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    基于多肽親和介導(dǎo)定點(diǎn)偶聯(lián)策略的抗體元素標(biāo)簽的合成及單細(xì)胞分析應(yīng)用

    2024-11-24 00:00:00王蕾易立李華敏陳石楊利民嚴(yán)曉王秋泉
    分析化學(xué) 2024年10期
    關(guān)鍵詞:單細(xì)胞抗體

    關(guān)鍵詞 多肽親和標(biāo)記;定點(diǎn)偶聯(lián);抗體;元素標(biāo)簽;單細(xì)胞-電感耦合等離子體質(zhì)譜

    近年來,基于電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)的生物分析方法在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[1-11]。ICP-MS 可在痕量和超痕量濃度水平實(shí)現(xiàn)高靈敏的元素分析,具有多元素/同位素分析以及元素信號強(qiáng)度與化學(xué)形態(tài)無關(guān)等優(yōu)勢[12-13]。元素標(biāo)簽的信號響應(yīng)強(qiáng)度與每個元素標(biāo)簽所攜帶的金屬原子數(shù)量成正比,而納米顆??梢淮涡载?fù)載成千上萬的金屬原子,因此,納米顆粒是提高ICP-MS 生物測定靈敏度的有效載體之一,可實(shí)現(xiàn)對低豐度細(xì)胞標(biāo)記物的高靈敏度定量分析檢測[14-18]。

    抗體(Antibody),又稱免疫球蛋白G(Immunoglobulin, IgG),是一種由B 細(xì)胞產(chǎn)生的Y 形蛋白,能夠特異性識別并結(jié)合目標(biāo)分子,是最常用的靶向遞送載體之一。IgG 由兩條重鏈(Heavy chain)和兩條輕鏈(Light chain)構(gòu)成,表面含有多種溶劑可及性的反應(yīng)性氨基酸,例如賴氨酸和半胱氨酸等可用于化學(xué)修飾,是一種常用的制備元素標(biāo)簽的靶向分子[19-21]。

    目前,已經(jīng)發(fā)展了多種基于金屬螯合物、金屬聚合物和金屬納米粒子的抗體元素標(biāo)簽,并被應(yīng)用于生物分子特異性識別和高靈敏定量分析[22-23]。2001 年,張新榮研究組[24]首次報(bào)道了金屬穩(wěn)定同位素(Eu同位素)抗體元素標(biāo)簽,并實(shí)現(xiàn)了對促甲狀腺激素(TSH)的ICP-MS 定量分析。2011 年, Bendall 等[25]使用抗體聚合物元素標(biāo)簽,結(jié)合單細(xì)胞-質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù),成功實(shí)現(xiàn)了對免疫細(xì)胞高達(dá)34 個參數(shù)的高通量分析。金屬穩(wěn)定同位素標(biāo)記和絕對定量分析策略在高靈敏度檢測和多通道多參數(shù)生物分析等方面展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力,為生物分子研究和臨床診斷帶來了技術(shù)革新[26]。

    目前,抗體元素標(biāo)簽多采用隨機(jī)偶聯(lián)的方式制備,即通過抗體表面廣泛的游離氨基或者巰基,與目標(biāo)載體的反應(yīng)官能團(tuán)隨機(jī)碰撞,實(shí)現(xiàn)抗體與納米載體的共價偶聯(lián)[27-28]。這種隨機(jī)偶聯(lián)會導(dǎo)致抗體偶聯(lián)位點(diǎn)和偶聯(lián)比例的不可控。偶聯(lián)位點(diǎn)的不確定性可能會阻塞抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn),降低其特異性結(jié)合目標(biāo)的能力,影響元素標(biāo)簽的專一性和親和力;偶聯(lián)比例無法控制會導(dǎo)致制備的元素標(biāo)簽無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析,增加元素標(biāo)簽異質(zhì)性,影響標(biāo)簽的穩(wěn)定性。隨著Thiomab 工程、非天然氨基酸插入等技術(shù)的發(fā)展,研究者可采用這些技術(shù)實(shí)現(xiàn)抗體位點(diǎn)特異性偶聯(lián)[29-32]。但是,這些技術(shù)路線需要通過復(fù)雜的基因工程技術(shù),將具有反應(yīng)性的氨基酸引入到抗體的目標(biāo)位點(diǎn),技術(shù)要求高,生產(chǎn)過程周期長,并且價格昂貴。

    多肽介導(dǎo)的親和標(biāo)記技術(shù)是一種利用多肽作為橋梁,特異性地將標(biāo)記物結(jié)合到目標(biāo)生物分子(如蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞表面受體等)上的方法。Delano 等[33]通過建立環(huán)肽文庫,篩選出可與IgG 抗體的Fc 片段特異性結(jié)合的親和多肽Fc-Ⅲ(DCAWHLGELVWCT-NH2),并以2.7 ?的分辨率確定了Fc-Ⅲ肽與Fc 片段復(fù)合物的X 射線晶體結(jié)構(gòu),證明了Fc-Ⅲ肽與Fc 片段的CH2 和CH3 區(qū)域的交界面結(jié)合。在此基礎(chǔ)上, Kishimoto 等[34]結(jié)合之前的工作,通過空間結(jié)構(gòu)分析,確定了序列為GPDCAYHKGELVWCTFH 的環(huán)肽的第8 位賴氨酸與抗體Fc 片段的K248 位賴氨酸距離僅為6.1 ?,并在該多肽的第8位賴氨酸的氨基上修飾了一條碳鏈長度為7.1 ?、末端帶有甲基丙烯酸N-琥珀酰亞胺酯(N-Hydroxysuccinimide ester,NHS)的Linker。在親和標(biāo)記過程中,游離的親和多肽分子首先與抗體的CH2 和CH3 區(qū)域發(fā)生非共價特異性結(jié)合(圖1)。這種非共價的結(jié)合拉近了抗體上K248 的氨基和多肽上的NHS 酯之間的距離,從而使得氨基親和進(jìn)攻羰基,形成酰胺鍵,實(shí)現(xiàn)抗體的位點(diǎn)特異性偶聯(lián);然后,通過多肽上的馬來酰亞胺基團(tuán)與巰基化DNA 偶聯(lián),得到化學(xué)計(jì)量比為1∶1 的抗體-DNA 偶聯(lián)物;最后,通過IgG 與修飾了Eu 的MS2 蛋白納米顆粒[35-36]之間的DNA 雜交,實(shí)現(xiàn)元素標(biāo)簽的精準(zhǔn)組裝。這種元素標(biāo)簽制備技術(shù)可實(shí)現(xiàn)抗體的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)和化學(xué)計(jì)量比1∶1 的精確偶聯(lián),無需對抗體進(jìn)行工程改造,具備更強(qiáng)的通用性。本研究采用多肽介導(dǎo)的親和標(biāo)記技術(shù),實(shí)現(xiàn)了抗體與修飾稀土元素Eu 的MS2 衣殼蛋白納米顆粒定點(diǎn)偶聯(lián),構(gòu)建了一種高靈敏和高親和力的元素標(biāo)簽,并利用單細(xì)胞-電感耦合等離子體質(zhì)譜(Single cell inductively coupledplasma mass spectrometry, SC-ICP-MS)技術(shù)對此元素標(biāo)簽的專一性和靈敏度進(jìn)行了評價。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    LC-20AD高效液相色譜儀和LC-16P制備液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司);XBridge Protein BEH尺寸排阻色譜柱(SEC, 7.8 mm×300 mm, 3.5 μm,美國Waters公司);制備色譜柱C18(10 mm×150 mm, 5 μm,日本Shimadzu 公司);分析色譜柱C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm,日本Shimadzu 公司);NexION?2000 ICPMass Spectrometer(美國PerkinElmer公司);autoflex?maX基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDITOFMS,美國Bruker 公司);JEM1400 透射電鏡(日本JEOL 公司);PowerPac?基礎(chǔ)電泳儀電源、Mini-PROTEAN?Tetra 電泳槽(美國Bio-Rad 公司);UVP GelStudio PLUS 多功能凝膠成像系統(tǒng)(德國AnalytikJena公司);DYCP-31BN型瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物公司)。

    NexION Setup Solution 調(diào)諧液(TruQ?ms, 500 mL,美國PerkinElmer 公司);四元素微球校準(zhǔn)液(TruQ?ms, 100 mL,美國Fluidigm 公司);西妥昔單抗(Cetuximab,廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心);氯化銪(Ⅲ)六水合物(25 g,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);DOTA-馬來酰亞胺(100 mg,陜西新研博美生物科技有限公司);三氟乙酸(TFA, 500 mL,上海麥克林生化科技股份有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF, 500 mL,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);超濾管(30和100 kDa, 0.5 mL,美國Millipore 公司);雙琥珀酰亞胺戊二酸酯(Diosuccinimidyl glutamate, DSG, 50 mg,上海麥克林生化科技股份有限公司);親和多肽(BP)、ssDNA、BCA 試劑盒、SDS 預(yù)制膠和Protein Ladder(生工生物工程(上海)股份有限公司);尼龍篩網(wǎng)(300 目,孔徑約為48 μm,北京索萊寶科技股份有限公司);非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 來自American Type Culture Collection。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 基于多肽親和標(biāo)記策略的元素標(biāo)簽IgG-MS2-Eu的制備

    BP-NHS的制備BP的NHS修飾反應(yīng)在DMF中進(jìn)行。在終濃度為0.5 mmol/L的多肽中加入100倍當(dāng)量的雙琥珀酰亞胺戊二酸酯(DSG),于37 ℃中振蕩反應(yīng)5 h。采用制備色譜儀進(jìn)行純化,流動相由A 相(TFA/H2O, 0.1%, V/V)和B 相(TFA/ACN, 0.1%, V/V)組成。以0.5 mL/min 的流速洗脫,洗脫程序?yàn)椋?~5 min, 5% B,用于樣品的加載及系統(tǒng)平衡;5~15 min, 5%~90% B,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)多肽的逐步分離;15~20 min,90% B,用于快速洗脫未完全分離的雜質(zhì)或高極性組分。

    IgG-BP 的制備IgG 與BP 的親和偶聯(lián)反應(yīng)在磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH=7.5)中進(jìn)行。在終濃度為7 μmol/L 的西妥昔單抗中加入5 倍當(dāng)量的親和多肽NHS-BP-MAL,室溫反應(yīng)1 h。采用超濾管(MWCO=30 kDa)在4 ℃下超濾純化5 min,共超濾4次,得到抗體多肽偶聯(lián)物IgG-BP。

    IgG-BP-ssDNA 的制備向反應(yīng)終濃度為10 μmol/L 的IgG-BP 偶聯(lián)物中加入20 倍當(dāng)量的ssDNA-SH,于4 ℃下過夜反應(yīng)。采用超濾管(MWCO=30 kDa)濾除小分子,并將溶劑置換為4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)緩沖溶液,最終得到IgG-BP-ssDNA 偶聯(lián)物。

    ssDNA-MS2-DOTA-Eu 的制備在噬菌體MS2 衣殼蛋白表面修飾DOTA-Eu 和ssDNA。首先將噬菌體MS2衣殼蛋白內(nèi)外表面的氨基轉(zhuǎn)化為巰基,然后在噬菌體MS2 衣殼蛋白中加入20倍當(dāng)量的2-亞氨基硫烷Traut′s 試劑,在5 mmol/L 的乙二胺四乙酸(EDTA)和pH=8.0 的NaHCO3 溶液中室溫振蕩反應(yīng)3h。采用超濾管(MWCO=100 kDa)純化,得到巰基化MS2 衣殼蛋白(MS2-SH)。

    對MS2-SH 進(jìn)行DNA 和Eu 元素的組裝在MS2-SH 中加入9 倍當(dāng)量的ssDNA-MAL,于4 ℃過夜反應(yīng)。然后繼續(xù)加入巰基50 倍當(dāng)量的MAL-DOTA-Eu,振蕩反應(yīng)2 h。采用超濾管(MWCO=100 kDa)超濾3 次,得到ssDNA-MS2-DOTA-Eu。

    IgG-BP-DNA-MS2-DOTA-Eu 元素標(biāo)簽的組裝 反應(yīng)在50 mmol/L Hepes(pH=7.0)緩沖溶液中進(jìn)行,將IgG-BP-ssDNA 與ssDNA-MS2-DOTA-Eu 偶聯(lián)物以2∶1 的比例混合,即可組裝得到IgG-BP-DNA-MS2-DOTA-Eu 元素標(biāo)簽。

    1.2.2 基于氨基隨機(jī)偶聯(lián)策略的元素標(biāo)簽IgG-PEG-MS2-Eu的制備

    通過抗體上的賴氨酸側(cè)鏈上的氨基或N 端的氨基實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。為了將西妥昔單抗與MS2-SH 偶聯(lián),需要在西妥昔單抗上偶聯(lián)一端帶有馬來酰亞胺基團(tuán)的連接子。西妥昔單抗和MAL-PEG-NHS 連接子通過NHS 酯與氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng),生成IgG-PEG-MAL 偶聯(lián)物。此反應(yīng)在含有10%(V/V)二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)的PBS 緩沖溶液中進(jìn)行,在終濃度為3 μmol/L 的西妥昔單抗中加入4 倍當(dāng)量的NHS-PEG-MAL,室溫下反應(yīng)2 h。采用超濾管(MWCO=30 kDa)于4 ℃以4500 g 的離心力超濾純化5 min,共超濾4 次,得到抗體偶聯(lián)物。通過BCA 微量蛋白定量試劑盒定量分析抗體偶聯(lián)物的蛋白濃度。

    通過巰基和馬來酰亞胺的邁克爾加成反應(yīng),將抗體偶聯(lián)物與MS2-SH 偶聯(lián),并在標(biāo)簽上修飾Eu,制備lgG-PEG-MS2-DOTA-Eu 元素標(biāo)簽,此反應(yīng)在10 mmol/L Hepes 緩沖溶液(pH=7.0)中進(jìn)行。在終濃度為2 μmol/L 的抗體偶聯(lián)物中加入2 倍當(dāng)量的巰基化MS2,室溫反應(yīng)2 h,加入5 倍巰基當(dāng)量的MALDOTA-Eu,室溫反應(yīng)2 h。采用超濾管(MWCO=100 kDa)于4 ℃以3500 g離心超濾純化3 min,共超濾4 次,得到元素標(biāo)簽IgG-PEG-MS2-Eu。

    1.2.3 元素標(biāo)簽中Eu 含量的定量分析

    采用柱后同位素稀釋法測定元素標(biāo)簽中Eu 的總量[37-38]。在每次測定前,采用含有1 μg/L 的Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb 和U 的調(diào)諧液對ICP-MS 進(jìn)行調(diào)諧,以達(dá)到最大靈敏度。在測試樣品前,使用2% HNO3 溶液沖洗ICP-MS 的霧化室5 min。搭建尺寸排阻色譜/非形態(tài)特異同位素稀釋電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Size exclusion chromatography/species-unspecific isotope dilution inductively coupled plasma massspectrometry, SEC/SUID-ICP-MS)平臺,以三通接口連接高效液相色譜(High-performance liquid chromatography,HPLC)的流動相出口和注射泵上的注射器口,使得兩股液流混合,共同進(jìn)入ICP-MS 進(jìn)行檢測。通過SEC 柱分離蛋白樣品,色譜流速為0.3 mL/min,注射泵以0.06 mL/min 的流速注入1 μg/L 153Eu 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。通過色譜和質(zhì)譜的信息對元素標(biāo)簽中Eu 的含量進(jìn)行絕對定量分析。

    1.2.4 元素標(biāo)簽的單細(xì)胞ICP-MS 分析[30]

    貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶處理后收集,懸浮細(xì)胞通過離心收集,然后采用預(yù)冷的Hepes 溶液置換細(xì)胞培養(yǎng)液。在每組100 μL 的2×106 個細(xì)胞中,加入不同濃度元素標(biāo)簽,在4 ℃下孵育30 min,期間將樣品緩慢旋轉(zhuǎn)混勻。采用預(yù)冷的Hepes 緩沖溶液洗滌3 次,在室溫下加入4%通用多聚甲醛固定液并放置15 min以固定細(xì)胞。固定操作結(jié)束后,繼續(xù)使用預(yù)冷的Hepes 緩沖溶液洗滌3 次,除去多余的元素標(biāo)簽。細(xì)胞樣品測試前通過300目(孔徑48 μm)的尼龍篩網(wǎng)過濾,防止粘連的細(xì)胞進(jìn)入裝置堵塞管路。采用SC-ICPMS對細(xì)胞樣品進(jìn)行測試。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 IgG-MS2-Eu 元素標(biāo)簽的制備及表征

    2.1.1 BP-NHS 的制備及表征

    BP 的NHS修飾反應(yīng)如圖2A 所示, BP的第8位賴氨酸與DSG發(fā)生酰胺縮合,引入NHS 官能團(tuán),用于后續(xù)與抗體的親和交聯(lián)反應(yīng)。采用HPLC以及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)對BP-NHS 產(chǎn)物進(jìn)行了純化和表征(圖2B和2C),測得分子量([M+H]+)為2572.1290 Da,與理論分子量結(jié)果吻合,說明成功實(shí)現(xiàn)了多肽的NHS修飾(1∶1),得到目標(biāo)物BP-NHS。

    2.1.2 IgG-BP 的制備及表征

    利用多肽配體對單克隆抗體的親和性,實(shí)現(xiàn)抗體與目標(biāo)多肽之間的共價結(jié)合,最終完成對抗體Fc 片段的定向修飾,具體的反應(yīng)過程如圖3A 所示。使用MALDI-TOF-MS 對產(chǎn)物進(jìn)行表征分析,結(jié)果如圖3B所示??贵w多肽偶聯(lián)物(IgG-BP)的分子量為153820.6 Da,而IgG 的分子量為151409.3 Da,表明西妥昔單抗均與BP-NHS 成功偶聯(lián),并且平均每個單克隆抗體上偶聯(lián)了一條目標(biāo)多肽。利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對產(chǎn)物進(jìn)行分析,如圖3C 所示,隨著BP-NHS 加入劑量增加,抗體的重鏈逐漸上移,輕鏈無反應(yīng),表明此親和標(biāo)記反應(yīng)僅發(fā)生在抗體的重鏈位置,與預(yù)期相符。

    2.1.3 IgG-BP-ssDNA的制備及表征

    IgG-BP 與巰基化單鏈DNA(ssDNA-SH)的反應(yīng)過程如圖4A 所示, IgG-BP 上的親和肽C 端的馬來酰亞胺官能團(tuán)與ssDNA-SH 反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵,實(shí)現(xiàn)IgG-BP 和ssDNA-SH 的共價偶聯(lián)。如圖4B 所示,完整的IgG-BP-ssDNA 條帶存在明顯上移,證實(shí)抗體與DNA 成功結(jié)合。對產(chǎn)物IgG-BP-ssDNA 進(jìn)行還原處理,結(jié)果如圖4C 所示,抗體重鏈的條帶出現(xiàn)上移,而輕鏈無變化,證實(shí)ssDNA-SH 與抗體的共價反應(yīng)僅發(fā)生在抗體的重鏈部位,而且每個抗體上僅偶聯(lián)一條ssDNA,證明發(fā)展的親和介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對抗體的化學(xué)計(jì)量比修飾。

    2.1.4 ssDNA-MS2-DOTA-Eu的制備及表征

    利用Traut′s 試劑對噬菌體MS2 衣殼蛋白納米顆粒表面的賴氨酸殘基進(jìn)行化學(xué)改造[36],將噬菌體MS2 衣殼蛋白中的天然氨基轉(zhuǎn)化為巰基,再通過巰基與馬來酰亞胺的反應(yīng)分別在MS2 的表面修飾ssDNA 及DOTA-Eu,反應(yīng)路線圖如圖5A 所示。為了監(jiān)測反應(yīng)過程中MS2 納米顆粒的完整性,使用透射電鏡對產(chǎn)物進(jìn)行表征,結(jié)果如圖5B 所示,經(jīng)由多步偶聯(lián)反應(yīng)制得的元素標(biāo)簽仍保持完整形態(tài),具有良好的穩(wěn)定性,元素標(biāo)簽顆粒尺寸均一,并且分散性良好。采用MALDI-TOF-MS 對MS2-SH 表征,結(jié)果如圖5C 所示, MS2-SH 亞基分子量約為14349 Da,而噬菌體MS2 衣殼蛋白亞基分子量為13760 Da,此結(jié)果表明MS2 表面的氨基被成功轉(zhuǎn)換成游離巰基,并且平均每個MS2 亞基上修飾6 個巰基。通過麥克加成反應(yīng)實(shí)現(xiàn)MS2-SH 表面的DNA 偶聯(lián),利用SDS-PAGE 對樣品進(jìn)行分析。如圖5D 所示,隨著ssDNA-MAL劑量增加, ssDNA-MS2 的條帶逐漸加深,表明MS2-SH 與ssDNA-MAL 成功偶聯(lián)。

    2.1.5 IgG-BP-DNA-MS2-DOTA-Eu(IgG-MS2-Eu)標(biāo)簽的制備及表征

    將上述純化后的IgG-BP-ssDNA 和ssDNA-MS2-DOTA-Eu 在50 mmol/L Hepes 緩沖溶液中混勻,抗體與MS2 在DNA 的雜交作用下實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)組裝,反應(yīng)過程如圖6A 所示。采用瓊脂糖凝膠電泳對反應(yīng)過程進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖6B 所示,反應(yīng)物條帶消失,并且出現(xiàn)了全新的條帶,表明IgG-BP-ssDNA 和MS2-ssDNA 經(jīng)由單鏈DNA 的堿基互補(bǔ)配對雜交成功。采用柱后同位素稀釋法對元素標(biāo)簽IgG-MS2-Eu 的Eu含量進(jìn)行定量分析。將元素標(biāo)簽稀釋104 倍,采用SEC/SUID-ICP-MS 對樣品中Eu 進(jìn)行定量檢測,結(jié)果見圖6C。計(jì)算結(jié)果表明,平均每個MS2 顆粒上攜帶了800 個Eu 原子。

    為獲得最佳標(biāo)記細(xì)胞的元素標(biāo)簽濃度,考察了不同濃度的IgG-MS2-Eu 標(biāo)簽對A549 肺癌細(xì)胞的標(biāo)記效果,建立了標(biāo)簽濃度與細(xì)胞信號強(qiáng)度的關(guān)系。如圖6D 所示,隨著元素標(biāo)簽孵育濃度增加,細(xì)胞的Eu信號強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)元素標(biāo)簽的濃度為40 nmol/L 時, Eu 的檢測值達(dá)到最大。因此,最佳的元素標(biāo)簽孵育濃度為40 nmol/L。

    2.2 IgG-BP-DNA-MS2-Eu 的SC-ICP-MS 分析

    為了檢測元素標(biāo)簽IgG-BP-DNA-MS2-Eu 在細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中的靶向性能以及評價其非特異性吸附情況,選擇A549 細(xì)胞(表皮生長因子受體(EGFR)陽性)和MDA-MB-231 細(xì)胞(EGFR 陰性)作為對照樣品,利用SC-ICP-MS 進(jìn)行單細(xì)胞分析,并通過產(chǎn)生的元素單細(xì)胞信號響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行對比分析。

    如圖7A 所示,未標(biāo)記A549 細(xì)胞沒有Eu 元素的信號,說明A549 細(xì)胞中Eu 元素背景很低。如圖7B所示, A549 細(xì)胞與MS2-DOTA-Eu 孵育后,僅存在微弱的脈沖信號,說明元素標(biāo)簽對A549 細(xì)胞沒有非特異性吸附。如圖7C 所示,在IgG-BP-DNA-MS2-Eu 標(biāo)記A549 細(xì)胞30 min 后,得到很強(qiáng)的Eu 元素信號響應(yīng),說明元素標(biāo)簽具有高靈敏性,并且標(biāo)記作用來自標(biāo)簽與A549細(xì)胞表面EGFR 抗原之間的特異性相互作用,表明IgG-BP-DNA-MS2-Eu 能夠與A549 細(xì)胞特異性結(jié)合,并且這種結(jié)合能力來源于西妥昔單抗的靶向特異性。

    以低表達(dá)EGFR 的MDA-MB-231 細(xì)胞作為陰性對照,測試結(jié)果見圖7D~7F。如圖7D 所示,未標(biāo)記的MDA-MB-231 細(xì)胞沒有Eu 元素的脈沖信號,說明MDA-MB-231 細(xì)胞中Eu 元素背景很低。如圖7E 所示,MS2-DOTA-Eu 孵育后的MDA-MB-231 細(xì)胞僅存在少量脈沖信號,說明元素標(biāo)簽對MDA-MB-231 細(xì)胞的非特異性吸附也很少。利用相同濃度的元素標(biāo)簽IgG-BP-DNA-MS2-Eu 進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)后, MDA-MB-231的信號強(qiáng)度遠(yuǎn)低于A549 細(xì)胞。此結(jié)果再次說明標(biāo)記作用是來自標(biāo)簽與A549 細(xì)胞表面EGFR 抗原之間的特異性相互作用。以上結(jié)果表明,親和標(biāo)記技術(shù)制備得到的IgG-BP-DNA-MS2-Eu 元素標(biāo)簽?zāi)軌蚺c目標(biāo)細(xì)胞表面的EGFR 特異性結(jié)合,并具有低的非特異性吸附和高靈敏度的優(yōu)勢。

    2.3 基于隨機(jī)偶聯(lián)技術(shù)制備的元素標(biāo)簽的SC-ICP-MS分析

    為比較親和標(biāo)記技術(shù)和通過隨機(jī)偶聯(lián)技術(shù)制備的元素標(biāo)簽的差異,利用NHS-PEG-MAL 將IgG 抗體的氨基與MS2-SH 的巰基通過隨機(jī)偶聯(lián),合成了IgG-PEG-MS2-Eu 標(biāo)簽(圖8A)。采用相同濃度的元素標(biāo)簽對A549 細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和SC-ICP-MS 分析,結(jié)果如圖8B 和圖8C 所示,在A549 單細(xì)胞檢測分析中,使用基于隨機(jī)偶聯(lián)方法得到的IgG-PEG-MS2-Eu 元素標(biāo)簽,其細(xì)胞上幾乎沒有Eu 的信號;而基于親和標(biāo)記制備的元素標(biāo)簽Eu 信號良好,說明采用隨機(jī)偶聯(lián)得到的元素標(biāo)簽幾乎未靶向定位到細(xì)胞表面EGFR 受體。這可能是因?yàn)镹HS-PEG-MAL 與抗體的隨機(jī)偶聯(lián)發(fā)生在抗體輕鏈的抗原識別區(qū),導(dǎo)致標(biāo)簽無法特異性識別細(xì)胞表面抗原,進(jìn)而無法實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的標(biāo)記和定量分析;也可能是在反應(yīng)的過程中,多個抗體和多個巰基化MS2 之間發(fā)生交聯(lián),阻礙了抗體與抗原的特異性識別與結(jié)合,最終導(dǎo)致標(biāo)簽無法正常標(biāo)記細(xì)胞。

    3 結(jié)論

    建立了一種通過多肽介導(dǎo)的親和標(biāo)記策略,實(shí)現(xiàn)了抗體的定點(diǎn)偶聯(lián)與噬菌體MS2 衣殼蛋白納米顆粒元素標(biāo)簽的組裝。此親和標(biāo)記策略避免了隨機(jī)偶聯(lián)造成的元素標(biāo)簽的異質(zhì)性和無法正常標(biāo)記的問題,制備得到的抗體納米元素標(biāo)簽具有偶聯(lián)位點(diǎn)精確、化學(xué)計(jì)量比可控、專一性好以及靈敏度高等優(yōu)勢,已成功用于癌細(xì)胞表面生物標(biāo)志物的高靈敏度、高特異性單細(xì)胞分析。此外,該策略無需對抗體進(jìn)行基因工程改造,可用于天然抗體的偶聯(lián),具有很好的普適性;可用于快速精準(zhǔn)地合成不同類型天然抗體元素標(biāo)簽,通過對不同細(xì)胞生物標(biāo)志物的靶向標(biāo)記檢測,實(shí)現(xiàn)對低豐度蛋白的定性和定量分析,以及對疾病的診斷和不同類型癌癥的診斷、分型和預(yù)后分析。然而,該策略僅在IgG1 抗體上驗(yàn)證了其可行性,存在偶聯(lián)步驟較復(fù)雜的問題。在此基礎(chǔ)上,未來可研究蛋白納米顆粒與不同類型的抗體偶聯(lián),簡化偶聯(lián)步驟,實(shí)現(xiàn)模塊化組裝,形成標(biāo)準(zhǔn)的純化工藝,發(fā)展成為質(zhì)譜流式細(xì)胞儀的配套試劑盒。此外,基于此偶聯(lián)策略,可在MS2 蛋白納米顆粒上偶聯(lián)/組裝藥物,構(gòu)建抗體-藥物偶聯(lián)物(Antibody-drug conjugate, ADC),用于藥物的靶向遞送。

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