黃瓜枯萎病菌侵染黃瓜的表觀特征及轉(zhuǎn)錄組分析

摘要：枯萎病是國內(nèi)外黃瓜生產(chǎn)中普遍發(fā)生的真菌性土傳病害。采用浸根接種法對抗感黃瓜枯萎病材料進行苗期人工接菌表型鑒定。結(jié)果表明，21A130表現(xiàn)為高抗，9930表現(xiàn)為感病。通過對抗感材料接菌后0、96 h的根部樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果表明，接菌后96 h的根部差異表達基因（DEGs）中有263個為上調(diào)，347個為下調(diào)；GO與KEGG分析富集分析顯示，DEGs主要富集在逆境反應、應激反應、鐵離子結(jié)合、氧化還原酶活性等條目與苯丙烷生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導、MAPK信號通路、碳代謝、植物病原菌互作等通路上。其中，10個DEGs顯著上調(diào)表達，2個DEGs顯著下調(diào)表達，1個DEGs下調(diào)表達且RT-qPCR與RNA-seq結(jié)果均一致，特別是上調(diào)表達的CsCHI在抗病材料的根部表達量高，差異達到35.4倍，調(diào)控幾丁質(zhì)酶合成，通過減少真菌生物量積累增強抗性；下調(diào)表達的CsAAPI在感病材料的根部表達量高，差異達到8.3倍，通過調(diào)控天冬氨酸蛋白酶發(fā)揮抗病作用。

關(guān)鍵詞：黃瓜；枯萎病抗性；轉(zhuǎn)錄組分析；差異表達基因；表觀特征

中圖分類號：S436.421.1⁺3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0123-10

收稿日期：2024-03-03

基金項目：河北省果菜類蔬菜現(xiàn)代種業(yè)科技創(chuàng)新團隊項目（編號：21326309D-4）。

作者簡介：隋繼超（1998—），男，河北承德人，碩士研究生，從事黃瓜遺傳育種與分子生物學研究。E-mail：18732477343@163.com。

通信作者：閆立英，博士，教授，從事黃瓜遺傳育種與分子生物學研究，E-mail：yanliying66@126.com；謝 洋，博士，副教授，從事蔬菜栽培生理及分子生物學研究，E-mail：xieyangly123@163.com。

黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國重要蔬菜作物^［1］。枯萎病是國內(nèi)外黃瓜生產(chǎn)中普遍發(fā)生的真菌性土傳病害。黃瓜枯萎病在我國吉林省首次發(fā)生^［2］，現(xiàn)已成為嚴重危害黃瓜生產(chǎn)的病害。尖孢鐮刀菌黃瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）為黃瓜枯萎病致病菌，包括4個生理小種，在我國由4號生理小種導致枯萎病發(fā)生^［3］。該病原菌主要從傷口處危害黃瓜的根或根頸部，導致植株枯萎，黃瓜枯萎病發(fā)病率一般在10%～30%之間，嚴重時可導致絕收^［4］。生產(chǎn)上黃瓜枯萎病防治方法主要為農(nóng)業(yè)防治、生物防治與化學防治，其中常用南瓜做砧木嫁接栽培防治枯萎病，但嫁接耗費人工，同時影響黃瓜果實的風味品質(zhì)^［5-6］。因此，選育抗病品種^［7］是防治枯萎病的最佳途徑。

黃瓜枯萎病抗病性鑒定方法有苗期鑒定和田間鑒定^［8］，以苗期抗病性鑒定為主^［9］，主要包括菌土接種法^［10-11］、灌根接種法^［12］、胚根接種法^［13］、下胚軸注射接種法^［14］、葉盤法^［15］、浸根接種法^［16］，目前多采用《黃瓜枯萎病鑒定技術(shù)規(guī)程》（NY/T 1857.3—2010）所規(guī)定的浸根接種法。種質(zhì)資源是黃瓜育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，對黃瓜種質(zhì)資源進行精準評價，可為黃瓜新品種選育、重要性狀基因挖掘及分子設(shè)計育種^［17］提供重要材料基礎(chǔ)。

目前，較多研究在轉(zhuǎn)錄水平上分析植物抗病機理。研究表明，病原體相關(guān)蛋白（PR）中幾丁質(zhì)酶主要通過減少真菌生物量積累來增強植物對枯萎病的抗性，其中編碼黃瓜Ⅰ類幾丁質(zhì)酶的CsChi23可有效調(diào)控黃瓜對枯萎病菌的抗性反應^［18］；通過對黃瓜抗枯萎病品種的sRNA-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)了可能參與黃瓜枯萎病抗性反應的miRNA及其靶基因（miR319a-JRL3、miR6300-BEE1、miR6300-DAHP1和miR6300-PERK2）^［19］；以黃瓜抗枯萎病品種為試驗材料，結(jié)合BSA-seq技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組技術(shù)共同發(fā)掘到了5個候選基因（Csa2G007990、Csa2G009430、Csa2G009440、Csa2G008780和Csa2G009330）^［12］；通過比較黃瓜自交系材料的BSA-seq與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)掘16個候選基因，通過基因功能注釋初步確定3個候選基因CsFAR1-1、CsFAR1-2、CsFAR1-3^［15］。然而，利用不同遺傳材料挖掘到的黃瓜枯萎病抗性基因并不相同。因此，有必要開展黃瓜枯萎病抗感材料的精確表型鑒定及對抗性顯著差異種質(zhì)資源進行轉(zhuǎn)錄組分析。

本研究采用《黃瓜抗枯萎病鑒定技術(shù)規(guī)程》（NY/T 1857.3—2010）浸根接種法^［16］進行黃瓜枯萎病苗期抗性鑒定，并對鑒定材料進行轉(zhuǎn)錄組分析，通過挖掘候選基因為黃瓜枯萎病抗病分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃瓜枯萎病抗感材料21A130與9930來源于河北科技師范學院黃瓜課題組。試驗接種所用病菌為生理小種4號，來源于中國農(nóng)業(yè)大學園藝學院張小蘭實驗室。

1.2 接種鑒定

本試驗于2023年9—12月在河北科技師范學院科研樓進行，采用《黃瓜抗枯萎病鑒定技術(shù)規(guī)程》（NY/T 1857.3—2010）所規(guī)定的浸根接種法^［16］進行黃瓜枯萎病的苗期抗性鑒定，抗感材料各播種10株，3次重復。以中農(nóng)6號為對照，自主鑒定黃瓜枯萎病抗性，中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所同時進行鑒定。病情分級標準、病情指數(shù)計算方法與抗性評價標準均參考《黃瓜抗枯萎病鑒定技術(shù)規(guī)程》（NY/T 1857.3—2010）。

1.3 樣品準備與轉(zhuǎn)錄組測序

用病原菌處理子葉展平期的黃瓜幼苗，在子葉展平期接菌后0、96 h取幼苗根部為待測序樣品，3次重復，各自命名為R21A130_0 h（抗病材料接菌后 0 h）、R21A130_96 h（抗病材料接菌后96 h）、S9930_0 h（感病材料接菌后0 h）、S9930_96 h（感病材料接菌后96 h），共計12份樣品。轉(zhuǎn)錄組測序工作由諾禾致源科技股份有限公司進行。

1.4 參考基因組比對與新基因預測

過濾原始數(shù)據(jù)，去除帶接頭、含N、低質(zhì)量reads（Qphred≤20的堿基數(shù)占reads全長50%以上）。用HISAT2將有效數(shù)據(jù)對比到參考基因組，獲取reads定位信息^［20］。過濾原始數(shù)據(jù)、檢查GC含量與測序錯誤率后得到有效數(shù)據(jù)，用于數(shù)據(jù)分析。

1.5 定量分析與差異基因鑒定

根據(jù)基因比對信息，統(tǒng)計覆蓋各個基因起始至終止的reads數(shù)量。基因表達定量使用的是FPKM方法^［21］。對各樣本所有基因表達量進行計算后，進行主成分分析（PCA）^［22］。之后采用統(tǒng)計學分析其表達數(shù)據(jù)，獲得假設(shè)檢驗概率（P值）和多重假設(shè)檢驗校正FDR值（P_adj值），篩選不同狀態(tài)下各樣本表達差異顯著的基因。篩選標準為|log₂（FoldChange）|gt;1.0且P_adj≤0.05^［23］。

1.6 差異基因韋恩圖與富集分析

利用諾禾云平臺制作各比較組合韋恩圖。采用R包clusterProfile對差異基因集進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，顯著性富集閾值為P_adj值小于0.05^［24］。分別選取GO富集與KEGG富集最顯著的30個通路和20個通路制作散點圖。

1.7 熒光定量PCR分析

選擇抗感枯萎病黃瓜材料接菌后96 h（R21A130_96 h vs S9930_96 h）中差異顯著且表達量較高的13個差異基因為候選基因進行熒光定量PCR。采用Primer 5.0設(shè)計引物，參考前人報道信息設(shè)計內(nèi)參引物^［25］。試驗采用的RNA樣本由測序公司返回，cDNA反轉(zhuǎn)錄與RT-qPCR程序參考天根生化科技有限公司試劑盒，設(shè)置3次重復。采用2^-ΔΔC_T法計算基因相對表達量，使用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜抗感枯萎病材料表型鑒定

由表1可知，中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所鑒定結(jié)果表明，21A130平均病情指數(shù)為0.0，表現(xiàn)為高抗，9930平均病情指數(shù)為51.8，表現(xiàn)為感病。且自主鑒定與委托鑒定結(jié)果一致，說明本研究的抗感枯萎病材料表型穩(wěn)定，可用于黃瓜枯萎病抗性轉(zhuǎn)錄組分析。

2.2 黃瓜枯萎病轉(zhuǎn)錄組樣本表型分析

由圖1可知，4個樣本（R21A130_0 h、R21A130_96 h、S9930_0 h、S9930_96 h）中，抗病材料接菌后0、96 h病情等級均為0級，感病材料接菌后0 h病情等級為0級，接菌后96 h病情等級為4級（參考“1.2”節(jié)黃瓜枯萎病鑒定標準）。由此可知，接菌后96 h的黃瓜枯萎病抗感材料表型差異明顯。

2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

結(jié)果表明，分別在12個樣本（R21A130_0 h_1、R21A130_0 h_2、R21A130_0 h_3、R21A130_96 h_1、R21A130_96 h_2、R21A130_96 h_3、S9930_0 h_1、S9930_0 h_2、S9930_0 h_3、S9930_96 h_1、S9930_96 h_2、S9930_96 h_3）中獲得54.93、53.30、48.28、46.83、42.83、46.07、44.61、47.78、45.83、44.68、48.79、58.74 Mb的有效數(shù)據(jù)（表2）。有效數(shù)據(jù)比對到外顯子區(qū)域比例較高（86.49%），比對到內(nèi)含子區(qū)域的reads比例極低（6.17%），比對到基因區(qū)間的reads比例較低（7.34%），說明比對結(jié)果具有可靠性（圖2）。

2.4 基因定量分析

由圖3可知，組內(nèi)樣本R21A130_0 h_1與R21A130_0 h_2與R21A130_0 h_3、R21A130_96 h_1與R21A130_96 h_2與R21A130_96 h_3、S9930_0 h_1與S9930_0 h_2與S9930_0 h_3、S9930_96 h_1與S9930_96 h_2與S9930_96 h_3的相對表達量關(guān)系較近，而組間樣本R21A130_0 h、R21A130_96 h、S9930_0 h、S9930_96 h的相對表達量關(guān)系較遠。由此可見，抗、感黃瓜枯萎病材料在基因表達水平上有顯著差異，相同枯萎病抗性的材料不同時期的基因表達水平也具有顯著差異。3次重復皮爾遜相關(guān)系數(shù)r²均大于0.92（圖4），PCA分析發(fā)現(xiàn)，組間樣本R21A130_0 h、R21A130_96 h、S9930_0 h、S9930_96 h 分散，組內(nèi)樣本R21A130_0 h_1與R21A130_0 h_2與R21A130_0 h_3、R21A130_96 h_1與R21A130_96 h_2與R21A130_96 h_3、S9930_0 h_1與S9930_0 h_2與S9930_0 h_3、S9930_96 h_1與S9930_96 h_2與S9930_96 h_3分別聚在一起，說明樣本選擇合理，試驗數(shù)據(jù)可靠（圖5）。

2.5 差異基因鑒定與韋恩圖分析

按照顯著差異表達基因篩選標準（DESeq2，P_adjlt;0.05，|log₂FoldChange|gt;1.0），發(fā)現(xiàn)不同表型的材料接菌后0 h（R21A130_0 h vs S9930_0 h）的根部差異基因數(shù)量較多（上調(diào)596，下調(diào)1 274），接菌后 96 h（R21A130_96 h vs S9930_96 h）的根部差異基因數(shù)量較少（上調(diào)263，下調(diào)347），前者差異基因的數(shù)量是后者的3.1倍。相同表型的材料接菌后96、0 h的差異基因數(shù)量多，抗病材料（R21A130_0 h vs R21A130_96 h）：上調(diào)3 090，下調(diào)2 399；感病材料（S9930_0 h vs S9930_96 h）：上調(diào)2 586，下調(diào)2 348。這些差異基因與植物抗病性有關(guān)（圖6）?？垢胁牧宵S瓜接菌后0 h和接菌后96 h 2對比較組（R21A130_0 h vs S9930_0 h與R21A130_96 h vs S9930_96 h）中，共有552個共同的差異基因，分別有5 361個和638個特異于接菌后0 h和接菌后 96 h 的比較組中。不同接菌時期抗感材料的2對比較組（R21A130_0 h vs R21A130_96 h與S9930_0 h vs S9930_96 h）中，共有6 173個共同的差異基因，分別有3 876個和2 686個特異于抗病材料和感病材料的比較組中。綜合4對比較組，鑒定到共有66個差異基因特異于抗感黃瓜枯萎病材料接菌后96 h的根部，暗示這些基因與黃瓜抗枯萎病差異性狀調(diào)控相關(guān)（圖7）。

2.6 差異基因富集分析

為了更深入對黃瓜枯萎病抗性相關(guān)基因進行鑒定，選擇最大表型差異的接種后96 h抗感樣品（R21A130_96 h vs S9930_96 h）進行數(shù)據(jù)分析。GO富集分析結(jié)果表明，差異基因主要富集在應激反應（GO：0050896）、逆境反應（GO：0006950）、四吡咯結(jié)合（GO：0046906）、鐵離子結(jié)合（GO：0005506）、轉(zhuǎn)運活性（GO：0005215）、氧化還原酶活性（GO：0016705）、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（GO：0022857）等條目上（圖8）。KEGG富集分析顯示，差異基因主要富集在苯丙烷生物合成（csv00940）、植物激素信號轉(zhuǎn)導（csv04075）、MAPK信號轉(zhuǎn)導（csv04016）、氨基酸生物合成（csv01230）、碳代謝（csv01200）、植物病原菌互作（csv04626）等通路上（圖9）。

通過DEGs富集在KEGG通路上的情況發(fā)現(xiàn)，苯丙烷生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導、氨基酸生物合成、MAPK信號通路、碳代謝、植物病原菌互作等通路上的基因顯著上調(diào)或下調(diào)表達。其中，各通路參與的DEGs中，苯丙烷生物合成通路包括CsCCR1、CsPALY、CsPER10、CsC84A1、CsPER4、CsPERN、CsPER1、Cs4CLL9、CsPER7、CsPER21、CsPER47、CsPER5、CsPER51和CsBBE15；植物激素信號轉(zhuǎn)導通路包括CsAHP4、CsLAX2、CsSAU72、CsAI5L2、CsTGA9、CsP2C75、CsLAX1、CsPYL4、CsGH31、CsSAU50和CsPRB1；氨基酸生物合成通路包括CsTD1、CsAROF、CsDAPAT、CsCYSK、CsKPRS1、CsPGK、CsTHA1和CsSAT1；MAPK信號轉(zhuǎn)導通路包括CsCHI2、CsP2C75、CsPYL4、CsPRB1和CsCHIL；碳代謝信號轉(zhuǎn)導通路包括CsHXK2、CsTD1、CsCYSK、CsKPRS1、CsPGK、CsACO12、CsSAT1和CsKPRS1；植物病原菌互作通路包括CsCNGC4、CsCML18、CsCNGC2、CsKCS12和CsPRB1（表3）。

2.7 RT-qPCR驗證

對黃瓜枯萎病抗感材料接菌后0、96 h的FPKM值進行分析，選取13個差異倍數(shù)較大的候選基因，包括MAPK信號通路相關(guān)基因CsCHI，激酶基因CsNADKC、CsMIK2、CsLRKS5，轉(zhuǎn)移酶基因CsO-FTFP、CsZOX、CsOMT3，轉(zhuǎn)錄因子CsMYB62，細胞色素基因CsC82A3，多聚半乳糖醛酸酶基因CsPGLR，以及各類蛋白基因CsAAPI、CsRLP20、CsNAC30。對這13個候選基因進行RT-qPCR 驗證，引物序列見表4。結(jié)果表明，所有DEGs相對表達量與RNA-seq表達量趨勢一致，測序結(jié)果可靠（圖10）。

3 討論

在本研究中，挖掘出13個黃瓜枯萎病抗性候選基因。其中，CsMIK2調(diào)控MDIS1相互作用的受體樣激酶，在真菌誘導劑中具有關(guān)鍵作用^［26］。CsLRKS5調(diào)控L型含有凝集素結(jié)構(gòu)域的受體激酶，由于其細胞外結(jié)構(gòu)域和凝集素蛋白相似，而凝集素蛋白可以與真菌和細菌壁的成分結(jié)合，因此推測該激酶參與了植物對病原菌的響應^［27］。CsZOX調(diào)控玉米素O-木糖基轉(zhuǎn)移酶，參與了廣泛的生理學過程，其中包括激素調(diào)節(jié)、次生代謝、抗逆反應、脫毒反應等等^［28］。CsO-FTFP調(diào)控O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，研究表明O-巖藻糖基化在植物抗病方面具有重要作用^［29］。CsOMT3調(diào)控O-甲基轉(zhuǎn)移酶，可以催化類黃酮合成O-甲基化衍生物，在植物根瘤固氮等進程及抗蟲、抗病等抗逆反應中具有重要作用^［30］。CsPGLR調(diào)控多聚半乳糖醛酸酶，可降解果膠并分解細胞壁結(jié)構(gòu)，與病原物防御有關(guān)^［31］。CsRLP20調(diào)控富亮氨酸重復N端結(jié)構(gòu)域，可能參與植物抗逆性反應，發(fā)育調(diào)控及激素的信號轉(zhuǎn)導等過程，LRR家族蛋白可能對黃瓜抗枯萎病產(chǎn)生一定作用^［32］。轉(zhuǎn)錄因子CsMYB62參與調(diào)控植物的初生和次生代謝過程以及響應生物和非生物脅迫等，包括高溫、干旱等限制植物生長的環(huán)境因素，植物為了生存會在轉(zhuǎn)錄水平到代謝水平做出快速反應^［33］。CsNAC30調(diào)控NAC結(jié)構(gòu)域蛋白，參與包括次生壁的形成、細胞分裂、生長發(fā)育、衰老以及生物與非生物逆境反應等多個過程^［34］。CsCHI調(diào)控幾丁質(zhì)酶，已有研究表明，CsChi23可增強黃瓜枯萎病抗性，可抗真菌病害^［18］。CsAAPI調(diào)控天冬氨酸蛋白酶抑制劑，天冬氨酸蛋白酶在擬南芥中具有抗病作用^［35］。CsNADKC調(diào)控鈣調(diào)素-鈣依賴性NAD激酶，該蛋白激酶與植物抗逆性有一定關(guān)系^［36］。CsC82A3調(diào)控細胞色素P450 82A3，可保護生物體免受有毒化合物的侵害^［37］。

本研究鑒定的候選基因中，CsCHI、CsMIK2、CsLRKS5、CsZOX、CsO-FTFP、CsOMT3、CsPGLR、CsRLP20、轉(zhuǎn)錄因子MYB62、CsNAC30顯著上調(diào)表達，CsAAPI與CsNADKC顯著下調(diào)表達，CsC82A3下調(diào)表達，以上基因在調(diào)控黃瓜枯萎病抗病性方面可能發(fā)揮重要作用。特別是上調(diào)表達的CsCHI基因與前人報道的黃瓜抗枯萎病基因CsChi23均調(diào)控幾丁質(zhì)酶的合成^［18］，CsCHI在抗黃瓜枯萎病根部的表達量較高于感病材料表達量，在抗、感枯萎病材料（R21A130_96 h vs S9930_96 h）中表達差異倍數(shù)達到了35.4倍，該基因主要通過調(diào)控幾丁質(zhì)酶的合成來減少真菌生物量積累，增強抗性。此外，在接菌后96 h下調(diào)表達的CsAAPI在抗黃瓜枯萎病的根部（R21A130_0 h）表達量較低，而在感病材料的根部（S9930_0 h）該基因表達量較高；在抗、感枯萎病材料（R21A130_96 h vs S9930_96 h）中表達差異倍數(shù)達到了8.3倍，該基因調(diào)控天冬氨酸蛋白酶抑制劑，天冬氨酸蛋白酶已報道在擬南芥中具有抗病作用。在調(diào)控黃瓜枯萎病抗病性方面，這2個基因可能發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果為黃瓜枯萎病抗病性相關(guān)基因的挖掘與黃瓜抗枯萎病分子育種提供了理論依據(jù)。

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