺、代森錳鋅、百菌清對甜瓜蔓枯病均有一定的防治效果,其中以咪鮮胺的防治效果最明顯[10]。鄭建余等[11]在對甜瓜蔓枯病進(jìn)行藥物治療的研究中,比較了不同藥劑的防治效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用寶粒精50稀釋4 000倍液與益微稀釋1 000倍液混合噴霧的方法,對于防控甜瓜蔓枯病的效果最為顯著;單獨使用寶粒精50稀釋4 000倍液噴霧防治效果最差。Kefialew等[12]研究發(fā)現(xiàn),噻酰菌胺能顯著抑制蔓枯病菌的生長,并可以有效地控制甜瓜蔓枯病的發(fā)生與蔓延。

    目前,甜瓜蔓枯病的防治主要依賴化學(xué)藥劑,長期單一使用某一種或某一類農(nóng)藥,容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性,從而降低防治效果[13-14]。通過科學(xué)合理地輪換使用不同作用機(jī)理的農(nóng)藥,可以有效延緩抗藥性的產(chǎn)生,能夠最大限度地發(fā)揮各藥劑的作用,減少病原菌對藥劑的抗藥力。本文研究了不同環(huán)境下,甜瓜蔓枯病菌落的生物學(xué)特性,并用3種殺菌劑與PDA培養(yǎng)基混合制成含藥培養(yǎng)基,測定其抑制率,以期篩選出更多有效且環(huán)保的生物防治藥劑,提高甜瓜的抗病能力,減少化學(xué)藥劑的使用,為甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    高壓蒸汽鍋,YXQ-LB30SII,上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;恒溫培養(yǎng)箱,GXZ-380C,寧波江南儀器廠;霉菌培養(yǎng)箱,MJ-150-I,寧國沙鷹科學(xué)儀器有限公司;顯微鏡,BX41,北京普瑞賽司儀器有限公司。

    甜瓜蔓枯病病原菌,由呂梁學(xué)院微生物資源開發(fā)利用實驗室分離所得;土豆(馬鈴薯),星瑪客超市購得;蔗糖,天津市北長方正試劑廠;99%瓊脂粉,山東西亞化學(xué)有限公司;葡萄糖、硝酸鈉、蛋白胨,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;果糖,河南萬邦化工科技有限公司;94%麥芽糖,上海源葉生物科技有限公司;尿素,天津歐博凱化工有限公司;硝酸鉀,上海實意化學(xué)試劑有限公司。

    75%百菌清可濕性粉劑,山東百農(nóng)思達(dá)生物科技有限公司;75%代森錳鋅水分散粒劑,河北雙吉化工有限公司;25%三唑酮(粉銹寧)可濕性粉劑,上海悅聯(lián)化工有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 甜瓜蔓枯病病原菌的來源

    2023年9月從山西省忻州市忻府區(qū)部落村(38°41′N、112°73′E)甜瓜葉片發(fā)病部位采集病樣,甜瓜品種為‘甜蜜蜜’。

    利用組織分離法[15]將采集的病樣用滅菌解剖刀切取病健組織的交界處,先用75%酒精消毒60 s,再用無菌水沖洗3遍,培養(yǎng)至PDA培養(yǎng)基內(nèi),每個平板放3塊,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)2~7 d。將分離到的菌株,挑取菌落邊緣菌塊于PDA上,連續(xù)轉(zhuǎn)接數(shù)代直至菌落特征單一為止。用單胞分離法進(jìn)行純化培養(yǎng),通過分子生物學(xué)鑒定,派森諾生物公司檢測得到菌株瓜角斑殼針孢(Stagonosporopsis cucurbitacearum)。

    1.2.2 病原菌生物學(xué)特性的研究

    (1)不同溫度對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

    制作PDA培養(yǎng)基,在無菌操作臺把實驗室已保存下來的甜瓜蔓枯病病原菌用直徑6 mm的打孔器打成菌餅,接種到PDA培養(yǎng)基中央,分別置于15、20、25、30、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中全暗培養(yǎng),重復(fù)處理3次,7 d后用十字交叉法測量其直徑大小,第20天測定產(chǎn)孢量[13]。

    (2)不同pH對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

    將直徑為6 mm的菌餅接種到不同pH(用HCl溶液與NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)的平板中央位置,將各平板放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),重復(fù)處理3次,7 d后用十字交叉法測量菌落的直徑,第20天測產(chǎn)孢量。

    (3)不同碳源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

    以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)[14],制備含有不同碳源的察氏培養(yǎng)基,碳源包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉等。將6 mm的甜瓜蔓枯病病原菌菌餅分別接種到不同碳源的固態(tài)察氏培養(yǎng)基上,并設(shè)置不添加任何碳源的培養(yǎng)基作為空白對照。進(jìn)行培養(yǎng),其他同(1)。

    (4)不同氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

    使用察氏培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,固定碳源為蔗糖,氮源包括硝酸鈉、硝酸鉀、蛋白胨、尿素、硫酸銨。將6 mm的菌餅分別接種到不同氮源的固態(tài)察氏培養(yǎng)基上,以不加氮源的培養(yǎng)基做對照,25 ℃進(jìn)行培養(yǎng),其他同(1)。

    1.2.3 產(chǎn)孢量的測定

    吸取無菌水至培養(yǎng)病原菌的平板里,用涂布器將瓊脂表層的孢子輕輕刮下。把紗布固定在小燒杯上收集濾液。然后用無菌水沖洗濾液,使濾液體積最終達(dá)到2 mL,轉(zhuǎn)移至5 mL離心管里,得到孢子懸浮液。將孢子懸浮液添加至血細(xì)胞計數(shù)板上,水平放置在顯微鏡上,靜置約5 min。先在低倍鏡下找到計數(shù)室,再在高倍鏡下觀察孢子。采用血細(xì)胞計數(shù)板法進(jìn)行計數(shù)。

    對每個樣品重復(fù)記錄3次,取其平均值,然后再按照孢子數(shù)=80個小格中孢子數(shù)÷80×400×104×B計算孢子數(shù),其中B為稀釋倍數(shù)。

    1.2.4 病原菌生長抑制率的測定

    制作PDA培養(yǎng)基,平均分裝在錐形瓶中。分別稱取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g百菌清試劑,0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g代森錳鋅試劑,0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g三唑酮試劑。然后用無菌水稀釋,配制成相應(yīng)濃度母液。向培養(yǎng)基中加入適量母液(根據(jù)查理定律計算),空白對照組培養(yǎng)基中加等量無菌水。

    采用菌絲生長速率法[15]測試所選3種殺菌劑的作用效果。6~7 d的甜瓜蔓枯病病原菌菌落邊緣打6 mm的菌碟,將菌碟接種到各平板的中央。然后將各樣本分別置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)6 d后采用十字交叉法測量直徑,取平均值,根據(jù)公式(1)計算各處理組的抑制率[16]。

    菌絲生長抑制率/%=

    ■×100 (1)" "1.3 數(shù)據(jù)處理

    將所得數(shù)據(jù)使用SPSS 27.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示測定結(jié)果,并用Duncan法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較,進(jìn)行方差分析。計算出各濃度的殺菌劑對甜瓜蔓枯菌菌絲的抑制率,以藥劑濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo),各處理每個濃度的平均抑制率為縱坐標(biāo),利用SPSS 27.0構(gòu)建毒力回歸方程。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 甜瓜蔓枯病病原菌生物學(xué)特性

    2.1.1 不同溫度對病原菌生長和產(chǎn)孢量的影響

    在PDA培養(yǎng)基上接種甜瓜蔓枯病病原菌,放在15~35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)后,結(jié)果如圖1、2所示,發(fā)現(xiàn)不同溫度對菌絲的生長和產(chǎn)孢量都有顯著影響。如圖1所示,菌絲在15、20、25、30 ℃下均能生長,且在25 ℃時,菌絲生長速率最快,平均直徑(8.10±0.10)cm;但在35 ℃下卻不能長出菌絲。如圖2所示,溫度為25 ℃時平均產(chǎn)孢量最高,約為10.83×106個/mL,溫度為35 ℃時不能產(chǎn)生孢子。因此,該菌種適合在低溫下生長,高溫不利于其生長。菌落直徑的大小和產(chǎn)孢量在15 ℃和30 ℃沒有顯著性差異;20 ℃下的菌絲直徑和30 ℃有明顯差異,而20 ℃下的產(chǎn)孢量和30 ℃的并無明顯差異,這說明菌絲和產(chǎn)孢量之間沒有顯著相關(guān)性,只是越接近最適溫度,菌落直徑和產(chǎn)孢量越大。整體來看,25 ℃是該病原菌的最適溫度。

    圖1 不同溫度對菌落直徑的影響

    Fig.1 Effect of different temperatures on colony diameter

    圖2 不同溫度對病原菌產(chǎn)孢量的影響

    Fig.2 Effect of different temperatures on the sporulation

    of pathogenic bacteria

    2.1.2 不同pH對病原菌生長和產(chǎn)孢量的影響

    如圖3所示,pH對該菌絲的生長和產(chǎn)孢量的影響均顯著。培養(yǎng)基的pH為3~12時,該病原菌均能生長。從直徑的角度看,pH為6、7時,病原菌生長比較迅速,但pH為6時平均菌落直徑最大,為(8.17±0.11)cm。pH為3時,菌落直徑明顯變小至(3.18±0.06)cm,生長速度顯然較慢,而在pH為7~12時,直徑無明顯變化,說明該菌種不適合在強酸環(huán)境下生長。

    如圖4所示,pH為6時,平均產(chǎn)孢量最大,約為10.55×106個/mL,與其他pH的環(huán)境相比,孢子產(chǎn)生速度存在顯著性差異;pH為3、4、5時,產(chǎn)生孢子數(shù)量很少,且明顯少于pH為8、9、10、11、12時孢子的數(shù)量,說明該菌種相對于酸性條件來說,堿性條件更適合產(chǎn)孢。綜合來看,該甜瓜蔓枯病菌病原菌最適pH為6,菌絲生長的適應(yīng)范圍較廣,在pH為中性和偏酸性的地帶最適合產(chǎn)孢,強堿性條件比強酸性條件更適合產(chǎn)孢。

    圖3 不同pH對菌落直徑的影響

    Fig.3 Effect of different pH on colony diameter

    圖4 不同pH對病原菌產(chǎn)孢量的影響

    Fig.4 Effect of different pH on the sporulation

    of pathogenic bacteria

    2.1.3 不同碳源對病原菌生長和產(chǎn)孢量的影響

    如圖5、6所示,不同碳源對菌絲生長和產(chǎn)孢量均有顯著影響。由圖5可以看出,即使在無碳源的情況下該病原菌菌絲也依然可以生長。碳源為葡萄糖時,菌絲生長最快,平均菌落直徑為(8.13±0.08)cm;蔗糖為碳源和無碳源的情況下,菌落平均直徑無明顯差異,分別為(7.52±0.11)cm、(7.52±0.04)cm;當(dāng)以麥芽糖、果糖作為碳源時,菌絲生長無顯著性差異,平均菌落直徑分別為(7.15±0)cm、(7.05±0.13)cm;可溶性淀粉作為碳源時,菌絲生長速度最慢,平均直徑為(6.57±0.07)cm。

    由圖6可知,無碳源平均產(chǎn)孢量約2×105個/mL,與其相比,加入其他物質(zhì)作碳源均有利于孢子產(chǎn)生,但是產(chǎn)孢量也有明顯不同。葡萄糖平均產(chǎn)孢量最多,約為5.80×106個/mL,是最適碳源;蔗糖次之,約為3.42×106個/mL;麥芽糖、果糖產(chǎn)孢量相對較少,分別約為1.70×106、1.13×106個/mL;可溶性淀粉最少,平均產(chǎn)孢量約為8.2×105個/mL。綜合來看,葡萄糖是該病原菌的最適碳源。

    圖5 不同碳源對菌落直徑的影響

    Fig.5 Effect of different carbon sources on colony diameter

    圖6 不同碳源對病原菌產(chǎn)孢量的影響

    Fig.6 Effects of different carbon sources on the sporulation of pathogenic bacteria

    2.1.4 不同氮源對病原菌生長和產(chǎn)孢量的影響

    如圖7所示,不同氮源對菌絲生長有顯著性影響,無氮源情況下菌絲仍然可以生長。硝酸鉀和蛋白胨作為氮源時菌絲生長速度最快,平均直徑分別為(8.27±0.06)、(8.03±0.04)cm,最適合菌絲生長。硝酸鈉、尿素和無氮源的情況下菌絲生長速率無明顯差異,平均直徑分別為(7.43±0.06)、(7.23±0.14)、(7.18±0.15)cm;硫酸銨作為氮源時,不僅沒有促進(jìn)菌絲的生長,反而比無氮源的情況下菌絲生長速率更慢,平均直徑為(2.02±0.10)cm,說明硫酸銨不適合作為氮源促進(jìn)該病原菌菌絲的生長。

    圖8顯示,不同氮源對產(chǎn)孢量有顯著性影響。從孢子角度看,相較于無氮源時產(chǎn)生的平均約2.5×106個/mL孢子,加入不同氮源均能促進(jìn)其孢子的產(chǎn)生。蛋白胨和硝酸鉀作為氮源時產(chǎn)孢量最多,分別約30.17×106、29.67×106個/mL,最適合病原菌產(chǎn)生孢子;尿素相對較少,平均產(chǎn)孢量約為16.67×106個/mL;然后是硝酸鈉,約為12.33×106個/mL,最后為硫酸銨,約1.90×106個/mL。整體來看,蛋白胨和硝酸鉀為該菌種的最適氮源。

    圖7 不同氮源對菌落直徑的影響

    Fig.7 Effect of different nitrogen sources on colony diameter

    圖8 不同氮源對病原菌產(chǎn)孢量的影響

    Fig.8 Effects of different nitrogen sources on the sporulation of pathogenic bacteria

    2.2 不同藥劑對菌絲生長的抑制效果

    由表1知,EC50越大,藥劑對病原菌的抑制效果越小。所以,EC50為2.097的百菌清試劑對病原菌的作用相比來說最大,其次是EC50為2.494的三唑酮試劑,最后是代森錳鋅試劑,EC50為2.531,作用最弱。3種殺菌劑對甜瓜蔓枯病的毒力由強到弱依次是百菌清、三唑酮、代森錳鋅。

    表1 3種菌劑對菌絲生長的抑制效果

    Table 1 The inhibitory effect of three microbial agents

    on hyphal growth

    3 結(jié)論與討論

    本實驗從甜瓜蔓枯病病原菌的生物學(xué)特性和防治藥劑篩選兩個方向進(jìn)行了研究。在生物學(xué)特性方面,病原菌在15~30 ℃下都能生長,同時會有孢子產(chǎn)生;25 ℃是最適溫度,這一結(jié)果與李偉等[17]的發(fā)現(xiàn)一致;25 ℃下產(chǎn)孢量最多。在35 ℃下不會生長,也不會產(chǎn)生孢子。pH為3~12時,病原菌的菌絲均能夠生長,也能夠產(chǎn)生孢子,這與夏智杰等[18]的研究結(jié)果一致。該病原菌最適pH為6,這與劉欣洋[19]的發(fā)現(xiàn)一致。同時pH為6時,產(chǎn)孢量最大,其次是在pH為7時產(chǎn)孢量較多,所以甜瓜蔓枯病病原菌在pH為中性和偏酸性的環(huán)境下最適合產(chǎn)孢。

    碳氮等營養(yǎng)元素是病原菌生長過程中不可或缺的一部分。本實驗中,病原菌在有無碳源的情況下菌絲都能生長,在加入可溶性淀粉和果糖后,平均直徑小于無碳源的對照組。葡萄糖為最適碳源,這一結(jié)果與劉欣洋[19]研究的結(jié)果可溶性淀粉為碳源時最適合蔓枯菌菌絲生長不同。從產(chǎn)孢量來看,當(dāng)碳源為葡萄糖時,產(chǎn)孢量最大。無氮源條件下菌絲仍然可以正常生長,硫酸銨作為氮源時平均菌落直徑比無碳源小,但是產(chǎn)孢量比無碳源多。

    綜合菌絲生長速率和產(chǎn)孢量,硝酸鉀和蛋白胨為病原菌的最適氮源。在防治藥劑篩選方面,本研究測定了3種殺菌劑對甜瓜蔓枯病病原菌的毒力。結(jié)果表明,百菌清的抑菌效果在所選3種藥劑中最好,三唑酮次之,代森錳鋅效果最差,這與江蛟[9]的研究結(jié)果一致。在實際生產(chǎn)中,可以綜合各方面條件選擇合適的藥劑進(jìn)行殺菌。百菌清、代森錳鋅和三唑酮都是有效的藥劑選擇。百菌清適用于廣泛的真菌病害,但需注意抗藥性問題;代森錳鋅具有較好的內(nèi)吸性和持久性,適合長期使用;三唑酮則因其高效低毒的特點,特別適用于甜瓜一類的敏感作物。在實際應(yīng)用中,建議結(jié)合具體病情和環(huán)境條件,合理選擇和交替使用這些藥劑,以達(dá)到最佳的防治效果。同時,還應(yīng)加強農(nóng)業(yè)管理措施,如輪作、合理密植、增施磷鉀肥等,以減少病害的發(fā)生和蔓延。

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    收稿日期:2024-09-23

    基金項目:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)雜糧研究院科研項目(ZL20230501)

    第一作者簡介:李洋(2001—),女,在讀碩士,研究方向為農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理

    *通信作者簡介:邢鯤(1980—),男,副研究員,博士,主要從事農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理工作

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