雙氫青蒿素對(duì)甲狀腺未分化癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響

【摘要】目的 觀察雙氫青蒿素（DHA）對(duì)甲狀腺未分化癌（ATC）細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響，為臨床提供參考。方法 取人ATC細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，分為對(duì)照組與DHA組，其中DHA組根據(jù)DHA干預(yù)劑量不同，分為5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA亞組。觀察DHA對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)試劑盒-8（CKK-8）、Transwell小室檢測(cè)DHA對(duì)ATC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響；以流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)DHA對(duì)ATC細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24 、48 、72 及96 h后，對(duì)照組ATC細(xì)胞正常生長(zhǎng)，5、10和20 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，40、80和160 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞密度變得明顯稀疏，出現(xiàn)細(xì)胞離壁，腫脹，胞膜和胞體破裂分解，細(xì)胞死亡等情況。10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24 、48 及72 h后，ATC細(xì)胞的吸光度（OD）值均低于對(duì)照組，5 μmol/L DHA組藥液作用48 、72 h后，ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組（均P<0.05）。5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組（均P<0.05）。5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞晚期凋亡率均高于對(duì)照組（均P<0.05）；5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）；40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率均高于對(duì)照組（均P<0.05）。結(jié)論 DHA可明顯抑制ATC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移并誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制ATC的作用。

【關(guān)鍵詞】雙氫青蒿素；甲狀腺未分化癌細(xì)胞；增殖；侵襲；遷移；凋亡

【中圖分類號(hào)】R736.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.22.0029.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.22.010

甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）惡性程度高，腫瘤生長(zhǎng)速度快，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后較差。有研究顯示，ATC發(fā)病率有升高趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重威脅患者生命安全。近年來(lái)，有關(guān)ATC治療方案不斷優(yōu)化，但仍有部分ATC患者出現(xiàn)攝碘能力異常，表現(xiàn)出極強(qiáng)的細(xì)胞侵襲性和較高的轉(zhuǎn)移率，嚴(yán)重影響治療效果[2]。因此，積極研發(fā)新的ATC治療藥物對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。雙氫青蒿素（DHA）是采用硼氫化納將青蒿素還原而生成的一種衍生物，具有強(qiáng)大的抗瘧作用，既往多用于寄生蟲(chóng)病的治療中，已成為治療惡性瘧疾的特效藥，此外，DHA還具有生物利用度高、毒性較低、吸收快、排泄迅速和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[3]。隨著臨床應(yīng)用推廣和研究深入，有研究顯示，DHA具有抗腫瘤作用，在肝癌、肺癌和腸癌等惡性腫瘤中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果[4-5]。但有關(guān)DHA在ATC中的應(yīng)用還較為少見(jiàn)?；诖?，本研究觀察DHA對(duì)人ATC細(xì)胞的作用效果，初步探討DHA對(duì)ATC的治療作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 人ATC細(xì)胞株（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，批號(hào)：YJ-h443）；WE培養(yǎng)基[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：12551032]和胎牛血清[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：A5669701]，0.22 μm微孔濾膜，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（6孔、12孔、24孔和96孔等），細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)試劑盒（CKK）-8（山東思科捷生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：CT0001-B）、二甲基亞砜（DMSO）（北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：D8371）、曲拉通X-100（Sigma-aldrich，型號(hào)：T8787），Transwell小室（美國(guó)Costar公司，型號(hào)：CLS3422），Matrigel基質(zhì)膠（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，型號(hào)：C0396）和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒（碧迪生物科學(xué)公司，型號(hào)：556547）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及含藥培養(yǎng)基的配制 ATC細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇后接種在含有100 mL/L胎牛血清的WE培養(yǎng)基中（含青霉素100 kU/L，鏈霉素100 mg/L），常規(guī)培養(yǎng)、消化、傳代；實(shí)驗(yàn)均用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。電子天平稱取DHA溶于DMSO，配制各藥物濃度分別為5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾、分裝后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 觀察DHA對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響 在37 ℃、5% CO2的條件下，ATC細(xì)胞培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；培養(yǎng)24 h后移除細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液各30 μL，培養(yǎng)24、48、72、96 h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 DHA對(duì)ATC細(xì)胞增殖的抑制作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ATC細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，配制成3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取100 μL的ATC細(xì)胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板（3×103個(gè)/孔），經(jīng)24 h培養(yǎng)使其貼壁，移除細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液，培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10 μL CKK溶液，于37 ℃下作用4 h，采用酶標(biāo)儀（北京宏潤(rùn)達(dá)科技發(fā)展有限公司，京械注準(zhǔn)20162220432，型號(hào)：ZS-2）于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度（OD）值。

1.2.4 DHA對(duì)ATC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATC細(xì)胞的侵襲能力。于4 ℃解凍Matrigel過(guò)夜，采用細(xì)胞培養(yǎng)液WE按1∶5稀釋，平鋪在Transwell小室的濾膜上，50 μL/膜，于37 ℃放置30 min，便于基底膜膠發(fā)生凝固，采用生理鹽水浸浴水化小室膜30 min待用。于Transwell下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，DHA組上室分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液400 μL，對(duì)照組上室加入無(wú)DHA藥物的血清WE培養(yǎng)基溶液400 μL，培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室面的細(xì)胞，固定，采用1 g/L的結(jié)晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：CR202211004766）染色，在的生物顯微鏡[蔡司科技（蘇州）有限公司，蘇械注準(zhǔn)20202220363，型號(hào)：Axiolab 5]（200×）下觀察并拍照，并隨機(jī)挑選6個(gè)視野進(jìn)行穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATC細(xì)胞的遷移能力，操作步驟參照Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，除Transwell小室的上室底部不鋪設(shè)基質(zhì)膠外，其余的操作步驟和方法均相同。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)ATC細(xì)胞凋亡結(jié)果 采用雙熒光標(biāo)記法檢測(cè)不同濃度DHA藥液作用后的ATC細(xì)胞的凋亡情況。具體步驟按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每組取1 mL細(xì)胞懸液分別加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI混勻后避光標(biāo)記10 min，采用流式細(xì)胞儀（碧迪公司，型號(hào)：BD FACSCalibur）進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。凋亡率=象限內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞。

1.3 觀察指標(biāo) ⑴分析DHA 對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響。⑵分析DHA 對(duì) ATC細(xì)胞增殖的抑制作用。⑶分析DHA對(duì)ATC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。⑷觀察DHA對(duì)ATC細(xì)胞凋亡的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以（x）表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，其兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHA對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48、72及96 h后，對(duì)照組ATC細(xì)胞正常生長(zhǎng)，5、10和20 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，40、80和160 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞密度變得明顯稀疏，出現(xiàn)細(xì)胞離壁，腫脹，胞膜和胞體破裂分解，細(xì)胞死亡等情況。

2.2 DHA對(duì)ATC細(xì)胞增殖的抑制作用 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48 及72 h后，ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組，5 μmol/L DHA組藥液作用48、72 h后，ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3 DHA對(duì)ATC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表2。

2.4 DHA對(duì)ATC細(xì)胞凋亡的影響 5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞晚期凋亡率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

ATC的兩大標(biāo)志性惡性生物學(xué)行為包括血管生成和組織侵襲，是造成ATC預(yù)后極差的原因之一，主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng)、較早發(fā)生致命性的局部侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。DHA是倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有強(qiáng)大的抗瘧作用，還可抑制腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)，下調(diào)絲裂素活化蛋白激酶、胞外信號(hào)調(diào)控激酶等信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，既往已有多項(xiàng)報(bào)道證實(shí)DHA對(duì)肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤具有抑制作用[7-8]，這為臨床抗癌新藥的研發(fā)提供方向。但有關(guān)DHA在ATC中的應(yīng)用還較為少見(jiàn)。因此，本研究觀察DHA對(duì)人ATC細(xì)胞的作用效果，分析DHA對(duì)ATC的治療作用。

本研究結(jié)果顯示，10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48、72及96 h后，對(duì)照組ATC細(xì)胞正常生長(zhǎng)，5、10和20 μmol/L DHA組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，40、80和160 μmol/L DHA組細(xì)胞密度變得明顯稀疏，出現(xiàn)細(xì)胞離壁，腫脹，胞膜和胞體破裂分解，細(xì)胞死亡等情況。這提示DHA對(duì)ATC細(xì)胞具有毒性作用，隨著DHA濃度的增加，ATC細(xì)胞的形態(tài)變化越明顯，細(xì)胞死亡率也越高。分析原因?yàn)?，DHA可能通過(guò)干擾鐵代謝、促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化、調(diào)控信號(hào)通路和改變基因表達(dá)等機(jī)制，誘導(dǎo)ATC細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，從而改變其形態(tài)[9]。本研究結(jié)果顯示，10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48 及72 h后，ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組，5 μmol/L DHA組藥液作用48、72 h后，ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組；5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組，這提示DHA可顯著抑制ATC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。分析原因?yàn)?，凋亡和壞死是?xì)胞死亡的方式，細(xì)胞凋亡是機(jī)體發(fā)育過(guò)程中基因調(diào)控下的細(xì)胞程序性死亡，惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征為細(xì)胞的凋亡受阻和過(guò)度細(xì)胞增殖[10]。DHA能阻斷Wnt/β-catenin蛋白信號(hào)通路，并增強(qiáng)糖原合酶激酶的催化活性，抑制甲狀腺腫瘤細(xì)胞分化、增殖。此外，DHA可與ATC細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子結(jié)合，直接破壞ATC細(xì)胞，抑制ATC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[11]。本研究結(jié)果顯示，5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞晚期凋亡率均高于對(duì)照組；5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率均高于對(duì)照組，這提示DHA可誘導(dǎo)ATC細(xì)胞凋亡。分析原因?yàn)?，DHA能抑制核因子κB（NF-κB）蛋白表達(dá)，破壞腫瘤細(xì)胞膜與蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)DNA損傷，進(jìn)而抑制腫瘤血管生長(zhǎng)，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡目的，且DHA抗腫瘤作用可能具有劑量依賴性[12]。這也證實(shí)DHA有望成為甲狀腺未分化癌治療藥物，但其具體機(jī)制和臨床應(yīng)用還有待今后深入探討。

綜上所述，DHA可明顯抑制ATC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力并誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制甲狀腺腫瘤的作用。

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