慈姑葉片結構的光學顯微鏡和掃描電鏡觀察

葉元英，柯衛(wèi)東，李峰，劉玉平，劉正位，付婧，匡晶，黃來春，李明華

（武漢市蔬菜科學研究所，430065）

慈姑（Sagittaria trifoliaL.）屬澤瀉科，原產(chǎn)中國，是一種經(jīng)濟價值及觀賞價值很高的水生草本植物[1，2]。慈姑在系統(tǒng)演化進程中，長期適應水生生態(tài)環(huán)境，葉形成了獨特的異葉性，無論是用種子繁殖還是用球莖繁殖的慈姑均有3種不同形狀的葉片：最初發(fā)芽長出的第1～2片葉沉在水中，為沉水葉，呈帶狀；第3～4片一面漂浮在水面上，卵圓至橢圓形，為浮葉；以后長出的葉挺出水面為挺水葉，呈箭形。國內(nèi)有植物學工作者對慈姑的根、莖和花部結構有過詳細研究[3～5]。筆者采用光學顯微鏡和掃描電鏡顯微技術，對慈姑葉進行了詳細的觀察，為慈姑的獨特結構與功能的相關性、分類地位及個體發(fā)育方面提供一些必要的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用武漢市蔬菜科學研究所慈姑資源刮老烏2013年實生苗。在慈姑生長周期中不同時期選取沉水葉、浮葉和挺水葉為試驗材料。

1.2 試驗方法

①葉表皮臨時標本制作與光學顯微鏡觀察從3種不同葉片的脈間區(qū)域上剪取若干約1 cm×0.5 cm的小塊，沸水浴20 min；再浸入20%次氯酸鈉溶液中，在35℃左右的溫箱中浸泡4～5 h；取出葉片用蒸餾水沖洗干凈，用鑷子撕下葉片中部或近中部中脈附近的表皮，1%番紅染色3～5 min，用IX70顯微鏡觀察（奧林巴斯，日本）。隨機選取10個左右視野，對氣孔器記數(shù)并選取20個左右氣孔測量大小，觀察倍數(shù)均為5倍。

②葉片石蠟切片觀察 取3種類型葉片，用卡諾固定液固定24 h后，乙醇逐級脫水，氯仿透明，石蠟包埋。手動切片機切片，厚10～12 μm，番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封片。于光學顯微鏡下觀察，其葉脈及葉片均為橫切結構，觀察倍數(shù)均為10倍。

③掃描電鏡標本制作及表皮氣孔形態(tài)觀察 從上述3種葉片的脈間區(qū)域上剪取若干0.5 cm×0.5 cm的小塊，經(jīng)2.5%戊二醛液固定，丙酮逐級脫水，醋酸異戊醇處理，CO臨界點干燥，真空噴鍍黃金，S-570掃描電鏡（日立，日本）觀察葉表皮氣孔，其觀察倍數(shù)均為1 500倍。

2 結果與分析

2.1 光學顯微鏡觀察上表皮細胞

3種類型葉中，同一類型葉片上下表皮結構相似，本文以葉片上表皮為例進行比較。

沉水葉表皮細胞呈規(guī)則矩形，細胞間排列緊密，氣孔器極少，觀察多個視野才有1個氣孔器。氣孔器在葉脈處縱行排列，其氣孔細胞也呈矩形，氣孔較小，平均大小3 μm，周圍有4個細胞，形成不定細胞型氣孔器，且氣孔多閉合（圖1A）。

浮葉上表皮細胞呈多邊形，有較多的彎曲和褶皺，氣孔細胞為6邊形，排列整齊，氣孔半開，平均每個視野含氣孔5～7個，氣孔大小懸殊，為3～10 μm，平均大小為 6.4 μm（圖1B）。

挺水葉表皮細胞細胞壁略有彎曲，較浮葉的褶皺更少，每個視野氣孔6～8個，比浮葉氣孔數(shù)稍多，氣孔大小一致，為（10±1）μm。氣孔周圍通常有4個表皮細胞呈田字形排列（圖1C），氣孔多為張開。

2.2 光學顯微鏡觀察葉片橫切結構

沉水葉葉片厚100 μm左右。上表皮細胞豎長矩形，排列整齊，朝外壁稍具角質加厚，無柵欄組織細胞和海綿組織分化，未觀察到氣孔（圖2A）。下表皮細胞扁平，僅一層，細胞壁薄，無角質膜和表皮毛，有氣孔分布，葉片內(nèi)部則形成較大的氣腔，占葉肉組織的3/4，未見機械組織和維管組織。

浮葉葉片厚170～180 μm。上表皮細胞排列整齊，這與沉水葉相似，其他部位細胞排列不規(guī)則，葉肉增厚，含一層柵欄組織細胞，排列疏松，海綿組織發(fā)達（圖2D），且大多形成空腔（圖2B）。浮葉機械組織增強，中部維管束增大，使下表面往外突起，氣腔占葉肉比例1/2，葉片近外圍氣腔較小，愈近中部氣腔愈大。

挺水葉葉片厚300 μm左右。上表皮細胞長矩形，排列整齊，緊貼上表皮有垂直排列的2層柵欄組織（圖2C），且排列緊密，細胞質濃厚，含大量葉綠體，其下方為海綿組織，結構緊密，氣腔明顯減少，約占葉肉的2/5，常有單寧細胞分布、以靠下表皮的組織中分布較多。機械組織發(fā)達，維管束遍布整個葉肉中，以中部葉脈最多，縱向排列有5個，中間一個最大。初生木質部在上脈由1維管束向2維管束分化時，首先是木質部的分化，然后是韌皮部的分化。邊緣維管束在末端相互連成網(wǎng)狀，葉脈小，組成分子簡單，常只有管胞及薄壁細胞（圖2E）。

2.3 掃描電鏡觀察葉表皮氣孔器

慈姑3種不同葉片各有3種不同氣孔器分布和類型，沉水葉氣孔數(shù)少，閉合，小而凹陷，保衛(wèi)細胞和副保衛(wèi)細胞排列不平整，皺褶（圖3A）。浮葉氣孔器突出，開放，邊緣不規(guī)則，較粗糙，其表面布滿了蠟質顆粒（圖3B）。挺水葉氣孔同樣突出，開放，氣孔飽滿，邊緣平滑，有較少的蠟質顆粒（圖3C），有時還觀察到并列相連的二氣孔器，其周圍有 6～7個表皮細胞包圍。

圖1 慈姑葉上表皮光鏡照片

圖2 慈姑葉片石蠟切片

3 結果與討論

慈姑在發(fā)育的過程中，3種異形葉的葉片由沉水葉到浮葉再到挺水葉。其形態(tài)和內(nèi)部結構均有不同，體現(xiàn)了其對不同環(huán)境的適應性。

①氣孔從少到多，結構從簡單到復雜 沉水葉氣孔量少且閉合，表明此時可能不需要氣孔承擔氣體交換的功能，氣體交換主要靠薄壁細胞滲透完成。其浮葉有較多的開放氣孔，表明已具備了氣體交換功能，但氣孔大小較為懸殊，可能部分氣孔發(fā)育仍不完全。更為特別的是浮葉氣孔周圍常常含大量的蠟質顆粒，這可能有助于浮葉在波浪和雨天環(huán)境中避開水珠，發(fā)揮其氣體交換功能，充分體現(xiàn)了對環(huán)境的適應性。挺水葉則具備成熟、整齊的氣孔，其氣孔附近的蠟質顆粒較少，和一般陸生植物氣孔相似。

圖3 慈姑氣孔電鏡照片

②葉片中氣腔量從多到少 沉水葉葉片中的大量氣腔可儲備較多的空氣，讓沉水葉在水中能充分展開，接受陽光。而從浮葉到挺水葉，其氣腔逐漸減少，表明在水下到水上的發(fā)育過程中，隨著周圍空氣的增加，其葉片對空氣輸送的要求逐漸減少，體現(xiàn)了沉水植物到陸生植物的發(fā)育過程。

③葉片組織結構由簡單到復雜 沉水葉僅由幾層細胞構成，結構簡單，疏導組織和維管束均較為簡單，機械組織不發(fā)達，體現(xiàn)了沉水植物的特點。而挺水葉則有完整的柵欄組織、海綿組織、疏導組織和機械組織等，這又和陸生植物葉片較為相似。

筆者觀察到慈姑沉水葉到挺水葉的結構變化，反映出葉在生長發(fā)育過程中解剖結構與生態(tài)條件相通應的辯證規(guī)律，也一定程度上展現(xiàn)了葉片從沉水植物到陸生植物的進化過程。此外，慈姑屬于澤瀉科慈姑屬，有不少人認為澤瀉科是單子葉植物中最原始科之一，目前對該科在系統(tǒng)學上的位置仍有著不同的意見。本文對慈姑葉片發(fā)育形態(tài)的觀察為其分類學研究提供了參考。

[1]中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所.中國蔬菜栽培學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1987：489-495.

[2]趙有為.中國水生蔬菜[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[3] 徐祥生，施國新.慈姑（Sagittaria sagittifoliaL.）形態(tài)研究（三）胚和胚乳發(fā)育及種子形成[J].南京師大學報：自然科學版，1984（1）：78-82.

[4]施國新，徐祥生，陳維培.慈姑主莖和匍匐莖的形態(tài)解剖學研究[J].南京師大學報：自然科學版，1989，12（1）：73-81.

[5]施國新，徐祥生，陳維培.慈姑匍匐莖的起源和球莖的膨大研究[J].武漢植物學研究院，1989，7（3）：205-209.

[6]李坊貞，程景福，何宗智.蓮（Nelurnbo nucifera）葉片結構的光鏡和掃描電鏡的觀察 [J].南昌大學學報：理科版，1993，17（4）：91-96.