電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)單細(xì)胞內(nèi)外源物質(zhì)的研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞 電感耦合等離子體質(zhì)譜；單細(xì)胞分析；金屬；外源物質(zhì)；內(nèi)源物質(zhì)；評(píng)述

細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單元，在單細(xì)胞層面的研究對(duì)分析細(xì)胞性質(zhì)和了解細(xì)胞行為具有重要意義[1]。內(nèi)源物質(zhì)是指細(xì)胞本身含有或產(chǎn)生的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核苷酸、胞外分泌物及其相關(guān)的化學(xué)元素等，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。外源物質(zhì)是指來(lái)源于外界環(huán)境且對(duì)于細(xì)胞生理活動(dòng)非必需的物質(zhì)，如重金屬、金屬藥物和納米顆粒等，可通過(guò)不同的途徑進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝和凋亡等環(huán)節(jié)產(chǎn)生不同的影響。因此，對(duì)細(xì)胞中的內(nèi)源物質(zhì)和外源物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于揭示細(xì)胞的生理功能和病理機(jī)制，評(píng)估外源物質(zhì)的生物效應(yīng)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)均具有重要意義。

傳統(tǒng)的細(xì)胞元素定量分析一般通過(guò)測(cè)定細(xì)胞消解后整個(gè)細(xì)胞群體中元素的總量而進(jìn)行[4]。然而，由于細(xì)胞的異質(zhì)性，每個(gè)細(xì)胞具有不同的基因、蛋白質(zhì)表達(dá)水平和元素豐度，由整個(gè)細(xì)胞群體產(chǎn)生的平均值掩蓋了單個(gè)細(xì)胞的重要信息[5]。單細(xì)胞分析是一種能夠揭示細(xì)胞異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)變化的重要手段，可以提供更加細(xì)致和全面的細(xì)胞信息，為細(xì)胞的研究和應(yīng)用提供更多的可能性。單細(xì)胞電感耦合等離子體質(zhì)譜（Single cell-inductively coupled plasma-mass spectrometry， SC-ICP-MS）是一種基于電感耦合等離子體質(zhì)譜的單細(xì)胞元素分析技術(shù)，通過(guò)將單個(gè)細(xì)胞引入到高溫等離子體中，使細(xì)胞原子化和電離，然后利用質(zhì)譜儀對(duì)細(xì)胞中的元素進(jìn)行檢測(cè)和定量分析，基本流程如圖1 所示。SC-ICP-MS 具有高靈敏度、高通量和高分辨率的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)單細(xì)胞中的內(nèi)源物質(zhì)，也逐漸被應(yīng)用于探究重金屬、金屬藥物和納米顆粒等外源物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布、轉(zhuǎn)化、累積和毒性。

本文介紹了SC-ICP-MS 的單細(xì)胞樣品制備流程，包括分離、洗滌、固定等步驟，以及目前通用的樣品引入系統(tǒng)和定量方法的優(yōu)勢(shì)和存在的問(wèn)題，總結(jié)了近年來(lái)SC-ICP-MS 在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源物質(zhì)、外源物質(zhì)和同時(shí)檢測(cè)內(nèi)外源物質(zhì)方面的應(yīng)用研究進(jìn)展，展示了其在環(huán)境、醫(yī)學(xué)和材料等領(lǐng)域中的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景，為SC-ICP-MS 的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用提供了參考。

1 SC-ICP-MS 的樣品制備

SC-ICP-MS 已用于分析不同來(lái)源和不同類型的細(xì)胞。單細(xì)胞樣品制備是SC-ICP-MS 分析的重要前提和基礎(chǔ)，涉及到細(xì)胞的分離、清洗和固定等步驟，目的是獲得單分散、無(wú)污染和形態(tài)穩(wěn)定的單細(xì)胞懸液，以便于后續(xù)的細(xì)胞引入和分析。樣品制備的方法和條件取決于細(xì)胞的大小、形態(tài)和穩(wěn)定性等參數(shù)，具體流程如圖2 所示。

對(duì)于成分簡(jiǎn)單的單細(xì)胞體系，如細(xì)菌[6-7]、酵母細(xì)胞[8-9]和單細(xì)胞藻類[10-13]等，通常只需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的離心、洗滌和稀釋后即可直接進(jìn)行測(cè)定，降低了基質(zhì)效應(yīng)，減少了樣品堵塞。對(duì)于人[14-15]和其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系[16-17]等易團(tuán)聚和貼壁的體系，常用的方法是加入低濃度的胰蛋白酶，使得細(xì)胞與瓶壁表面之間的粘附蛋白水解，獲得懸浮的單個(gè)細(xì)胞。但是，胰蛋白酶的蛋白水解活性也可能會(huì)損傷細(xì)胞[18]，因此，該過(guò)程必須小心進(jìn)行，一旦獲得細(xì)胞懸液，應(yīng)立即進(jìn)行分析，避免細(xì)胞損傷。

從多細(xì)胞生物體中獲取單細(xì)胞樣品一直是單細(xì)胞研究的一個(gè)較大的技術(shù)瓶頸。獲取方法的選擇需考慮樣品的特性、來(lái)源以及擬采用的處理和分析方法。對(duì)于實(shí)體組織中單個(gè)細(xì)胞的獲取和測(cè)定，通常采用物理切割、洗滌、酶解和過(guò)濾的方式。以Wistar 大鼠為例[19]，如圖2C 所示，首先對(duì)暴露后大鼠的不同器官進(jìn)行取樣，多次洗滌棄去上清液，以清洗去除殘留的血液和其它不需要的生物材料；將組織切成小塊以增加其總表面積，并再次洗滌；使用蛋白水解酶孵育進(jìn)行組織分解，過(guò)濾混懸液，得到單細(xì)胞溶液；最后經(jīng)過(guò)固定、洗滌和再分散過(guò)程后再進(jìn)行儀器測(cè)試。在對(duì)植物的研究中，通常將傳統(tǒng)的原生質(zhì)體分離和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合獲取單細(xì)胞樣品。目前，對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行的研究包括單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、DNA 轉(zhuǎn)化、生物膜研究和植物育種等[20-21]，但使用SC-ICP-MS 對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行單細(xì)胞異質(zhì)性的研究目前仍然很少。

對(duì)于酵母、細(xì)菌和單細(xì)胞藻類，細(xì)胞壁的存在保證了細(xì)胞穩(wěn)定性，使得大多數(shù)細(xì)胞能夠在離心、洗滌、稀釋和霧化過(guò)程中保持細(xì)胞的完整性。因此，這些細(xì)胞常被用于SC-ICP-MS 新方法和細(xì)胞導(dǎo)入系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)和表征[22]。然而，當(dāng)處理人類及其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞在稀釋過(guò)程中可能由于滲透壓變化而破裂。為了解決細(xì)胞穩(wěn)定性的問(wèn)題，常用策略是采用固定劑化學(xué)固定懸浮液中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[23]。戊二醛、甲醛和多聚甲醛等是細(xì)胞研究中最常用的固定劑[24]，主要通過(guò)在蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間形成交聯(lián)而固定細(xì)胞，可有效地保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)[25-26]。當(dāng)細(xì)胞收集和分析之間存在時(shí)間間隔，或當(dāng)樣品制備可能損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)，細(xì)胞固定過(guò)程對(duì)于單細(xì)胞分析尤為重要[27]。

2 SC-ICP-MS 的樣品引入

在SC-ICP-MS 分析過(guò)程中，一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)入等離子體中被離子化的細(xì)胞數(shù)與引入的懸液中細(xì)胞總數(shù)的比值被稱為細(xì)胞傳輸效率（η）。良好穩(wěn)定的細(xì)胞傳輸效率是開(kāi)展單細(xì)胞研究的前提條件。通常使用NIST 認(rèn)證的納米顆粒[28]或金屬編碼的聚苯乙烯珠[13]確定傳輸效率，并認(rèn)為這些標(biāo)準(zhǔn)顆粒到達(dá)等離子體后信號(hào)強(qiáng)度足以被完全檢出。但是，由于細(xì)胞的密度、形態(tài)和大小等性質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)顆粒均存在差異，在等離子體中可能存在傳輸效率不一致的情況，因此實(shí)際上標(biāo)準(zhǔn)顆粒難以準(zhǔn)確地代表細(xì)胞的傳輸效率。為了解決此問(wèn)題，近年來(lái)提出了“內(nèi)標(biāo)法”測(cè)定細(xì)胞傳輸效率的策略，即選取具有低電離能、低干擾，并且在細(xì)胞中含量高且穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)源元素（如P、Mg）作為指示元素，用于評(píng)估細(xì)胞傳輸效率和計(jì)算其它元素的檢出率[29]。此外，還有研究者以Ir 為DNA 嵌入劑標(biāo)記細(xì)胞核內(nèi)的核酸，通過(guò)測(cè)定Ir 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)[30]，這種標(biāo)記檢測(cè)方法相較于直接檢測(cè)內(nèi)源元素的方法更加靈敏和準(zhǔn)確。

傳統(tǒng)的ICP-MS 樣品引入系統(tǒng)的樣品消耗量較大且傳輸效率低。為了提高細(xì)胞傳輸效率和精度，研究者陸續(xù)開(kāi)發(fā)了多種類型的單細(xì)胞進(jìn)樣系統(tǒng)，包括改進(jìn)的霧化器和霧化室[31]、微流控芯片[32-33]、改進(jìn)的毛細(xì)管[34]及新型多功能的復(fù)雜進(jìn)樣系統(tǒng)[35-36]等。改進(jìn)后樣品引入系統(tǒng)的細(xì)胞傳輸效率最高可達(dá)到100%。此外，在樣品引入時(shí)，還要控制合適的細(xì)胞密度，使得在一個(gè)駐留時(shí)間內(nèi)只有一個(gè)細(xì)胞被檢測(cè)，并盡可能減少背景信號(hào)和管路記憶效應(yīng)，使得每個(gè)信號(hào)峰真實(shí)地反映單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的元素含量信息[37]。為了量化單細(xì)胞中的元素含量，通常采用比較元素標(biāo)準(zhǔn)溶液和單細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞中的元素質(zhì)量，定量分析結(jié)果與基于細(xì)胞消解的ICP-MS 元素總量檢測(cè)結(jié)果之間具有良好的一致性[38]。

3 SC-ICP-MS 對(duì)細(xì)胞內(nèi)外源物質(zhì)的檢測(cè)

SC-ICP-MS 通過(guò)高通量逐個(gè)引入細(xì)胞，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞中的元素進(jìn)行高靈敏檢測(cè)和定量分析，提供細(xì)胞異質(zhì)性信息，因此在細(xì)胞內(nèi)外源物質(zhì)的檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。近十年來(lái)，使用SC-ICP-MS 測(cè)定細(xì)胞內(nèi)外源物質(zhì)的代表性研究成果見(jiàn)電子版文后支持信息表S1。

3.1 SC-ICP-MS 對(duì)細(xì)胞內(nèi)源物質(zhì)的檢測(cè)

SC-ICP-MS 能夠獲得內(nèi)源物質(zhì)在細(xì)胞中的含量和分布信息，有助于研究細(xì)胞的生理和病理機(jī)制，以及相關(guān)疾病的診斷和治療。

細(xì)胞利用元素的物理化學(xué)特性控制其相關(guān)生命活動(dòng)，因此，通過(guò)測(cè)定胞內(nèi)元素的含量和分布可以得到細(xì)胞的狀態(tài)信息。相較于傳統(tǒng)的光譜和質(zhì)譜分析技術(shù)，使用SC-ICP-MS 測(cè)定單個(gè)細(xì)胞中的金屬元素（如Fe、Cu、Mg 和Zn 等）和非金屬元素（如P 和S 等）解決了樣品需求量大、易受污染和易受光譜干擾等問(wèn)題[39]。因此， SC-ICP-MS 已被廣泛用于測(cè)定細(xì)菌[40]、酵母細(xì)胞[9，38]、單細(xì)胞藻類[29，41-42]、哺乳動(dòng)物[33-43]及人類[14，34]等多種生物細(xì)胞的內(nèi)源元素含量。此外，使用SC-ICP-MS 獲得的細(xì)胞內(nèi)源元素分布信息可以揭示更詳細(xì)的細(xì)胞生理過(guò)程。Wu 等[43]通過(guò)對(duì)不同類型生精細(xì)胞（精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、圓形精細(xì)胞和延長(zhǎng)型精細(xì)胞）中Mg、P、Cr、Mn、Fe 和Zn 等元素進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)元素含量和分布模式隨著精子發(fā)生進(jìn)程而發(fā)生變化，為揭示礦物元素在精子發(fā)生和精子質(zhì)量調(diào)節(jié)過(guò)程中的作用提供了直接的證據(jù)。Wang 等[31]對(duì)3 種人細(xì)胞系（宮頸癌細(xì)胞（HeLa）、肺癌細(xì)胞（A549）和正常人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE））中Fe、Cu、Zn、Mn、P 和S 等元素進(jìn)行單細(xì)胞分析的結(jié)果顯示，元素的分布模式在不同的細(xì)胞系中也呈現(xiàn)出明顯的差異。重要的是，該研究?jī)H在2 種癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)P 和S 元素呈現(xiàn)出多峰分布，說(shuō)明癌細(xì)胞的變異使其相較于正常細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的種內(nèi)異質(zhì)性。

對(duì)于內(nèi)源大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）無(wú)法通過(guò)直接測(cè)定元素對(duì)其進(jìn)行分析，可以采取抗體標(biāo)記手段間接獲得蛋白的含量和表達(dá)量。例如，使用合成的金納米團(tuán)簇（AuNCs）作為免疫探針，通過(guò)SC-ICP-MS 測(cè)定單個(gè)細(xì)胞中的Au，可以間接得到人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（HRPEsv）中載脂蛋白和金屬硫蛋白的含量[44]。此外，將含有用Ni 或Co 標(biāo)記的熒光蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，再誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過(guò)SC-ICP-MS測(cè)定單個(gè)細(xì)胞中的Ni 或Co 含量可以反映蛋白的表達(dá)量[40]。特別的是，對(duì)于通過(guò)金屬標(biāo)記蛋白的分析方法，結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)的質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（Cytometry by time of flight， CyTOF）已發(fā)展為成熟的單細(xì)胞分析手段，其具體原理及應(yīng)用已在相關(guān)文獻(xiàn)中詳細(xì)描述[45-46]。CyTOF 使用穩(wěn)定的貴金屬或稀土金屬元素（主要是鑭系元素）標(biāo)記的特異性抗體標(biāo)記細(xì)胞表面和胞內(nèi)蛋白，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞上的各種金屬標(biāo)簽，在單細(xì)胞水平上提供了關(guān)于倍性、免疫表型、細(xì)胞亞群頻率、蛋白質(zhì)表達(dá)水平以及功能表征等關(guān)鍵生物學(xué)信息。為防止高豐度低質(zhì)荷比元素對(duì)檢測(cè)器性能的影響，目前的CyTOF 儀器只能檢測(cè)m/z 75～209 范圍內(nèi)的元素。單細(xì)胞電感耦合等離子體飛行時(shí)間質(zhì)譜（SC-ICP-time of flight （TOF）-MS）在同時(shí)檢測(cè)低質(zhì)荷比元素中具有優(yōu)勢(shì)[47]。

3.2 SC-ICP-MS 對(duì)細(xì)胞外源物質(zhì)的檢測(cè)

SC-ICP-MS 可對(duì)單個(gè)細(xì)胞中各種外源物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和定量，探究外源物質(zhì)在細(xì)胞中的富集行為，進(jìn)而評(píng)估外源物質(zhì)的生物效應(yīng)和風(fēng)險(xiǎn)。

3.2.1 金屬（類金屬）的檢測(cè)

環(huán)境中廣泛存在的重金屬通過(guò)各種途徑進(jìn)入細(xì)胞，其毒性取決于重金屬元素的種類、濃度、物理性質(zhì)和化學(xué)形態(tài)。傳統(tǒng)方法常采用消解測(cè)總量的方式判斷細(xì)胞對(duì)重金屬的平均積累水平，但忽略了細(xì)胞的異質(zhì)性，而SC-ICP-MS 技術(shù)可以從單個(gè)細(xì)胞的角度提供重金屬的積累信息。

細(xì)胞對(duì)金屬元素的攝取存在種間和種內(nèi)異質(zhì)性。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的單個(gè)淡水浮游植物細(xì)胞（角星鼓藻、二角盤星藻和尖銳柵藻）對(duì)砷酸鹽的攝取存在種間差異[48]。對(duì)于Cu 處理下的嗜肺軍團(tuán)菌，隨著暴露濃度增加和暴露時(shí)間延長(zhǎng)，種內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的長(zhǎng)尾現(xiàn)象，Cu 積累較高的細(xì)胞數(shù)量明顯增加[7]。這種細(xì)胞對(duì)外源金屬攝入的種間和種內(nèi)異質(zhì)性在很大程度上可能與細(xì)胞大小有關(guān)[29]。不同元素在單個(gè)細(xì)胞上可能存在協(xié)同、競(jìng)爭(zhēng)或保護(hù)行為。例如，在硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代甲硫氨酸（SeMeSeCys）的保護(hù)作用下，單個(gè)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（SH-SY5Y）中積累的甲基汞含量減少，積累高含量甲基汞的細(xì)胞的百分比降低[49]。重要的是，只有當(dāng)使用考慮細(xì)胞間異質(zhì)性的SC-ICP-MS 技術(shù)時(shí)才能得出這些結(jié)論，當(dāng)消解細(xì)胞后，再使用ICP-MS 進(jìn)行測(cè)定時(shí)，無(wú)論細(xì)胞是否暴露這兩種形態(tài)的硒，SH-SY5Y 細(xì)胞中積累甲基汞的數(shù)值之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（pgt;0.05）。

3.2.2 金屬藥物的檢測(cè)

自1969年Rosenberg 等[50]發(fā)現(xiàn)順鉑的抗癌特性以來(lái)，研究人員合成了多種鉑化合物，通過(guò)與核苷酸堿基的氮原子結(jié)合，引起DNA 結(jié)構(gòu)變化，從而使細(xì)胞周期停止并誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。不同類型的細(xì)胞對(duì)同種鉑金屬藥物的攝入存在種間和種內(nèi)差異。以人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780（順鉑敏感型細(xì)胞）和A2780cis（順鉑耐藥型細(xì)胞）為例，將兩種細(xì)胞暴露于相同濃度的順鉑下，采用SC-ICP-MS 檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的Pt 含量。結(jié)果表明，A2780 細(xì)胞比A2780cis 細(xì)胞積累的Pt 含量更高，并且隨著順鉑濃度增加，A2780 細(xì)胞內(nèi)Pt含量的增加程度顯著高于A2780cis 細(xì)胞[51]。此外，A2780 細(xì)胞中的Pt分布更離散，表明A2780 相較于A2780cis 細(xì)胞受Pt 暴露的影響更敏感，在攝入過(guò)程中呈現(xiàn)出更明顯的種內(nèi)異質(zhì)性[51]。不同類型的鉑金屬藥物在同種細(xì)胞中的富集也存在顯著的差異。Lim 等[52]采用順鉑、卡鉑和奧沙利鉑3 種鉑金屬藥物分別處理A2780 細(xì)胞，SC-ICP-MS 測(cè)定結(jié)果顯示，與順鉑處理的細(xì)胞相比，雖然在奧沙利鉑處理的細(xì)胞中檢出的積累有Pt 的細(xì)胞數(shù)量較低，但奧沙利鉑處理的細(xì)胞中單個(gè)細(xì)胞內(nèi)積累的Pt 含量反而增加了約1.2 倍。另一方面，卡鉑處理的細(xì)胞中積累Pt 的細(xì)胞數(shù)量以及單個(gè)細(xì)胞內(nèi)積累的Pt 含量與順鉑處理的細(xì)胞相比均低約2 倍[52]。此外，在以野生型癌細(xì)胞系（A24）和相關(guān)抗性亞系（A24dPt2、A24dPt4 和A24dPt8）為研究對(duì)象進(jìn)行的順鉑攝取實(shí)驗(yàn)中，除了得到上述類似的結(jié)果外，更重要的是使用SC-ICP-MS 在不同細(xì)胞系的細(xì)胞核上都檢測(cè)到極高的順鉑濃度，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高。使用質(zhì)量守恒計(jì)算得到細(xì)胞核內(nèi)順鉑的平均濃度比細(xì)胞質(zhì)約高兩倍，表明順鉑主要作用于細(xì)胞核的DNA[53]。因此，SC-ICP-MS方法具有區(qū)分對(duì)藥物敏感和耐受的不同細(xì)胞系之間差異的潛力，有助于研究細(xì)胞對(duì)金屬藥物的耐藥性機(jī)理和預(yù)測(cè)金屬藥物的治療效果，金屬藥物治療也需要針對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性制定一定的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

3.2.3 納米顆粒的檢測(cè)

納米顆粒因其獨(dú)特的理化性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于生物、材料和能源等領(lǐng)域。近年來(lái)，納米顆粒的環(huán)境與健康風(fēng)險(xiǎn)日益受到關(guān)注，對(duì)細(xì)胞的納米顆粒攝入、耐受性和累積效應(yīng)的研究逐漸增多。

金納米顆粒（AuNPs）由于化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且制備過(guò)程簡(jiǎn)單，常作為研究納米顆粒在單細(xì)胞中攝入行為的模型分析物。Merrifield 等[13]在探究淡水藻（卵形引藻）對(duì)AuNPs 的攝入時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間和濃度的增加，含Au 細(xì)胞的百分比和每個(gè)細(xì)胞中的Au 含量均顯著增加，并且在細(xì)胞內(nèi)具有持久性。Oliver 等[15]在人類急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系（THP-1）攝入銀納米顆粒（AgNPs）的研究中也觀察到相似的結(jié)果。在量子點(diǎn)（羧基CdSeS）的攝入動(dòng)力學(xué)研究中，研究者對(duì)比了SC-ICP-MS 和流式細(xì)胞術(shù)兩種單細(xì)胞技術(shù)對(duì)小鼠白血病單核巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)整體趨勢(shì)一致，即CdSeS 的攝取在前8 h 逐漸增加，并在8～12 h 趨于平穩(wěn)。但是，由于量子點(diǎn)的聚集、降解和熒光淬滅，流式細(xì)胞術(shù)在12 h 與2 h 的歸一化熒光強(qiáng)度的比值比SC-ICP-MS 的歸一化Cd 強(qiáng)度比值低2.8 倍，而SC-ICP-MS 可通過(guò)元素直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的量子點(diǎn)及其降解產(chǎn)物，因此可作為量子點(diǎn)攝取動(dòng)力學(xué)研究的重要手段[17]。Cassano 等[54]以摻雜AuNPs 的聚乙烯（PE-Au）和聚氯乙烯（PVC-Au）作為模型探究人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2）和小鼠白血病單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）對(duì)納米塑料的攝入，證實(shí)了納米塑料的內(nèi)吞途徑以及與細(xì)胞膜和微絨毛的相互作用。同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)，雖然當(dāng)細(xì)胞暴露于100 μg/mL 的PE-Au 或PVC-Au 時(shí)，在RAW 264.7 和Caco-2 細(xì)胞中都檢測(cè)到內(nèi)化的納米塑料；當(dāng)納米塑料暴露條件為1 μg/mL 時(shí)，Caco-2 細(xì)胞內(nèi)卻未檢測(cè)到任何內(nèi)化的PE-Au 或PVC-Au?？紤]到環(huán)境中尺寸低于0.5 μm的塑料碎片的濃度可能比實(shí)驗(yàn)研究濃度低幾個(gè)數(shù)量級(jí)（約1 μg/L）， 表明不現(xiàn)實(shí)的劑量條件可能導(dǎo)致關(guān)于塑料垃圾對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)影響的誤導(dǎo)性結(jié)論[54]。

需要指出的是，在SC-ICP-MS 分析模式下，有別于溶解態(tài)元素產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)信號(hào)，單個(gè)細(xì)胞和納米顆粒均會(huì)產(chǎn)生瞬態(tài)峰信號(hào)。因此，使用SC-ICP-MS 探究細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝入行為時(shí)，區(qū)分樣品溶液中游離的納米顆粒、已攝入和未攝入納米顆粒的細(xì)胞是最基本的要求。首先，可以通過(guò)檢測(cè)元素信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行粗略判斷。如圖3A 所示， 31P 的檢出可以確定這些事件均為細(xì)胞，攝入微塑料的細(xì)胞的12C 信號(hào)強(qiáng)度明顯高于未攝入微塑料的細(xì)胞[55]。為了進(jìn)一步獲取準(zhǔn)確的信息，使用SC-ICP-TOF-MS 同時(shí)測(cè)定納米顆粒和細(xì)胞的指示元素是目前常用的研究方法。如圖3B 所示， Tian 等[47]在探究藍(lán)藻細(xì)胞對(duì)AgNPs 的攝入行為時(shí)，同時(shí)檢出107Ag 和31P 的事件為攝入AgNPs 的藍(lán)藻細(xì)胞，而單獨(dú)檢出107Ag 的事件為游離的AgNPs。然而，當(dāng)納米顆粒與細(xì)胞不具有易區(qū)分的特征元素時(shí)，如探究細(xì)胞對(duì)納米塑料的攝入行為時(shí)，可以選擇化學(xué)穩(wěn)定、相對(duì)容易獲得、對(duì)元素分析無(wú)干擾的元素（通常為金屬元素）對(duì)納米塑料進(jìn)行標(biāo)記，以該元素作為納米塑料的指示元素進(jìn)行測(cè)定。圖3C 和3D 分別展示了使用Au[54]和Pd[56]標(biāo)記納米塑料之后，可以有效區(qū)分溶液中游離的納米塑料、已攝入和未攝入納米塑料的細(xì)胞。

3.3 SC-ICP-MS 同時(shí)檢測(cè)內(nèi)外源物質(zhì)

在檢測(cè)外源物質(zhì)的過(guò)程中， SC-ICP-MS 通過(guò)測(cè)定內(nèi)源元素可識(shí)別檢測(cè)到的細(xì)胞；更重要的是，在進(jìn)行外源刺激或暴露后，通過(guò)內(nèi)源元素含量的變化可以指示外源性物質(zhì)與細(xì)胞之間的相互作用。SC-ICPTOF-MS 技術(shù)通過(guò)同時(shí)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的完整質(zhì)譜，表現(xiàn)出比SC-ICP-Q-MS 更強(qiáng)的配對(duì)事件獲取能力[47]，在同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外源物質(zhì)方面發(fā)揮了重要作用。

在檢測(cè)外源元素的同時(shí)， SC-ICP-MS 可以通過(guò)同時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)源的關(guān)鍵指示元素反映細(xì)胞功能和狀態(tài)，對(duì)檢出細(xì)胞數(shù)的定量和內(nèi)外源物質(zhì)的區(qū)分有重要作用。內(nèi)源指示元素的選取標(biāo)準(zhǔn)為：（1）低電離能和低干擾；（2）在細(xì)胞中具有高且穩(wěn)定的含量[57]。P作為生物膜、酶和核酸的重要組成元素之一，通常作為多種細(xì)胞檢出和定量分析的良好指示元素[58]。Mg 作為葉綠素的重要組成元素，常作為反映浮游植物細(xì)胞生理狀態(tài)的指示元素[12]。被細(xì)胞用作酶的輔因子的必需過(guò)渡金屬元素（如Cu、Fe 和Zn）也常作為輔助指示元素[56]。在SC-ICP-MS 測(cè)定過(guò)程中，將測(cè)定到的內(nèi)源指示元素的峰信號(hào)認(rèn)定為細(xì)胞信號(hào)，進(jìn)而獲得檢出的細(xì)胞事件數(shù)。采用SC-ICP-TOF-MS 在檢測(cè)外源納米顆粒特征元素的同時(shí)檢測(cè)多種內(nèi)源指示元素，從而區(qū)分納米顆粒和細(xì)胞事件，該部分內(nèi)容已在上文詳細(xì)討論。

在進(jìn)行外源刺激或暴露后，內(nèi)源元素含量和分布也會(huì)發(fā)生變化，這種變化可指示外源影響與細(xì)胞之間的相互作用。一方面，可以體現(xiàn)外源物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。在Cr（Ⅵ）脅迫下，小球藻細(xì)胞中的Mg 元素強(qiáng)度分布變得不對(duì)稱，表明不同細(xì)胞對(duì)Cr（Ⅵ）脅迫的反應(yīng)存在差異[12]。Ca 是精子活力的關(guān)鍵元素， Zhang 等[59]發(fā)現(xiàn)，缺乏鈣泵PMCA4 的小鼠附睪精子在獲能刺激后，Ca 含量顯著高于正常精子，其它元素（如Zn、Fe、Cu 和Mn）的含量和動(dòng)態(tài)變化也與正常精子不同，提示元素平衡失調(diào)。此外， Lum 等[41]將小球藻暴露于AgNPs 中，使用SC-ICP-TOF-MS 同時(shí)檢測(cè)單個(gè)藻細(xì)胞的內(nèi)源性元素。第72 h 和第168 h的測(cè)定結(jié)果顯示，未暴露AgNPs 的單個(gè)藻細(xì)胞中Mn/Mg 的質(zhì)量比隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，而AgNPs 暴露組中單個(gè)藻細(xì)胞中Mn/Mg 的質(zhì)量比率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，表明AgNPs 可能會(huì)通過(guò)影響藻細(xì)胞對(duì)礦物元素的吸收，進(jìn)而影響藻類生長(zhǎng)。另一方面，可以根據(jù)內(nèi)源元素的含量和分布推測(cè)外源物質(zhì)的作用。von der Au等[60]將硅藻細(xì)胞暴露于5 種不同劑量的Zn（0、0.1、0.5、1 和5 mg/L）， 對(duì)細(xì)胞中同時(shí)檢出的Mg、Si、P、Fe和Zn 進(jìn)行典型判別分析（Canonical discriminant analysis）， 0、0.5、1 和5 mg/L Zn 暴露組中至少有75%的細(xì)胞事件，并且0.1 mg/L Zn 暴露組中約60%的細(xì)胞事件可以正確地對(duì)應(yīng)到相應(yīng)的暴露劑量組中，這種分析方法為研究潛在有害物質(zhì)和聯(lián)合毒性提供了新的見(jiàn)解。

4 結(jié)論與展望

隨著儀器和方法學(xué)的發(fā)展，SC-ICP-MS 分析技術(shù)可以通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析獲得比總量分析更多的信息。在相同條件下，研究細(xì)胞之間的元素含量差異和細(xì)胞內(nèi)源元素分布規(guī)律可以為區(qū)分細(xì)胞系或細(xì)胞亞群提供新的見(jiàn)解；對(duì)外源物質(zhì)的攝取動(dòng)力學(xué)研究，為金屬藥物、納米材料的制備和使用提供了毒理學(xué)數(shù)據(jù)。探索細(xì)胞不同元素之間以及元素與生理指標(biāo)之間的關(guān)系有助于了解細(xì)胞與外源物質(zhì)的相互作用，評(píng)估不同物種的細(xì)胞在應(yīng)對(duì)外部壓力時(shí)的差異，并提供有關(guān)作用機(jī)制的重要信息?？傊?， SC-ICP-MS是一種有良好發(fā)展前景的單細(xì)胞分析工具。同時(shí)，在以下方面仍有許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)值得探討。

（1）方法學(xué)研究在基于SC-ICP-MS 的單細(xì)胞分析中占有重要地位。首先，需提高單細(xì)胞樣品制備的效率和準(zhǔn)確性。近年來(lái)，微流控芯片由于具有成本低、制備簡(jiǎn)單、用途廣泛、易于設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用[61-62]，在單細(xì)胞樣品制備環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)了快速、高通量的細(xì)胞聚焦和分選，減少了傳統(tǒng)的純化、離心和洗滌等操作過(guò)程中的細(xì)胞損失，具有良好的發(fā)展前景。其次，需要優(yōu)化細(xì)胞傳輸效率的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，基于細(xì)胞內(nèi)源高豐度元素制定內(nèi)標(biāo)方法可更有針對(duì)性地評(píng)估不同種類細(xì)胞的傳輸效率。此外，應(yīng)建立細(xì)胞離子化效率的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，并優(yōu)化等離子體參數(shù)，提高細(xì)胞離子化效率。

（2） SC-ICP-MS 技術(shù)與其它分析技術(shù)耦合是未來(lái)單細(xì)胞分析的發(fā)展方向。一方面，相較于對(duì)某種元素的常規(guī)測(cè)定，這種技術(shù)的耦合可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)元素形態(tài)分析。如液滴裂解微芯片可作為樣品引入系統(tǒng)與ICP-MS 結(jié)合，對(duì)單細(xì)胞中FePt 納米粒子和釋放出的Fe、Pt 分別進(jìn)行定量分析[63]。Yu 等[64]在使用SC-ICP-MS 測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總Zn 的同時(shí)，以N-（6-甲氧基-8-喹諾基）對(duì)甲苯磺胺為探針，結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性Zn 的變化，為探索生物學(xué)的復(fù)雜性提供了新思路。另一方面，通過(guò)將SC-ICP-MS 與光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)[65]和熒光系統(tǒng)[61，66]相結(jié)合，在單細(xì)胞水平上可同步獲得金屬攝取、光學(xué)和蛋白表達(dá)信息。這種多維度的信息整合提供了一個(gè)更加全面的細(xì)胞功能和狀態(tài)的視角。后續(xù)還可以結(jié)合抗體標(biāo)記、多維成像和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等技術(shù)，開(kāi)發(fā)多參數(shù)細(xì)胞分析平臺(tái)和對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)分析方法，開(kāi)辟基于單細(xì)胞的多維數(shù)據(jù)集成和生物信息學(xué)的新領(lǐng)域。

（3）隨著技術(shù)的進(jìn)步， SC-ICP-MS 在環(huán)境科學(xué)、生物學(xué)、制藥學(xué)、毒理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來(lái)越重要的作用。未來(lái)可進(jìn)一步通過(guò)同位素標(biāo)記、金屬標(biāo)記和元素指紋等手段研究新型污染物、新型金屬藥物以及新型納米材料等在細(xì)胞水平上對(duì)生物體的影響，評(píng)估其生物積累和毒性效應(yīng)，為其設(shè)計(jì)、使用和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)的依據(jù)。