基于分子動(dòng)力學(xué)模擬的超高壓聯(lián)合天然抑制劑鈍化多酚氧化酶活性的機(jī)制解析

摘 要：超高壓處理（high-pressure processing，HPP）是食品非熱加工的常用技術(shù)，但由于該技術(shù)難以鈍化多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）等食品品質(zhì)相關(guān)內(nèi)源酶，導(dǎo)致產(chǎn)品貨架期易發(fā)生酶促劣變。本文探究了HPP處理分別聯(lián)合表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）對(duì)PPO活性的影響，并使用分子動(dòng)力學(xué)模擬揭示了可能的分子結(jié)合機(jī)制。結(jié)果表明，3種抑制劑均能以濃度性依賴抑制PPO活性，但是相比于FA，EGCG和C3G更為高效。相比于單獨(dú)HPP處理，不同抑制劑與HPP的聯(lián)合處理均顯著降低了PPO活性，尤其是添加4.5×10-4 mol/L EGCG的樣品在經(jīng)過600 MPa、20 min處理后殘余酶活僅剩（12.98±0.24）%，幾乎實(shí)現(xiàn)了PPO完全滅活。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示，HPP與EGCG聯(lián)合處理加劇了PPO的去折疊與水合，穩(wěn)定了EGCG與PPO之間的結(jié)合，并可能造成活性中心的掩埋，最終導(dǎo)致其活性下降。綜上，HPP與天然抑制劑的聯(lián)合處理表現(xiàn)出充分鈍化PPO的潛力，有望彌補(bǔ)其應(yīng)用短板。

關(guān)鍵詞：分子動(dòng)力學(xué)模擬；超高壓；天然抑制劑；多酚氧化酶；機(jī)制

中圖分類號(hào)：TS255.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-1038（2024）12-0013-07

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.12.003

Mechanism Analysis of Passivation of Polyphenol Oxidase Activity

by Ultra-high Pressure Combined with Natural Inhibitors

Based on Molecular Dynamics Simulation

TIAN Xuezhi1， GONG Chaoyun2， YAN Fuquan2， WANG Yongtao1*

（1. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， National Engineering Research Center for Fruit amp; Vegetable Processing， Key Laboratory of Fruit amp; Vegetable Processing， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing Key Laboratory for Food Nonthermal Processing， Beijing 100083， China;

2. Guizhou Tianci Guibao Food Co.， Ltd， Anshun 561000， China）

Abstract： High-pressure processing （HPP） is a common technology of non-thermal food processing technology. However， it is challenging to inactivate endogenous enzymes related to food quality， such as polyphenol oxidase （PPO）， which leads to enzymatic deterioration of products during their shelf life. In this study， the effects of HPP treatment combined with epigallocatechin gallate （EGCG）， ferulic acid （FA）， and cyanidin-3-O-glucoside （C3G） on PPO activity were investigated， and molecular dynamics simulations （MD） was used to elucidate potential molecular binding mechanisms. Results indicated that all three inhibitors could inhibit PPO activity in a concentration-dependent manner， with EGCG and C3G demonstrating greater efficacy than FA. Compared to HPP treatment alone， the combined treatment of various inhibitors with HPP all significantly reduced PPO activity. Notably， the residual activity of sample treated with 4.5×10-4 mol/L EGCG exhibited only （12.98±0.24）% after treatment at 600 MPa for 20 minutes， indicating an near-complete inactivation. Molecular dynamics simulation results revealed that the combined treatment of HPP and EGCG enhanced the unfolding and hydration of PPO， stabilized the binding between EGCG and PPO， and might result in the burial of the active site， ultimately leading to a decrease in its activity. In conclusion， the combined treatment of HPP and natural inhibitors shows promise for completely inactivating PPO， which is expected to address the application limitations of HPP.

Keywords： Molecular dynamics simulation; ultra-high pressure; natural inhibitors; polyphenol oxidase; mechanism

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是一種III型銅蛋白，廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中[1-2]。在果蔬采后，PPO主要催化新鮮果蔬發(fā)生酶促褐變，不僅直接導(dǎo)致色澤劣變，還會(huì)引起加工和貯藏過程中的風(fēng)味惡化和營(yíng)養(yǎng)成分損失[3-5]。此外，發(fā)生酶促褐變的產(chǎn)品會(huì)大大降低消費(fèi)者的接受度，由此導(dǎo)致食物浪費(fèi)和較大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。因此，如何充分抑制PPO的活性，一直是食品領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

超高壓處理（high pressure processing，HPP）是當(dāng)今最具商業(yè)前景的非熱處理技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于果蔬制品、奶制品以及水產(chǎn)品等的殺菌與保藏上[3，6-7]。由于具有壓縮效應(yīng)，HPP主要影響蛋白質(zhì)等大分子的非共價(jià)鍵，而對(duì)一些食品質(zhì)量屬性密切相關(guān)的低分子量化合物（如顏色物質(zhì)和香氣成分）的影響有限，因此能充分保持產(chǎn)品的新鮮品質(zhì)[8]。在HPP下，由氫鍵維持的酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)變性并展開，伴隨著內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露和構(gòu)象的變化，從而影響活性中心的可及性[9]。盡管如此，許多文獻(xiàn)報(bào)道了PPO的耐壓性[9-12]。在800 MPa下處理1 min后，蘑菇PPO的殘余活性仍然高達(dá)84.9%[10]。

近年來，考慮到清潔標(biāo)簽和環(huán)保的趨勢(shì)，一些天然植物化學(xué)物質(zhì)，如阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）[13]、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）[14]和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）[2]等被發(fā)現(xiàn)具有PPO抑制效應(yīng)，并被用于抗酶促褐變?cè)囼?yàn)。但在實(shí)際生產(chǎn)中，為保證食品在貯藏過程中的安全性和質(zhì)量穩(wěn)定性，在添加抑制劑后仍然需要對(duì)產(chǎn)品執(zhí)行后續(xù)的滅菌工藝。因此，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中單用HPP處理難以滿足滅活PPO的要求，通過HPP與抑制劑聯(lián)合處理來降低酶活性是理想的選擇。目前，很少有研究探討 HPP與抑制劑聯(lián)合處理對(duì)PPO抑制能力的影響。鑒于分子動(dòng)力學(xué)模擬可以提供傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)難以直接觀測(cè)的分子甚至原子尺度發(fā)生變化的信息，為了進(jìn)一步揭示HPP與EGCG聯(lián)合處理鈍化PPO的分子機(jī)制，本研究采用分子動(dòng)力學(xué)模擬考察了在EGCG存在時(shí)不同壓力條件下PPO結(jié)構(gòu)的變化，旨在為今后類似研究提供參考，從而推動(dòng)HPP技術(shù)的進(jìn)一步推廣應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)升級(jí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘑菇多酚氧化酶（PPO，119 kDa），美國(guó)Sigma公司；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（純度＞98%）、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（純度＞95%）和阿魏酸（純度＞99%），上海源葉生物科技有限公司；鄰苯二酚及其他分析純?cè)噭本┧魅R寶試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CQC30L-600超高壓處理設(shè)備，北京速原中天科技股份公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市宏華儀器廠；UV-1800可見分光光度計(jì)，日本島津有限責(zé)任公司；PFS-300快速熱封口機(jī)，德清拜杰電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

溶液的制備參考Tian等[2]的方法并稍作修改。將PPO粉末和抑制劑分別溶解到磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH=6.8）中，然后將PPO溶液與抑制劑溶液按比例混合，使得混合液的終體積為5 mL，不足的體積以緩沖液補(bǔ)足。在37 ℃下孵育20 min后立即進(jìn)行酶活檢測(cè)。其中，EGCG的濃度分別為（0.125～4.5００）×10-4 mol/L，C3G濃度為（0.20～9.0）×10-5 mol/L，F(xiàn)A濃度為（0.25～7.2０）×10-4 mol/L。PPO終濃度為0.83×10-6 mol/L。

1.3.2 樣品處理

參考Zhou等[9]的方法，將5 mL混合好的酶液裝入聚乙烯透明袋（8 cm×12 cm）內(nèi)，在冰浴下迅速完成熱封。隨后將樣品置于超高壓處理設(shè)備中，在室溫（20±2）℃ 下進(jìn)行處理。設(shè)置處理壓強(qiáng)分別為200、400、550 MPa，保壓時(shí)間為20 min。設(shè)備的升壓速率約為280 MPa/min，卸壓時(shí)間小于3 s。

1.3.3 多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定

根據(jù)Tian等[2]的方法，準(zhǔn)確吸取0.5 mL酶液于石英比色皿中，加入2 mL鄰苯二酚溶液（50 mmol/L，以pH=6.8的磷酸緩沖液配制）后搖勻，立即使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度測(cè)定。設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為420 nm，檢測(cè)間隔為1 s，數(shù)據(jù)采集60次。PPO的酶活性定義為在1 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)每1 mL酶促反應(yīng)體系吸光度變化0.01為1個(gè)活性單位（U/mL）。未添加任何抑制劑的酶液被用作空白對(duì)照，各樣品的最終結(jié)果以相對(duì)殘余酶活RA表示，計(jì)算公式見式（1）。

RA/%＝■×100（1）

式中，RA為相對(duì)殘余酶活，%；A為處理后樣品中酶活性，U/mL；A0為處理前樣品中酶活性，U/mL。

1.3.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬

參考Tian等[2]的方法，在顯式溶劑化條件下，使用GROMACS 2019.6程序進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。使用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org）中的PPO晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：2Y9X），并采用constrain方法對(duì)雙核銅與6個(gè)組氨酸殘基的配位鍵進(jìn)行限制。通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載EGCG的3D立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，并使用Multiwfn重新計(jì)算RESP電荷[15]。力場(chǎng)設(shè)置為Amber99sb-ildn，使用TIP3P 水模型。使用Parrinello-Rahman方法將壓力耦合條件設(shè)置為200、400、600 MPa。在所有模擬中，短程非鍵合相互作用的截止值設(shè)置為1.0 nm，并使用PME方法計(jì)算長(zhǎng)程靜電相互作用。應(yīng)用LINCS算法來約束所有包含氫原子的鍵長(zhǎng)度，對(duì)每個(gè)模擬體系均進(jìn)行100 ns的運(yùn)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次以上重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式來表示。應(yīng)用SPSS 25對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2021繪圖。2 結(jié)果與分析

2.1 不同天然抑制劑對(duì)多酚氧化酶活性的影響

由圖1可知，EGCG、FA和C3G均表現(xiàn)出對(duì)PPO的抑制能力，而且抑制效果具有濃度依賴性。在研究的濃度范圍內(nèi)，隨著EGCG或FA濃度的增加，PPO活性呈現(xiàn)先快速下降，后逐漸趨于平緩的趨勢(shì)。而隨著C3G濃度的增加，PPO活性始終維持線性下降趨勢(shì)，這與Zhou等[14]報(bào)道的結(jié)果一致。這些結(jié)果反映了以上3種抑制劑具有不同的PPO抑制機(jī)理。已有研究表明EGCG和FA是PPO的混合型抑制劑，而C3G則屬于不可逆抑制劑[2，13-14，16]。然而，EGCG可以直接與PPO的底物競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)，而FA只能結(jié)合在PPO的非活性區(qū)域，這可能是導(dǎo)致它們表現(xiàn)出類似的抑制趨勢(shì)，但是抑制能力不同的原因[2，17]。當(dāng)EGCG的濃度為4.5×10-4 mol/L時(shí)，PPO的殘余酶活僅剩（22.96±0.46）%，而當(dāng)FA濃度為9.0×10-4 mol/L時(shí)，PPO殘余酶活仍高達(dá)（66.34±0.76）%。此外，在7.2×10-5 mol/L的添加濃度下，C3G的存在使得PPO殘余酶活降低至（43.93±0.27）%。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，僅需添加1.8×10-4 mol/L的C3G即可使PPO幾乎完全滅活[14]。綜上，3種抑制劑均能有效地鈍化PPO活性，但是抑制機(jī)理和效力有所差異。由于3種抑制劑的抑制趨勢(shì)幾乎均在添加1/3最高濃度時(shí)發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變，為了進(jìn)一步研究不同抑制劑與HPP聯(lián)合處理的鈍酶效果，對(duì)于不同的抑制劑，分別選取了其最高添加濃度與1/3最高濃度這兩個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 EGCG（A）、C3G（B）和FA（C）的添加濃度對(duì)

PPO活性的影響

Fig.1 Effect of the add concentrations of EGCG （A）， C3G（B）， FA（C） on the activity of polyphenol oxidase

2.2 HPP與不同天然抑制劑聯(lián)合處理對(duì)多酚氧化酶活性的影響

由圖2可知，在不添加抑制劑的情況下，隨著處理壓力的增加，PPO殘余酶活先下降后上升，在600 MPa、20 min的處理?xiàng)l件下，殘余活性仍高達(dá)（83.87±1.40）%。田學(xué)智等[12]在使用超高壓處理渾濁蘋果汁的實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)，經(jīng)550 MPa、5 min處理后樣品的PPO殘余酶活高達(dá)82.70%。

在不同濃度的C3G或FA存在時(shí)，隨著處理壓力的增加，PPO活性均表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)。經(jīng)200 MPa處理后，添加C3G或FA的4組聯(lián)合處理樣品的酶活均降至最低。此時(shí)，當(dāng)C3G添加濃度為2.4×10-5 mol/L時(shí)，酶活最低值為（51.43±1.17）%，當(dāng)濃度增加至7.2×10-5 mol/L時(shí)，酶活最低值顯著下降至（32.40±0.88）%。而在相同HPP處理?xiàng)l件下，不同濃度FA組的酶活差異很小，最低酶活數(shù)值也相近，分別為（48.05±2.40）%和（45.06±1.05）%。不同的是，高濃度的EGCG存在時(shí)，隨著處理壓力的增加，PPO殘余酶活整體保持下降趨勢(shì)。在600 MPa處理?xiàng)l件下，添加1.5×10-4 mol/L EGCG的樣品殘余酶活為（226.62±0.58）%，而添加4.5×10-4 mol/L EGCG的樣品殘余酶活僅剩（12.98±0.24）%，幾乎實(shí)現(xiàn)了對(duì)PPO的完全滅活?？紤]到EGCG早在2010年已被列入新資源食品名單，未來在食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，因此有必要對(duì)其機(jī)理進(jìn)行深入解析。

圖2 HPP與不同天然抑制劑聯(lián)合處理對(duì)PPO活性的影響

Fig.2 Effect of HPP treatments combined with different natural inhibitors on the activity of polyphenol oxidase

2.3 HPP與EGCG聯(lián)合處理影響PPO的分子動(dòng)力學(xué)模擬分析

2.3.1 不同壓力條件下PPO回轉(zhuǎn)半徑、自由體積和疏水表面積的變化

回轉(zhuǎn)半徑代表了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的整體緊湊性[18]。如圖3A所示，在未加壓的條件下，EGCG的存在使得PPO的回轉(zhuǎn)半徑出現(xiàn)了顯著的下降，這表明了二者間存在強(qiáng)烈的相互作用。當(dāng)施加200 MPa的壓力時(shí)，PPO的回轉(zhuǎn)半徑有所回升，隨著壓力增加至400 MPa以上時(shí)，PPO的回轉(zhuǎn)半徑顯著下降。這說明此時(shí)PPO發(fā)生了去折疊，內(nèi)部高度折疊的疏水核空腔部分暴露在溶劑環(huán)境中。此時(shí)，PPO的活性中心可能會(huì)受到波及，導(dǎo)致空腔發(fā)生變形甚至被掩埋，進(jìn)而影響與底物的結(jié)合[9]。由圖3B可知，PPO的自由體積不會(huì)受到EGCG的影響，但是會(huì)隨著壓力的升高逐漸降低。這同樣證實(shí)了HPP的壓縮效應(yīng)導(dǎo)致PPO發(fā)生了去折疊。表面溶劑可及面積是描述蛋白質(zhì)疏水性的重要參數(shù)。類似地，PPO的疏水表面積在EGCG存在時(shí)減少（圖3C），并且在壓力存在時(shí)，隨著壓力的增加持續(xù)下降，這可能與PPO發(fā)生去折疊后體積縮減有關(guān)。

2.3.2 不同壓力條件下PPO內(nèi)部氫鍵、與水分子間氫鍵數(shù)量的變化

氫鍵在蛋白質(zhì)折疊中起著核心作用。由圖4A可知，在常壓狀態(tài)下（0.1 MPa），PPO的內(nèi)部氫鍵數(shù)目約為250個(gè)，單個(gè)EGCG分子的存在對(duì)整體氫鍵數(shù)目的影響不大。然而，當(dāng)壓力提升至200～400 MPa時(shí)，PPO內(nèi)部的氫鍵數(shù)目呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。這與黃業(yè)傳等[19]報(bào)道的木瓜蛋白酶內(nèi)氫鍵在200 MPa下氫鍵數(shù)量減少的結(jié)果一致。當(dāng)壓力繼續(xù)增加到600 MPa時(shí)，氫鍵數(shù)量回升。如圖4B所示，常壓下EGCG的存在同樣對(duì)PPO與水分子間的氫鍵數(shù)量影響有限。當(dāng)環(huán)境壓力為200 MPa時(shí)，PPO與水分子間的氫鍵數(shù)目顯著增加。當(dāng)壓力提升至400 MPa時(shí)，PPO與水分子間的氫鍵數(shù)目再次增加，但是在600 MPa下未出現(xiàn)更多變化。這說明壓力條件促進(jìn)了PPO分子的去折疊和“溶劑化”，增強(qiáng)了PPO與水分子間的相互作用[9]。此時(shí)，PPO內(nèi)部的氨基酸殘基暴露在水中，導(dǎo)致了內(nèi)部氫鍵的破壞，并與水分子形成了新的氫鍵。

2.3.3 不同壓力條件下EGCG與PPO活性中心距離的變化

現(xiàn)有的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)表明，PPO的活性中心口袋包含一對(duì)雙核銅結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)對(duì)底物的催化功能[20]。如圖5所示，在常壓條件下，EGCG與PPO活性中心的最小距離僅有約0.45 nm，這表明它可以直接結(jié)合在PPO的活性中心附近。之前報(bào)道的一些酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子對(duì)接，以及分子動(dòng)力學(xué)的結(jié)果均證實(shí)了這一點(diǎn)[2，16]。然而，這種結(jié)合很可能不夠穩(wěn)定，在模擬后期，即80 ns以后，可以發(fā)現(xiàn)EGCG與PPO活性中心發(fā)生了明顯分離，最小距離由約0.6 nm陡增至1.0 nm以上。當(dāng)施加200～400 MPa的壓力時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)EGCG與PPO活性中心的最小距離始終穩(wěn)定在約0.45 nm，表明壓力條件可以穩(wěn)定EGCG與PPO的結(jié)合，這可能是結(jié)合了EGCG的PPO在HPP處理后活性再次下降的原因。當(dāng)壓力達(dá)到600 MPa時(shí)，兩者間的距離反而有所增加。這可能是因?yàn)镻PO的疏水內(nèi)核受到破壞，部分水分子甚至進(jìn)入PPO內(nèi)部，使其原本高度折疊的空間構(gòu)象發(fā)生了劇烈變化，活性中心因此被掩埋[9]。此時(shí)，PPO與EGCG的結(jié)合受到了阻礙，同理，PPO也難以識(shí)別并催化底物氧化，最終導(dǎo)致活性降低。

圖5 不同HPP處理?xiàng)l件EGCG與PPO活性中心

的最小距離

Fig.5 The minimum distance between EGCG and PPO active center under different HPP treatment conditions

3 結(jié)論

HPP單獨(dú)處理很難充分鈍化PPO，經(jīng)過600 MPa、20 min處理后，PPO的殘余活性仍高達(dá)（83.87±1.40）%。經(jīng)過HPP與EGCG、FA或C3G的聯(lián)合處理后，PPO的酶活顯著下降，尤其是4.5×10-4 mol/L EGCG與600 MPa、20 min的聯(lián)合處理幾乎實(shí)現(xiàn)了對(duì)PPO的完全鈍化。壓力可以增強(qiáng)EGCG與PPO活性中心之間的相互作用，此外，二者的聯(lián)合處理可以誘導(dǎo)PPO發(fā)生去折疊和疏水空腔暴露，導(dǎo)致整體空間構(gòu)象改變，進(jìn)而影響其對(duì)底物的識(shí)別和催化，這可能是PPO活性下降的主要原因。綜上，HPP與天然抑制劑的聯(lián)合處理策略表現(xiàn)出有效鈍化PPO的巨大潛力，未來有必要對(duì)其進(jìn)行更深入的機(jī)制探索和更廣泛的應(yīng)用研究。

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收稿日期：2024-10-09

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合成果〔2022〕一般024）

第一作者簡(jiǎn)介：田學(xué)智（1997—），男，在讀博士，研究方向?yàn)楣叻菬峒庸ず凸邇?nèi)源酶活性調(diào)控

*通信作者簡(jiǎn)介：王永濤（1983—），男，教授，博士，主要從事食品非熱加工和食品組分相互作用等研究工作