超臨界流體色譜-質(zhì)譜接口技術及應用進展

關鍵詞 超臨界流體色譜；質(zhì)譜；接口；評述

20世紀80年代初， Peaden 等將超臨界CO₂作為新的流動相引入到色譜分析中[1-2]，盡管其存在流動相無毒、粘度低和易揮發(fā)等優(yōu)點，但基于超臨界流體的超臨界色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法（Supercritical fluidchromatography and mass spectrometry， SFC-MS）并未得到足夠的關注。自2012 年以來，儀器公司相繼推出了多款商業(yè)化SFC 分析系統(tǒng)，提高了SFC 在實驗室和實際應用場景的普及程度，有關SFC-MS 的研究論文數(shù)量也明顯增加。在Web of Science 中以“Supercritical fluid chromatography and mass spectrometry”與“SFC-MS”為關鍵詞，共檢索到3085 篇相關文章，內(nèi)容主要包括SFC 與質(zhì)譜的接口設計與應用（圖1）。其中，質(zhì)譜電離方法除了常用的電噴霧離子源（Electrospray ionization， ESI）、大氣壓化學電離源（Atmospheric pressure chemical ionization， APCI）、大氣壓光電離（Atmospheric pressure photoionizationionization， APPI）外，還有UniSpary[3]、電感耦合等離子質(zhì)譜法（Inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）[4]以及質(zhì)子轉移反應質(zhì)譜（Proton transfer reaction-mass spectrometry， PTR-MS）[5]等具有發(fā)展和應用潛力的方法，應用領域主要包括手性分離[6]、脂質(zhì)組學[7]、代謝組學[8]、興奮劑檢測[9-10]和毒品檢測[11-12]等。

本文介紹了SFC-MS 接口的設計原理以及其在應用方面的發(fā)展歷程和現(xiàn)狀，歸納了不同類型接口的適用性，重點分析了接口設計中不同因素對檢測性能的影響，并總結了近年來SFC-MS 在不同領域中的應用研究進展。

1 SFC-MS 接口的分類

超臨界CO₂是SFC 最常用的流動相，具有無毒、環(huán)境友好和易獲取等優(yōu)點，其臨界點為31.2 ℃、7.38 MPa，較易在實驗室環(huán)境中實現(xiàn)。CO₂在電離過程中沒有直接作用，進入大氣環(huán)境時會直接逸散，相比于液體流動相，超臨界CO₂流動相對質(zhì)譜檢測更有利。SFC 需要在高壓條件（15～25 MPa）下進行，而質(zhì)譜是在真空條件下工作的檢測裝置，因此，從SFC 色譜柱洗脫的分析物在進入質(zhì)譜入口之前必須減壓。由于SFC 流動相的可壓縮性較高，流動相在接口內(nèi)部壓力下降時極易出現(xiàn)相分離，導致已經(jīng)溶解的化合物在管壁上析出，無法轉移到質(zhì)譜裝置中，甚至發(fā)生堵塞[13]，這是SFC-MS 接口設計需要解決的最主要的問題。因此， SFC-MS 不能像LC-MS 那樣直接將液體從色譜柱出口轉移到電離源，必須采用特殊設計的接口保持色譜的完整性，并保證質(zhì)譜端有足夠的離子化強度。

目前，主流的儀器廠商已經(jīng)給出了SFC-MS 接口的完整解決方案，經(jīng)適當調(diào)整，可以滿足大多數(shù)使用場景。然而，深入理解其內(nèi)在的運作原理及優(yōu)缺點非常必要，這可使分析系統(tǒng)在更穩(wěn)定的狀態(tài)下運行。目前， SFC-MS 接口所采用的設計方案可以分為全流式接口和分流式接口兩大類。

1.1 全流式接口

全流式接口將色譜流出的分析物全部或大部分引入質(zhì)譜進行檢測，因此適合APCI 等質(zhì)量敏感型的電離方法。如圖2 所示，全流式接口主要通過以下方式實現(xiàn)：（1）使用節(jié)流器直接引入；（2）使用液體泵控制壓力；（3）使用小體積自動背壓調(diào)節(jié)器（Automated back-pressure regulator， ABPR）。

1.1.1 直接引入

Smith 等[14]在1982年首次提出了使用節(jié)流器進行全流量引入的方法，其中，節(jié)流器起到了被動壓力調(diào)節(jié)器的作用。如圖2A 所示，加熱節(jié)流器的出口或加熱整個節(jié)流器，可以緩解由于快速減壓而導致的SFC流動相冷卻以及分析物沉淀的問題[15]。使用節(jié)流器的主要優(yōu)點是結構簡單、柱外死體積小，缺點是操作靈活性降低、穩(wěn)定性差。通過節(jié)流器的壓降受內(nèi)部液體的密度、黏度和質(zhì)量流量的影響，因此，當流動相組分或流量發(fā)生變化時，接口兩端之間的壓降都會發(fā)生變化。在這種情況下，電離源電離性能受到內(nèi)部液體組成及其流量的影響較大。因此，在流動相流量和組分方式變化的情況下，采用已設計好的節(jié)流器難以達到預期效果。然而， Pinkston[16]指出，如果使用低壓縮性的SFC 流動相，采用節(jié)流器同樣能夠達到令人滿意的分析結果，因為此時SFC 流動相更像“液體”，壓力變化不會對流動相產(chǎn)生較大影響。Hoke 等[17]使用CO₂-甲醇（35∶65， V/V）流動相將SFC 流出的液體在送至節(jié)流器前進行預熱（圖2A 虛線位置），通過控制溫度調(diào)節(jié)內(nèi)部液體的密度和黏度，從而保證通過節(jié)流器的壓降被限制在一定范圍內(nèi)。

1.1.2 壓力流控制的全流式接口

壓力流控制的全流式接口方案由Chester 和Pinkston[18]提出，整個方案未采用幾何結構控制系統(tǒng)的壓力。如圖2B所示，從色譜柱流出的所有成分通過紫外（Ultraviolet， UV）檢測器后，液泵送入可與CO₂混溶的調(diào)壓流體，在零死體積三通中與流動相混合后流向電離源。該調(diào)壓流可以添加與流動相完全不同的組分，在不影響SFC分離過程的前提下，可通過引入不同溶劑和添加劑增強質(zhì)譜信號。盡管有這些優(yōu)點，但壓力流控制接口仍不夠靈活，原因在于傳輸管路的內(nèi)徑?jīng)Q定了兼容的流量/壓力組合范圍，在不同條件下需要選擇不同的管路。此外，該方法需要一個能夠提供無脈沖流的液泵與三通，增加了柱外死體積，并且額外的液流量還會增加電離源中的溶劑負荷。根據(jù)目標壓力的不同，所需要的溶劑添加量也會發(fā)生變化，進而改變分析物的濃度，影響定量分析結果。

1.1.3 帶補充液的ABPR控制接口

隨著小體積ABPR 的實際應用，在接口中引入ABPR 成為可能。標準尺寸的ABPR 通常會顯著增加死體積，導致色譜峰展寬，造成色譜分辨率損失，使用小體積ABPR 可有效解決此問題。然而，該策略卻引發(fā)了另一個問題：從ABPR 流出的是完全減壓的CO₂流動相，其溶解度可能無法保證將所有分析物傳輸?shù)劫|(zhì)譜。如果管路過長，該問題會更加嚴重。如圖2C 所示，該方案通過增加補充液泵解決分析物析出的問題。補充液可以在ABPR 之前或之后添加， Duval 等[19]以APCI 為電離源，比較了在ABPR 前后添加補充液的情況，得到了相近的定量分析結果。

1.2 分流式接口

兩種分流式接口方案如圖3 所示。在分流式接口中，只有少部分SFC 流動相轉移到電離源，大部分SFC 流動相通過ABPR 流出，其主要優(yōu)點是對ABPR 的限制較少。但是，流向電離源的流動相減少，可能會影響質(zhì)譜響應，這對于APCI 這類質(zhì)量敏感的電離方法影響很大。對于ESI 這類濃度敏感的技術[20]，流量損失并不會使質(zhì)譜響應顯著降低，故此類接口通常與ESI 聯(lián)用，可得到更佳的分析性能。另外，流動相減少可能會影響定量分析的準確性，這是因為流動相壓力或其它環(huán)境條件的細小變化都會改變分流比。對此， Perrenoud 等[21]考察了操作參數(shù)對分流比及質(zhì)譜輸出信號的影響。

1.2.1 預分流接口

Zhao 等[22-23]在SFC 色譜柱出口采用零死體積三通將少部分（1%～20%）流動相轉移到電離源入口，其余的流動相通過UV 檢測器進入ABPR（圖3A）。為了確保流向質(zhì)譜的流量較小，流向質(zhì)譜的流道的流動阻力應高于ABPR。由于分流裝置處于ABPR 控制下，因此該接口具有較好的靈活性，可通過ABPR 調(diào)節(jié)接口內(nèi)壓力以適應不同條件。在限制管路長度與保證接口死體積最小的前提下，使用該接口可將色譜的分離結果完整地從SFC 轉移到質(zhì)譜。但是，這種設置使得UV 和MS 兩個檢測器都未檢測到從色譜柱中流出的全部流動相，這可能導致檢測結果不準確和不全面。

1.2.2 后分流接口

圖3B 是目前SFC-MS 儀器廠商所提供的主流接口方案。該接口由兩個串聯(lián)的零死體積三通組成，在第一個三通添加由液泵輸送的補充液，在第二個三通將少部分流動相轉移到電離源，剩余的流動相通過ABPR 流出。該接口充分利用ABPR 和補充液泵，靈活調(diào)節(jié)輸送到電離源的液體流量和組分，減少樣品在接口內(nèi)的析出，從而獲得較高的靈敏度。

2 影響SFC-MS 接口性能的因素

2.1 接口幾何形狀的影響

接口的幾何形狀在減壓過程中起著關鍵作用。長徑比大的接口的效果最差，會導致接口內(nèi)部的壓力連續(xù)、漸進、線性地降低。樣品通過此類接口減壓時在某點可能發(fā)生相分離，影響其在隨后的管路上繼續(xù)傳遞。Pinkston 指出[16]，對于長度≥1 m 的長接口，相變會導致CO₂"相和有機溶劑相分段流動，產(chǎn)生“不穩(wěn)定、脈動的ESI 噴射和鋸齒狀色譜峰”。相對地，長度較短且管徑較寬，但末端呈錐形或夾緊的管路結構更加適用。

Smith 等[24]總結了用于SFC-MS 全流引入的出口幾何形狀（圖4）?；趯崿F(xiàn)可控減壓的設計初衷，這些幾何形狀仍然是現(xiàn)代SFC-MS 接口設計的重要參考依據(jù)。圖4A 的設計有兩段管路，第一段的直徑大于第二段。在確保第二段管路不過長且第一段管路不會引入顯著的流體阻力的前提下，這種接口設計優(yōu)于直徑較小且長度較長的接口設計。圖4B 是一個通過熔融和拉伸形成的錐形出口。毛細管未拉伸的部分便于在減壓膨脹之前對流體進行有效加熱，但是拉伸也會降低接口的耐壓性能。此外，還可采用將熔融石英毛細管的封閉端打磨至所需直徑（圖4C）、在毛細管末端沉積材料進行塑形（圖4D）、快速拉伸毛細管使其收縮（圖4E）或者在出口固定含小孔的膜片（圖4F）等方式制備接口。圖4G所示的出口與圖4D一樣采用了額外的填充材料。但是圖4G的出口填充更類似于構成了一個亞微米尺寸顆粒的柱，形成了多個具有大長徑比的流體路徑。這種幾何結構改善了揮發(fā)性化合物的運輸，但對難揮發(fā)化合物會產(chǎn)生相反效果，因此難揮發(fā)的分析物在該結構下極易發(fā)生堵塞。通過壓接毛細管與鉑銥管的末端制造約1 mm 長的接口（圖4H），可用于更高溫度和更多極性流體。

根據(jù)Smith 等[24]的研究，選擇接口幾何形狀的首要依據(jù)應是分析物的揮發(fā)性。揮發(fā)性化合物能夠在較高的溫度下保證溶解性，因此首要選擇堅固耐用且易更換的結構。為了防止沉淀與堵塞，溶解性條件需要保持到接口末端。該研究建議將接口出口變細，這有助于在整個流道中保持較高的壓力，并在出口產(chǎn)生更大的壓力梯度。最近， Petruzziello 等[25]在其研究中得出了非常相似的結論，他們在現(xiàn)有的專利接口基礎上進行了改進，使新接口縮短了減壓過程的發(fā)生長度，這項改進顯著提高了分析的可重復性，并減少了尖峰和起伏峰的出現(xiàn)。

2.2 補充液的影響

補充液的組成對電離和質(zhì)譜響應有很大影響。與純CO₂相比，加入有機溶劑通常會使分析物具有更好的溶解度和更快的傳質(zhì)速度。但是， CO₂/有機溶劑混合物的溫度和壓力臨界點也隨組分比例的不同而改變，因此，在溫度和壓力控制中需要考慮其影響。優(yōu)化補充液組分可以實現(xiàn)質(zhì)譜響應的標準化，特別是在代謝組學中，使同時分析不同濃度水平的代謝物成為可能。對于ESI，進入電離源的補充液類型很重要，因為氣相質(zhì)子親和會影響質(zhì)譜響應。Amad 等[26]研究表明，在具有較高氣相質(zhì)子親和力的補充液存在的條件下，分析物電離會被抑制。添加的有機補充液濃度范圍通常為0.1%～2%或1～50 mmol/L，為了更好地洗脫極性化合物，研究者多在含有甲醇的混合補充液中添加低含量（1%～8%）水。

2017 年， West等[27]描述并實驗證明了甲醇-CO₂"流動相之間的反應生成了單甲基碳酸，從而導致流動相的酸性特征。然而，量子化學計算和紅外光譜證實了另一種反應，包括導致碳酸形成的兩階段過程[28]。單甲基碳酸可以進一步與甲醇反應，生成碳酸二甲酯和水；隨后，水與CO₂"反應生成碳酸。Haglind 等[29]的研究表明，原本無水的流動相中后來存在水，這說明水是甲醇和CO₂"反應的產(chǎn)物，證明了上述反應過程的存在。

除了有機溶劑外，還可在流動相中加入鹽（如甲酸銨）、酸（如甲酸、三氟乙酸）或堿（如氨水），以提高方法的可重復性，改善可電離物質(zhì)的峰形。Plachka 等[30]以91種化合物、3種固定相和2種有機溶劑為研究對象，通過添加水、甲酸和乙酸、氨和不同摩爾濃度的氨鹽，研究了SFC-ESI-MS 中補充液組成對色譜的影響。他們首先研究了不同有機溶劑以及補充液添加劑的影響趨勢，然后利用Pearson相關檢驗和矩陣圖計算物質(zhì)理化性質(zhì)與質(zhì)譜響應之間的相關性，并進行回歸分析，得到了理化性質(zhì)與SFC-MS 響應之間的回歸方程。該方程可用于優(yōu)化補充液添加劑的選擇與組成，減少了實驗設計時間并簡化了程序。

2.3 溫度的影響

在與接口相關的所有參數(shù)中，溫度是避免相分離的關鍵參數(shù)。加熱SFC-MS 接口作為一種有效方法已經(jīng)應用了很長時間。隨著流體溫度升高，質(zhì)譜信號得到改善。對于純CO_2"流動相，為了獲得良好的流動特性，以及避免CO_2"膨脹過程中兩相分離，進入接口前的流動相溫度應至少為80～100 ℃。如果可以在整個接口內(nèi)保持恒溫，避免相分離的溫度應更低。這是在流體膨脹之前對其以及接口進行加熱處理能夠顯著提升對低揮發(fā)性化合物檢測效果的原因。對于添加有機補充液的情況，則需根據(jù)混合相的組分比例及熱力學性質(zhì)選擇加熱溫度，相關理論可參考文獻[31]。簡單而言，如果CO₂/有機溶劑混合流動相中的有機溶劑濃度增加，通常需要更高的溫度避免相分離。

另一種避免相分離的方法是冷卻流體，使其盡可能像液體[32]。以CO₂/甲醇（70∶30， n/n）混合物為流動相，假設初始壓力為150 bar （1 bar=0.1 MPa）， 如果溫度降至0 ℃，流體在接口內(nèi)須減壓到25 bar 才發(fā)生相分離。假設壓力在內(nèi)部線性下降，相分離只會發(fā)生在接口長度的最后1/6 部分；如果使用的接口出口端存在縮口，能夠產(chǎn)生大于25 bar 的壓降，則可完全避免在接口內(nèi)部出現(xiàn)相分離。

2.4 電離源與質(zhì)譜響應

靈敏度與分析物的種類、樣品基質(zhì)、流動相、補充液組成和分析儀器密切相關，因此，評估并比較不同色譜技術對同一分析物的分析靈敏度水平并不容易。相比于LC-MS， SFC-MS 在分析葡萄糖苷酸和硫酸鹽類固醇[33]、美沙酮[34]、尿液中的興奮劑[7]以及血清中的維生素D代謝物[35]時具有更高的靈敏度。

不同的電離源在SFC-MS 中的性能也存在差異。Parr 等[36]使用全流式接口比較了SFC-MS 下離子源分別為ESI、APPI 和APCI 時質(zhì)譜的檢出限和靈敏度，認為ESI 最適于多組分分析，其它電離技術更適于單獨分析特定的分析物。例如，單獨分析孕二醇時， APCI+優(yōu)于APPI+和ESI+。Matsubara 等[37]也強調(diào)了ESI 在結構解析方面的優(yōu)勢，在類胡蘿卜素和環(huán)氧類胡蘿卜素的SFC 分析中，采用ESI 可檢測到結構特異性產(chǎn)物離子，而使用APCI 時未檢出。Liu 等[35]在分析血清中維生素D代謝物時發(fā)現(xiàn)，使用ESI 的信噪比高出APCI 約4～6倍。Wolrab 等[38]認為ESI 和APCI 在分析氨基酸及相關化合物時的敏感性依賴于分析物。但是，也有研究表明ESI 和APCI 的靈敏度相似[39]。

Mostafa 等[40]設計了一種新的納噴霧電離源以及對應的接口，這種電離源能夠產(chǎn)生更小的電噴霧液滴。該接口使用了ABPR，并在ABPR 之后進行分流，少部分流動相通過電離源電離進入色譜。他們構建了3種內(nèi)徑尺寸（25、50和75 μm）的電離源，并對有機溶劑比以及流量進行了優(yōu)化。將最終結果與傳統(tǒng)的SFC-ESI 進行比較，結果表明，不論采用哪種尺寸的電離源，系統(tǒng)的信號強度都增強了10 倍。

SFC-MS 分析通常在酸性條件下進行，流動相的pH 值通常在5 左右，原因是甲醇-CO₂"以及水-CO₂"之間的反應。Akbal 等[41]依次檢測了添加酸性、中性、堿性以及緩沖溶液后的CO₂"噴霧的pH 值。結果表明，無論哪種條件，噴霧的pH 值都在3.8～7.2范圍內(nèi)，這表明SFC 分析總是在酸性到中性條件下進行。酸性條件會降低ESI 負離子模式下的靈敏度，因為去質(zhì)子化在堿性條件下更易發(fā)生。在SFC-MS 中， ESI的負離子模式下的質(zhì)譜信號強度比正離子模式低10倍。因此，有必要進一步研究流動相酸性對質(zhì)譜靈敏度的影響，特別是在負離子模式的ESI 中。

3 SFC-MS 接口技術的應用

3.1 脂質(zhì)組學

脂質(zhì)組學是研究生物體表達的全部脂質(zhì)或某一體系中所有脂質(zhì)的科學，不僅需要獲得包含個體脂質(zhì)組成和豐度信息的“脂質(zhì)譜”，還需要全面了解生物樣品中脂質(zhì)的各種功能[42]。Uchikata 等[43]建立了一套基于SFC 的磷脂分析系統(tǒng)，可在5min 內(nèi)提取3 μL 血漿中的磷脂，并在15min 內(nèi)完成分析，共提取到134 種磷脂，其中， 74種磷脂的分析具有良好的重復性。Lísa研究組[44]報道了一種高通量的脂質(zhì)組學分析方法，以甲醇-水-乙酸銨混合物為梯度改性劑，以1.7μm 顆粒橋接乙烯雜化硅柱為色譜柱，采用UHPSFC 法進行脂類分離，可在單次運行中分離24個脂類，其中包含436種脂質(zhì)（圖5A）。

Yang 等[45]建立了一種基于真空溶劑蒸發(fā)接口的在線二維色譜方法，首先通過一維SFC 分離脂類，再通過二維RPLC 分離不同種類的脂類分子。該系統(tǒng)檢測11 個脂質(zhì)標準品的回收率均大于88%，脂質(zhì)標準品的檢出限均在ng/mL 級，采用該方法可在38 min 內(nèi)鑒定出人血漿中10 個脂類中的370 種內(nèi)源性脂質(zhì)。該研究利用十字雙位閥的真空蒸發(fā)接口，經(jīng)過一維SFC 柱的流動相在流過回路時由真空泵蒸發(fā)。通過閥門的自動切換，兩個回路交替捕獲分析物并將其轉移到二維液相色譜，建立了無需中途停止的二維SFC/RPLC 系統(tǒng)。

De Kock 等[46]開發(fā)了一種高速定量分析類固醇激素的UPSFC-MS/MS 方法。該方法在ESI 正離子模式下具有良好的穩(wěn)定性、選擇性和高靈敏度，在5 min 內(nèi)可從50 μL 人血漿樣本中分析19種類固醇。該方法線性度良好，相關系數(shù)為0.9983～0.9999，日內(nèi)和日間精密度（RSD）均小于15%，對19種分析物的準確度在80%～116%之間。

Jiang 等[47]利用UPSFC-MS 開發(fā)了一種新型極性脂質(zhì)分析方法，可分離并定量分析18 個脂類。利用該系統(tǒng)以7 份生物乳汁及乳制品為樣品，在10min 內(nèi)可檢測并定量分析219 種不同的極性脂質(zhì)。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，與其它哺乳動物相比，人乳中的極性脂質(zhì)組成明顯不同。人乳的極性脂質(zhì)濃度較低，但膽固醇和鞘磷脂含量較高。在檢測的所有動物乳汁樣品種類中，驢乳的極性脂質(zhì)中鞘磷脂的相對含量與人乳最接近，可能是一種潛在的嬰兒配方奶粉原料（圖5B）。

Wolrab 等[48]利用以UHPSFC-MS 為主的多種質(zhì)譜方法對胰腺癌患者與健康人的血清樣本進行分析，結果表明，胰腺癌患者與健康對照組樣本的脂質(zhì)組成存在統(tǒng)計學上的顯著差異（圖5C）。根據(jù)樣本結果訓練出的方法在診斷胰腺癌時敏感性和特異性上均超過90%，與現(xiàn)有的診斷影像學方法相當。此外，該研究組還分析了腎癌、乳腺癌和前列腺癌患者的血漿脂質(zhì)組學特征與健康對照組的差異[49]，給出了統(tǒng)計學上差異最顯著的7 種脂質(zhì)，這些脂質(zhì)有望成為癌癥篩查的標志物。

Kozlov 等[50]開發(fā)了一種單平臺的SFC-MS 脂質(zhì)組學/代謝組學方法，可以在儀器、色譜柱、流動相和改性劑相同的條件下，通過連續(xù)兩次進樣分析血漿中的脂質(zhì)和極性代謝物（圖5D）。作者圍繞系統(tǒng)的壓力控制、結果的長期可重復性和色譜性能，對流速梯度程序、補充液以及流動相做了選擇與優(yōu)化，實現(xiàn)在24 min內(nèi)識別9 類脂質(zhì)與39 種代謝物，并且在50 次重復檢測中分析物的保留時間的標準差lt;0.011 min。

3.2 手性分離

SFC被認為是對映體分離的首選，與LC相比，在分離結果幾乎相同的情況下， SFC 的運行時間會大幅降低，極大地提高了分析檢測的效率。在市售合法藥物的成分中只存在純S 型安非他明（S-Amphetamine），利用SFC-MS 監(jiān)測生物樣本中是否存在R 型安非他明（R-Amphetamine）可以區(qū)分非法合成的和作為醫(yī)療用藥的安非他明[51]，并作為判斷是否吸毒的參考依據(jù)之一。此外，明確R/S-安非他明的相對含量也可以推斷出毒品的合成方法，協(xié)助尋找制毒地點。利用SFC 獲取植物藥物的對映體組成還可為表征草藥產(chǎn)品提供方案，避免與成分相似的化學合成藥物或外觀相似的植物藥物混淆[52]。

Yang 等[53]以卡馬西平（Carbamazepine）為內(nèi)標，建立了一種基于SFC-MS 的快速靈敏測定比格犬血漿中奧卡西平（Oxcarbazepine， OXC）及其手性代謝物尼卡巴嗪（Licarbazine， Lic）的方法。OXC 在口服后會被還原酶迅速代謝為Lic，其藥理活性高于母體化合物，具有較好的抗癲癇作用。Lic 在人血漿中以S-Lic 和R-Lic 的對映體混合物的形式出現(xiàn)，比例約為5∶1。該方法的運行時間僅為3 min， OXC 濃度在5～1000 ng/mL 范圍內(nèi)和Lic 對映體濃度（0.5～100 ng/mL）呈線性關系，定量下限分別為5.0 和0.5 ng/mL。

Gou 等[54]報道了一種基于手性異構體比例分析中成藥質(zhì)量的評價策略。以不同制藥企業(yè)的158 批元虎止痛片為樣本，通過HPLC 提取其中的四氫帕馬?。═etrahydropalmatine， THP）。THP 有兩種對映體（d-THP 與l-THP（羅通定）），在元虎止痛片的原料延胡索中，這兩種對映體將以相對穩(wěn)定的比例共存。對分離純化的THP 進行SFC 分離，結果表明，正常藥品樣本的d-THP 與l-THP 的峰面積比與延胡索中的比例相近，峰面積比約為60∶40。然而，在有問題的樣本中d-THP 明顯減少，峰面積比為10∶90。這表明部分制藥企業(yè)可能沒有嚴格遵守處方配比和生產(chǎn)規(guī)則，使用劣質(zhì)的延胡索原料，并在生產(chǎn)過程中添加化學原料羅通定，以達到中國藥典的定量標準。

在藥物的手性化合物純化過程中，制備型SFC 比制備型LC 具有顯著優(yōu)勢[55]。由于超臨界流動相的黏度較低，可以使用更高的流動相流速，從而提高SFC 分離的速度。此外，以CO_2"取代大部分流動相，制備型SFC 的有機溶劑消耗會大大減少，并且CO_2"可在柱后通過降低壓力很容易地去除并回收，大大降低了去除溶劑所需的人力和時間及能源成本。最后， CO₂"作為主要流動相成分也使色譜法更加環(huán)保。Wilson 等[56]開發(fā)了一種用于分離羥氯喹（Hydroxychloroquine， HCQ）的SFC 制備方法，在2 h 內(nèi)收集了363mg R 對映體和338mg S 對映體，對映體純度超過99%。

Xin 等[57]采用手性SFC 對木脂素的4 種非對映異構體進行了制備級分離純化。這4 種木脂素具有抗神經(jīng)炎癥活性，可用作消炎類藥物。由于單一的非手性HPLC 方法和非手性SFC 方法都不能分離這4 種非對映異構體，該研究建立了層疊式自動進樣的兩步純化方法。首先，在第一個手性固定相（Chiralstationary phase， CSP）上分離，將4種木脂素分成兩對；然后，在第二個CSP 上分別將兩對非對映異構體兩兩分離。以710 mg 提取物為原料，采用該方法成功分離出4 種非對映異構體，產(chǎn)量分別為103.1、10.0、152.3 和178.6 mg， 純度均大于98%。

4 總結與展望

本文總結了設計和開發(fā)合適的SFC-MS 接口需要考慮的因素， SFC-MS 接口使SFC 和MS 兩個系統(tǒng)能夠更好地耦合。隨著SFC儀器和色譜柱技術的發(fā)展，其強大的分離能力與非常靈敏的質(zhì)譜檢測相結合，使SFC-MS 在某些領域可以達到與LC-MS 互補的水平。SFC-MS 可用于多種樣品的分析，從疏水物質(zhì)（如脂質(zhì)或脂溶性維生素）的正常相分離，到中極性物質(zhì)（如藥物或天然產(chǎn)物）的反相分離。特別是在一些重要的應用場景，如脂質(zhì)組學研究中， SFC-MS 表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢，能夠在一次分離過程中同時測定極性和非極性物質(zhì)，這是傳統(tǒng)的色譜技術很難實現(xiàn)的。目前， SFC-MS 正進入相對成熟的發(fā)展階段，其基礎和應用研究越來越豐富，對這一領域的持續(xù)關注將有助于SFC-MS 技術的普及和發(fā)展。