清肺咳合劑薄層鑒別及甘草苷含量測定方法的研究

【摘 要】 目的：建立清肺咳合劑的薄層鑒別和含量測定方法，以提升制劑的質(zhì)量標準。方法：采用TLC法定性鑒別制劑中的魚腥草、甘草流浸膏；采用UPLC法測定制劑中甘草苷的含量，色譜柱為 Acquity HSS T3色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm），流動相為甲醇0.5%冰乙酸溶液梯度洗脫，柱溫35 ℃，進樣體積5 μL，流速為0.25 mL/min，檢測波長為276 nm。結(jié)果：制劑中魚腥草、甘草流浸膏的 TLC特征斑點顯色清晰，分離度良好，陰性對照無干擾。甘草苷在1.90～95.1μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 5，n=6）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于 3.0%；平均加樣回收率為96.1%，相應(yīng)的RSD為1.2%。對8批樣品中甘草苷的含量進行測定，結(jié)果為51.0～70.7 μg/mL。結(jié)論：該方法操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠、專屬性和重復性均較好，可用于清肺咳合劑的質(zhì)量標準提升。

【關(guān)鍵詞】 清肺咳合劑；薄層色譜法；超高效液相色譜法；甘草苷；質(zhì)量標準

【中圖分類號】R284.1

【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2024）20-0051-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.20.zgmzmjyyzz202420011

Study on Thin Layer Identification and Determination of Glycyrrhizin Content of Qingfei Ke Mixture

CHEN Yu1，2 HUANG Zhongliang3* CHEN Tingting1，2 HUANG Yi1，2 WU Guangmei1，2 LU Aiyu1，2 LU Senhua1，2

1.Yulin Center For Food and Drug Control，Yulin 537000，China;

2.Yulin Chinese Medicinal Materials （Containing Aromatic Materials） Quality Detection and Evaluation Engineering

Technology Research Center，Yulin 537000，China；

3.Guangxi Testing Center For Medical Devices， Nanning 530001，China

Abstract：Objective To establish a TLC identification and content determination method for Qingfeike Mixture to improve the quality standard of the preparation.Methods TLC was used to qualitatively identify the Houttuynia cordata and liquorice extracts in the preparation.UPLC was used to determine the content of liquiritin in the preparation.The chromatographic column was Acquity HSS T3 column （2.1 × 100 mm，1.8 μm），the mobile phase was methanol-0.5% glacial acetic acid solution gradient elution，the column temperature was 35 °C，the sample volume was 5 μL，the flow rate was 0.25 mL/min，and the detection wavelength was 276 nm. Results The TLC characteristic spots of Houttuynia cordata and liquorice extracts in the preparation showed clear color development，good resolution，and no interference from negative controls.The content of liquiritin was determined to be 1.90-95.1 μg/mL.The linear relationship between the concentration range of 0.05-1.00 g/mL and the peak area was good（r=0.9995，n=6）; the RSDs of precision，stability，and repeatability tests were all less than 3.0%; the average recovery rate was 96.1%，and the corresponding RSD was 1.2%.The content of liquiritin in 8 batches of samples was determined to be 51.0-70.7 μg/mL.Conclusion This method is simple to operate，the results are stable and reliable，and the specificity and repeatability are good.It can be used to improve the quality standard of Qingfeike Mixture.

Keywords：Qingfeike Mixture；TLC；UPLC；Glycyrrhiza；Quality Standard

醫(yī)療機構(gòu)制劑作為藥品市場的補充，具有生產(chǎn)批量小、配制品種多、供應(yīng)及時、使用周期短、價格低廉、臨床療效確切等特點，在保障臨床用藥、滿足醫(yī)療科研需求、傳承和發(fā)揚特色制劑等方面具有積極作用［1］。清肺咳合劑（批準文號：桂藥制字Z08060048）是根據(jù)貴港市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院老一輩中醫(yī)藥專家數(shù)十年臨床治療經(jīng)驗的而成的驗方，主要組成有魚腥草、甘草流浸膏等，具有清熱解毒、消炎鎮(zhèn)咳之功效，用于肺熱咳嗽等。清肺咳合劑現(xiàn)有質(zhì)量標準只有相對密度測定等，其他符合《中國藥典》四部合劑項下的各項規(guī)定。與現(xiàn)行版《中國藥典》相比，存在水平較低、質(zhì)量標準缺項比較多、檢驗方法落后等情況，起不到控制制劑質(zhì)量的作用，無法滿足當前國家對制劑質(zhì)量控制的新要求，無法保證臨床用藥的安全性和有效性。因此，本研究結(jié)合文獻報道的質(zhì)量評價方法和《中國藥典》2020年版一部魚腥草和甘草流浸膏質(zhì)量標準項下的有關(guān)方法［2］，在現(xiàn)有質(zhì)量標準的基礎(chǔ)上，采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的魚腥草［3-6］、甘草流浸膏［7-10］進行定性鑒別；采用超高效液相色譜（UPLC）法測定制劑中甘草苷的含量［11-15］，為清肺咳合劑質(zhì)量標準的提升提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1290超高效液相色譜儀（配置DAD檢測器，美國安捷倫公司）；XS-205Du十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；Arium pro超純水儀（賽多利斯公司）；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；超SB3200-T聲波清洗器（上海必能信超聲波有限公司）；CXP-100多功能粉碎機（上海市晟喜制藥機械有限公司）；CHT210R高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；ATS4薄層色譜全自動點樣儀（瑞士卡瑪公司）；Visualizer薄層色譜成像儀（瑞士卡瑪公司）。

1.2 材料 甘草苷對照品（批號：111610-201908）、甘草對照藥材（批號：120904-22021）和魚腥草對照藥材（批號：121046-201607）均為中國食品藥品檢定研究院提供；實驗所用甲醇（默克股份兩合公司）和甲酸（天津市光復精細化工研究所）均屬于色譜純試劑；濃氨水（廣東光華科技股份有限公司）、鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司）、乙醚（國藥集團化學試劑有限公司）、乙酸乙酯（西隴科學股份有限公司）、丙酮（成都市科隆化學品有限公司）、無水乙醇（廣東光華科技股份有限公司）、乙醇（廣東光華科技股份有限公司）均為分析純試劑；實驗用水為超純水。8批清肺咳合劑樣品來源于貴港市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院，樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 魚腥草TLC鑒別 取樣品40 mL，加入氫氧化鈉試液4 mL，用乙酸乙酯40 mL萃取2次，合并有機相，蒸干，殘渣用2 mL甲醇溶解，作為供試品溶液［3-4］。取魚腥草對照藥材0.5 g，加甲醇15 mL，超聲處理30 min，濾過，殘渣加甲醇10 mL重復提取1次，合并濾液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為對照藥材溶液。稱取除魚腥草外的其余藥材，制備陰性樣品，取40 mL，加入氫氧化鈉試液4 mL，用乙酸乙酯40 mL萃取2次，合并有機相，蒸干，殘渣用2 mL甲醇溶解，作為陰性對照溶液。根據(jù) 2020年版《中國藥典（四部）》通則 0502 TLC 法試驗要求，分別吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（4∶3∶1∶0.5，V/V/V/ V）為展開劑，展開后取出晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視［5-6］。在供試品色譜中，與魚腥草對照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同的橙黃色熒光斑點，且陰性對照沒有產(chǎn)生干擾。結(jié)果如圖1所示。

2.1.2 甘草流浸膏TLC鑒別 取樣品40 mL放置于分液漏斗中，用乙酸乙酯40 mL萃取2次，將萃取后的有機相合并，蒸干，殘渣用2 mL甲醇溶解，作為供試品溶液［7］。取甘草對照藥材0.5g，加入乙醚15 mL，超聲處理20 min，濾過，棄去濾液后，取殘渣加入甲醇20 mL，再次超聲處理20 min，取濾液蒸干后，殘渣用甲醇2 mL溶解，作為對照藥材溶液［8］。另外，取甘草苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。除了甘草流浸膏之外，稱取其他藥材，制備陰性樣品。取40 mL置于分液漏斗中，用乙酸乙酯40 mL萃取兩次，合并有機相，蒸干，殘渣用2 mL甲醇溶解，作為陰性對照溶液。根據(jù) 2020年版《中國藥典（四部）》通則 0502 TLC 法試驗要求，分別吸取上述供試品溶液、對照品、對照藥材溶液及陰性對照溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，使用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶2∶2，V/V/V/ V）作為展開劑，將薄層板展開后取出晾干，噴10%硫酸乙醇并置紫外光燈（254 nm）下檢視［9］。在供試品色譜中，與甘草苷對照品、甘草對照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同的熒光斑點，且陰性對照沒有產(chǎn)生干擾。結(jié)果如圖2所示。

2.2 HPLC法測定甘草苷含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：甲醇-0.5%冰乙酸溶液梯度洗脫，具體的梯度洗脫程序見表2；柱溫：35 ℃；進樣體積：5 μL；流速：0.25 mL/min；檢測波長：276 nm。

2.2.2 溶液制備 精密量取樣品1.0 mL置50 mL離心管中，加入10 mL乙醚，振蕩10 min，渦旋1 min，以4000 r/min離心5 min，除去上清液，下層水相加入10 mL乙酸乙酯，振蕩10 min，渦旋1 min，以4000 r/min離心5 min，取上清液，下層水相再用10 mL乙酸乙酯提取1次，合并上清液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中，定容并搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.22微孔的濾膜，即得供試品溶液［10-12］。精密稱取甘草苷20.43 mg至20 mL容量瓶中，加甲醇進行溶解并定容，搖勻，作為甘草苷對照品儲備液，精密量取4.0 mL至20 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得甘草苷對照品溶液（每1 mL中含甘草苷190.2 μg）。按照處方比例和工藝，稱取除甘草流浸膏外的其余藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺甘草流浸膏的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗 將2.2.2項下甘草苷對照品溶液、清肺咳合劑供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。在清肺咳合劑供試品中，相應(yīng)的色譜峰與甘草苷對照品色譜峰保留時間一致，理論板數(shù)按甘草苷計大于9000，陰性對照品溶液在與甘草苷對照品相同保留時間處無干擾峰，分離度大于 1.5。表明該方法專屬性良好。色譜如圖3～5所示。

2.2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取甘草苷對照品溶液（質(zhì)量濃度為190.2 μg/mL）0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL至10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以目標峰的峰面積（Y）為縱坐標，甘草苷對照品溶液濃度為橫坐標（X，mg/ mL），進行線性回歸，得回歸方程 Y=35.0232x-42.7754，（r=0.9995，n=6），結(jié)果表明，甘草苷在1.90～95.1 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.3.3 精密度試驗 分別精密吸取甘草苷對照品溶液5 μL，按“2.2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次測定，結(jié)果顯示，甘草苷的峰面積平均值為1572.5，相應(yīng)的RSD為0.1%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批樣品（編號：S6）1份，按 “2.2.2” 項下方法制備清肺咳合劑供試品溶液，分別于室溫下放置0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h后，以“2.2.1”項下條件進樣測定，記錄色圖譜。結(jié)果顯示：甘草苷峰面積的平均值為580.8，相應(yīng)的RSD為2.0%（n=6），表明清肺咳合劑供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.5 重復性試驗 取樣品（編號：S6）6份，按 2. 2. 2 項下方法制備清肺咳合劑供試品溶液，再以“2.2.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄色圖譜并計算樣品中甘草苷的含量。結(jié)果顯示：甘草苷含量的平均值為70.91 μg/ mL，相應(yīng)的RSD為1.65%（n=6），表明本法重復性良好。

2.2.3.6 加樣回收試驗 精密量取已測定含量的S6號樣品9份（每1 mL中含甘草苷70.91 μg），每份0.5 mL，分別精密加入甘草苷對照品溶液（質(zhì)量濃度為190.2 μg /mL）各0.2 mL，按“2.2.2”項下的方法制備清肺咳合劑加樣回收樣品溶液，按“2.2.1”項下方法分別進樣5 μL進行測定，記錄加樣回收樣品溶液中甘草苷的峰面積并計算回收率，結(jié)果見表3，平均回收率為96.1%，相應(yīng)的RSD為1.2%（n=6）。

2.2.4 樣品含量測定

取8批次清肺咳合劑樣品，按 2. 2. 2項下方法制備清肺咳合劑供試品溶液，并按 2. 2. 1 項下色譜條件進樣測定，每批平行測定3次。記錄色圖譜并計算樣品中甘草苷的含有量。結(jié)果見表4。

3 討論

在預(yù)試驗中，課題組對多種藥材進行了TLC鑒別考察，包括魚腥草、杠板歸、甘草流浸膏和遠志酊等。然而，杠板歸、遠志酊等藥材的TLC鑒別陰性樣品存在較大干擾，無法通過調(diào)整展開劑、顯色劑和供試品的制備方法等予以排除，因此未列入正文。經(jīng)過對比和篩選，課題組發(fā)現(xiàn)魚腥草和甘草流浸膏的TLC鑒別具有專屬性強、分離良好、斑點顯色清晰的特點，因此增加了魚腥草和甘草流浸膏的TLC鑒別進行質(zhì)量控制，完善了清肺咳合劑的質(zhì)量標準。

在確定魚腥草的鑒別方法時，考慮到《中國藥典》2020年版一部中規(guī)定的揮發(fā)油鑒別方法可能不適用于清肺咳合劑的水煎煮法制備過程。為了排除雜質(zhì)干擾并富集黃酮類成分［4］，實驗中采用了加入稀堿增加溶解度后用乙酸乙酯萃取的方法。展開劑的組成及配比也經(jīng)過反復試驗［4-5］，分別考察了環(huán)己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（4∶3∶1∶0.5，V/V/V/ V）、環(huán)己烷-乙酸乙酯（9∶1，V/V）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1，V/V/V）。該方法具有特征性強、操作簡單等優(yōu)點，可作為清肺咳合劑中魚腥草的定性鑒別方法。

在選擇甘草流浸膏的指標成分時，實驗中考慮了《中國藥典》2020年版一部中規(guī)定的甘草酸銨和甘草酸作為指標成分。然而，實驗中發(fā)現(xiàn)樣品溶液中甘草酸銨的斑點并不明顯且分離效果也不好、靈敏度低。因此，改用了甘草苷作為TLC色譜鑒別指標成分。同時，在高效液相色譜法含量測定中，也發(fā)現(xiàn)以甘草酸為指標成分無法通過系統(tǒng)適用性及專屬性試驗，因此也改用了甘草苷作為指標成分進行含量測定。

清肺咳合劑臨床應(yīng)用廣泛，療效確切，但其現(xiàn)行質(zhì)量標準存在一定的問題，如水平較低、質(zhì)量標準缺項較多、檢驗方法落后等。因此，對其進行質(zhì)量標準提升研究具有重要的現(xiàn)實意義和必要性。通過選擇方中魚腥草和甘草流浸膏作為薄層鑒別指標，以及以甘草苷作為指標用高效液相色譜法進行含量測定，可以顯著提高清肺咳合劑的質(zhì)量控制水平，確保其臨床用藥的安全性和有效性。此外，這些方法還具有專屬性強、靈敏度高等優(yōu)點，能夠更好地反映制劑的質(zhì)量狀況。因此，對清肺咳合劑進行質(zhì)量標準提升研究具有重要的現(xiàn)實意義和必要性。

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（收稿日期：2024-01-22 編輯：陶希睿）

基金項目：廣西科技基地和人才專項（No.桂科AD22080002）；廣西科技重大專項：廣西民族藥產(chǎn)業(yè)集群協(xié)同攻關(guān)與優(yōu)勢產(chǎn)品提質(zhì)增效研究（No.桂科AA23023035）；玉林市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（No.玉市科20220618）。

作者簡介：陳宇（1983—），男，漢族，研究生，副主任藥師，研究方向為食品藥品質(zhì)量評價與研究。E-mail：48499917@qq.com

通信作者：黃忠亮（1972—），男，壯族，高級工程師，研究方向為食品、藥品、化妝品及醫(yī)療器械檢驗檢測技術(shù)研究及開發(fā)、質(zhì)量監(jiān)督、實驗室管理。E-mail：185143773@qq.com