三種促生細(xì)菌對(duì)人參及其根際微生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的影響

摘要：為促進(jìn)大田栽參土壤改良，并開發(fā)功能性微生物菌肥，以3種促生細(xì)菌［歐文氏菌屬（Erwinia）G115、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum） G119和賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）G209］分別處理大田栽參土壤，對(duì)人參根際細(xì)菌群體組成結(jié)構(gòu)、土壤理化性質(zhì)及人參幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定，研究根際促生細(xì)菌對(duì)人參的促生效應(yīng)和對(duì)根際微生物群落及功能的影響。結(jié)果表明，促生細(xì)菌處理人參幼苗與對(duì)照組相比，根際土壤有機(jī)質(zhì)、總氮、pH和葉干重變化不大，有效磷、速效鉀、蔗糖酶、根際土壤脲酶和根鮮重有顯著差異。3種促生細(xì)菌處理與對(duì)照組相比，包括變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）等8個(gè)菌門人參根際細(xì)菌門水平相對(duì)豐度大于1%，其中變形菌門是主要優(yōu)勢(shì)菌門。3種促生細(xì)菌處理對(duì)人參根際細(xì)菌屬水平影響較大，其中，根瘤菌屬（Rhizobium）是促生細(xì)菌處理后與對(duì)照差異顯著且豐度大于1%的共有菌屬，所有豐度大于1%的屬促生細(xì)菌處理后其增加的相對(duì)豐度比例均在120%以上。通過(guò)PICRUSt軟件預(yù)測(cè)3種促生細(xì)菌處理后人參根際細(xì)菌功能，獲得一級(jí)功能層6個(gè)方面的生物代謝功能，二級(jí)功能層35種預(yù)測(cè)功能，三級(jí)功能層33種預(yù)測(cè)功能，與對(duì)照組相比，外源促生細(xì)菌處理可改變?nèi)藚⒏H細(xì)菌多方面的功能，且改變功能的效果是雙向的，既有增加的效果，也有降低的效果。說(shuō)明外源促生細(xì)菌處理可改變?nèi)藚⒏H細(xì)菌群落的遺傳多樣性，顯著增加根系分泌物和細(xì)菌感受信號(hào)等功能。

關(guān)鍵詞：人參；促生細(xì)菌；根際細(xì)菌；群體結(jié)構(gòu)；功能預(yù)測(cè)

收稿日期：2024-07-10

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳項(xiàng)目（20230402028GH）；延邊州科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（492023018）。

第一作者：王秋宇（2000-），男，碩士研究生，從事特種作物資源與利用研究。E-mail：1960244503@qq.com。

通信作者：南力（1988-），女，博士，碩導(dǎo)，從事植物栽培和抗氧化活性、特種作物資源與利用研究。E-mail：nanli12@163.com。

人參（Panax ginseng C. A. Mey）號(hào)稱“百草之王”，為五加科（Araliaceae）人參屬（Panax）多年生宿根性草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材之一^［1］。人參對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)的疾病都有較好的治療作用。近年來(lái)，由于人們對(duì)替代醫(yī)學(xué)和健康食品的關(guān)注度日益增加，具有補(bǔ)益功效的人參消費(fèi)市場(chǎng)不斷擴(kuò)大，人參用量大幅提高。中國(guó)東部長(zhǎng)白山區(qū)，具有以人參為主體獨(dú)特豐富的特產(chǎn)資源，并已經(jīng)形成了特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基本規(guī)模。為提高人參保苗率和產(chǎn)量，人參種植過(guò)程中大量添加農(nóng)藥和化肥，導(dǎo)致生產(chǎn)的藥材農(nóng)殘及重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)，加之人參種植過(guò)程中較為嚴(yán)重的連作障礙經(jīng)常發(fā)生，這些問題嚴(yán)重制約了人參種植業(yè)的綠色健康發(fā)展。

Kloepper等^［2］引入了植物根際促生細(xì)菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria， PGPR）這個(gè)術(shù)語(yǔ)，PGPR是指在植物根際（或根內(nèi)）定殖能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌。根際是植物根系存在的土壤環(huán)境，是微生物活動(dòng)最活躍的區(qū)域，它形成一個(gè)有限的營(yíng)養(yǎng)池，微生物在其中提取必要的大量和微量營(yíng)養(yǎng)素^［3］。植物根分泌物能夠調(diào)整微生物群落以應(yīng)對(duì)環(huán)境變化，微生物也通過(guò)自身代謝活動(dòng)改變根系分泌物的組成以利于自身生存。通過(guò)外源添加具有特定功能的PGPR，改變根際微生物的優(yōu)勢(shì)或特定菌群的豐度和多樣性，進(jìn)一步影響根圍微環(huán)境，最終調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。PGPR作為生物肥料正成為有機(jī)農(nóng)業(yè)的一個(gè)重要方面，并逐漸成為全球經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要參與者。然而，生物肥料應(yīng)用的影響因素較多，使用的生物肥料是否會(huì)破壞土壤中微生物的相互作用，是需要進(jìn)一步深入探討的課題。

高通量測(cè)序被稱為下一代測(cè)序技術(shù)（Next Generation Sequencing， NGS），它能夠利用從環(huán)境等樣本中獲取的基因組DNA直接構(gòu)建文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序分析，在微生物的群落結(jié)構(gòu)分析方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)^［4］。高通量測(cè)序產(chǎn)生的16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋率極高，可以較全面地估計(jì)微生物群體的物種組成和豐度，與傳統(tǒng)方法相比，具有能夠更加真實(shí)地揭示環(huán)境微生物群體豐富度和多樣性的特性^［5］。目前對(duì)非林地栽參的研究主要包括土壤養(yǎng)分^［6］、土壤酶活性^［7］、人參皂苷和病蟲害防治等方面，且大多是基于可控環(huán)境的盆栽試驗(yàn)的結(jié)果，而探討促生菌對(duì)農(nóng)田人參根際細(xì)菌群落影響方面的研究較少。本研究于農(nóng)田環(huán)境下接種前期篩選的促生菌，探討其對(duì)人參根圍細(xì)菌群落豐度、多樣性及其基因功能的影響，以期為促生菌作為生物菌肥的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試人參品種為大馬牙，種子采自延邊朝鮮族自治州和龍參場(chǎng)。試驗(yàn)于2023年5月在吉林省延邊朝鮮族自治州敦化農(nóng)田人參栽培基地進(jìn)行，田間管理與正常林地人參場(chǎng)管理相同。

1.2 方法

1.2.1 人參根際土壤采集和促生菌分離鑒定 于延邊朝鮮族自治州和龍參場(chǎng)，采用多點(diǎn)取樣法，取樣地設(shè)置3個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)選取10株人參根際土進(jìn)行混合。采集時(shí)先除去土壤表面枯枝落葉層，將人參整根挖起，將人參根部附著土壤輕輕抖落后，收集須根2 mm范圍內(nèi)的土壤，裝入保鮮袋，保存在4 ℃冰箱中。

促生菌分離和鑒定：利用稀釋倍數(shù)法制備人參根際土壤和根內(nèi)生細(xì)菌稀釋液，利用涂布平板法均勻地涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、R₂A瓊脂培養(yǎng)基（R₂A）、金氏培養(yǎng)基（KBA）中，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取單一菌落，劃線接種到新的純化培養(yǎng)基，多次重復(fù)直至獲取單一菌株。分離細(xì)菌的促生功能分別進(jìn)行溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)吲哚乙酸、產(chǎn)ACC脫氨酶等方面的篩選，并選取功能較好的細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定^［8］。

1.2.2 促生菌對(duì)人參影響的田間試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)：人參種子依次用75%乙醇浸泡5 min，1%次氯酸鈉浸泡5 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次。將滅菌的人參種子播種于田間，試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，包括3種促生菌處理和1個(gè)對(duì)照組（無(wú)菌水）處理，處理1（CK）：無(wú)菌水；處理2：歐文氏菌屬（Erwinia）G115菌劑;處理3：蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）G119菌劑；處理4：賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）G209菌劑。每個(gè)處理20次重復(fù)，共處理80株人參。出苗后，對(duì)各處理長(zhǎng)勢(shì)良好的人參幼苗根圍灌入相應(yīng)的菌劑，每株30 mL，菌液濃度均為1.0×10⁸ CFU·mL^-1，對(duì)照組灌入30 mL無(wú)菌水，每隔6 d施入1次，共施入8次。

樣品采集：8次菌液施入結(jié)束后，于70 d后采用多點(diǎn)取樣法，取樣地設(shè)置3個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)選取10株一年生人參全株，用無(wú)菌剪刀將整株人參根、莖分離，置于50 mL滅菌離心管中，加入磷酸緩沖鹽溶液（pH7.8）40 mL，放入冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。置于空氣浴振蕩器振蕩2 h，轉(zhuǎn)速為200 r·min^-1，取出人參根，10 000 r·min^-1離心，倒掉上層液體，下層沉淀即為根際土壤樣本。

1.2.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法 （1）生物量參數(shù)測(cè)定：稱量采集樣本鮮根質(zhì)量和干葉質(zhì)量， 3次重復(fù)。

（2） 土壤理化指標(biāo)和酶活的測(cè)定：采用凱氏消化AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤全氮含量。前處理用H₂SO₄/HClO₄和NaHCO₃萃取消解后，采用流動(dòng)注射自動(dòng)分析儀（Technicon，AA3，德國(guó)）測(cè)定土壤總氮 （TN）^［9］；利用重鉻酸鉀法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)含量^［10］。按照毛雪梅^［11］的方法測(cè)定土壤有效磷、速效鉀的含量。分別按照Piotrowska等^［12］、Han等^［13］的方法測(cè)定土壤脲酶、蔗糖酶活性。

（3）細(xì)菌基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增：采用FastDNA^? SPIN Kit for Soil 試劑盒（MP Biomedicals， Solon， USA）提取。以稀釋后的基因組DNA為模板，采用16S rRNA V3-V4區(qū)帶Barcode的特異引物515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和907R：CCGTCAATTCCTTTGAGTTT進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用英國(guó)Biolabs公司 Phusion^? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer的酶和緩沖液。30 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Phusion Master Mix（2×）15 μL；引物（2 μmol·L^-1）3 μL；模板DNA（1 ng·μL^-1）10 μL；無(wú)菌水 2 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s；53 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共29個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，切膠回收目的條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用GeneJET膠回收試劑盒（Thermo Scientific）。

（4）文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序：文庫(kù)的構(gòu)建采用New England Biolabs 公司的NEB Next^? Ultra^TM DNA Library Prep Kit for Illumina建庫(kù)試劑盒，利用Qubit定量和檢測(cè)構(gòu)建好的文庫(kù)，檢測(cè)合格后使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.2.4 物種多樣性組成和功能分析 物種注釋與評(píng)估：測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過(guò)濾，去除barcode和引物序列，采用UCHIME軟件進(jìn)一步去掉嵌合體序列，以矯正測(cè)序誤差，最終得到有效數(shù)據(jù)以備進(jìn)一步分析。依據(jù)Edgar^［14］的UPARSE方法，將上述獲得的優(yōu)質(zhì)序列根據(jù)大于或等于97%相似度的原則進(jìn)行OTU聚類，進(jìn)而選出各OTU中數(shù)量最多的序列為代表性序列，即為OTU對(duì)應(yīng)的物種分類。以O(shè)TU聚類結(jié)果為基礎(chǔ)，注釋每個(gè)OTU的代表序列，獲得相應(yīng)的物種信息以及豐度分布。基于OTUs計(jì)算樣品的多樣性指數(shù)，包括Shannon、Simpson、Chao1、ACE指數(shù)等。獲得的 OTUs與RDP（Ribosomal Database Project）數(shù)據(jù)庫(kù)已知序列進(jìn)行比對(duì)，利用PyNAST軟件（Python Nearest Alignment Space Termination）將代表性序列與參比序列均勻?qū)R^［15］。最后，用Fast tree軟件^［16］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析采用對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線（rarefaction curve），以得出樣品的取樣深度情況。默認(rèn)是在97%相似性水平下劃分OTU并制作各樣品的稀釋曲線。

物種組成和樣本比較分析：基于OTUs繪制Venn圖，獲取單個(gè)樣品內(nèi)部物種豐度和均勻度，以及不同樣品間的共有和獨(dú)有的OTUs信息等。進(jìn)行群落組成分析，建立群落柱形圖、Heatmap圖等。通過(guò)PCoA、PCA和NMDS等分析進(jìn)一步獲取不同樣品之間的群落結(jié)構(gòu)差異，降維圖和樣品聚類樹進(jìn)行展示。結(jié)合環(huán)境參數(shù)進(jìn)行CCA/RDA分析與環(huán)境因子的相關(guān)性分析，獲取影響組間群落差異的環(huán)境因子。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的β多樣性使用基于Unweighted Unifrac矩陣的Principal Component Analysis（PCA）分析，各樣品細(xì)菌群落的分級(jí)聚類（Hierarchical clustering）采用UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）方法進(jìn)行分析，Mantel test 用于分析細(xì)菌整體群落與環(huán)境理化參數(shù)之間的相關(guān)性，以上分析使用R軟件（Version 3.3.2）的vegan數(shù)據(jù)包操作完成。

采用PICRUSt軟件預(yù)測(cè)分析促生菌處理后人參根際細(xì)菌功能，通過(guò)分別與KEGG功能數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的比對(duì)分析，獲得一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)功能層方面的變異信息。

PICRUSt基因功能預(yù)測(cè)分析：先根據(jù)已測(cè)微生物基因組的16S rRNA基因全長(zhǎng)序列，推斷它們的共同祖先的基因功能譜；對(duì)Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)中其他未測(cè)物種的基因功能譜進(jìn)行推斷，構(gòu)建細(xì)菌域全譜系的基因功能預(yù)測(cè)譜，將測(cè)序得到的菌群組成“映射”到數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)菌群代謝功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。將biom文件上傳至Galaxy網(wǎng)站（http：//picrust.github.io/picrust/），獲得COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)功能預(yù)測(cè)信息，參考KEGG Orthology功能基因類別將此預(yù)測(cè)信息劃分歸類，即得到該預(yù)測(cè)基因組的功能基因豐度，采用Heml heatmap illustrator program（1.0.3）軟件繪制熱圖。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 使用Excel 2010和SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用雙因素方差分析來(lái)評(píng)估各處理之間的顯著性差異水平。使用最小顯著差異（Plt;0.05）來(lái)進(jìn)行不同處理間均值的顯著性差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 促生細(xì)菌功能篩選與鑒定

由表1可知，經(jīng)功能篩選獲得表現(xiàn)較好的3株促生細(xì)菌G115、G119、G209。G115菌株具有溶磷能力、產(chǎn)氨氣能力、產(chǎn)鐵載體能力、解鉀能力、產(chǎn)ACC能力；G119菌株具有產(chǎn)氨氣能力、解鉀能力、產(chǎn)ACC能力；G209菌株具有溶磷能力、產(chǎn)氨氣能力、產(chǎn)鐵載體能力。且3株促生細(xì)菌都具有抑制黑霉病和灰斑病的能力。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定結(jié)果3株促生細(xì)菌分別為歐文氏菌屬（Erwinia persicina）G115、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum pituitosum）G119、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）G209，菌株形態(tài)如圖1所示。

G115菌株為白色菌落，圓形且扁平，表面不光滑且不透明，邊緣整齊，有光澤。G119菌株為白色菌落，圓形且近乎球形，表面光滑且不透明，邊緣整齊，有光澤。G209菌株為粉色菌落，形狀為圓形，表面平整光滑且不透明，邊緣整齊，有光澤。

2.2 促生細(xì)菌對(duì)人參幼苗的影響

2.2.1 促生細(xì)菌對(duì)人參幼苗生物量的影響 由表2可知，G115、G119、G209三種不同的促生細(xì)菌處理人參幼苗組與對(duì)照組相比，葉干重并未受到顯著影響，各處理人參葉干重基本穩(wěn)定在0.03～0.04 g。G119和G209處理組的人參幼苗根鮮重均顯著高于對(duì)照組，分別提高了48.1%和53.8%。G119和G209兩種促生細(xì)菌在促進(jìn)人參幼苗根系生長(zhǎng)方面具有顯著效果。G155處理組根鮮重與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

2.2.2 促生細(xì)菌對(duì)人參土壤理化指標(biāo)的影響 由表3可知，G115、G119、G209三種不同的促生細(xì)菌處理組與對(duì)照組相比，人參土壤pH、有機(jī)質(zhì)、土壤總氮均無(wú)顯著性差異。G119和G209處理有效磷含量顯著高于對(duì)照處理，分別提高了69.9%和68.9%。G115處理組與對(duì)照組有效磷含量無(wú)顯著性差異。G119和G209處理速效鉀含量顯著高于對(duì)照處理，分別提高了8.6%和13.4%。G115處理組與對(duì)照組速效鉀含量無(wú)顯著性差異。

2.2.3 促生細(xì)菌對(duì)人參土壤酶活性的影響 由表4可知，G119和G209處理脲酶活性顯著高于對(duì)照處理，均提高了15.3%。G115處理組與對(duì)照組脲酶活性無(wú)顯著性差異。G119和G209處理的蔗糖酶活性均顯著高于對(duì)照組，均能有效提高土壤蔗糖酶活性。G115處理組提升幅度相對(duì)較小，提高了7.4%。G119和G209處理組分別提高了13.1%和15.6%。

2.3 促生細(xì)菌對(duì)人參根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成的影響

2.3.1 測(cè)序結(jié)果及質(zhì)量評(píng)估 經(jīng)測(cè)序共獲得1 355 819條雙端序列，經(jīng)過(guò)過(guò)濾和連接，得到921 375條有效序列，其中各樣本特有序列平均為5 402個(gè)，平均讀長(zhǎng)為416 bp。拼接和優(yōu)化后的序列被隨機(jī)抽平至55 000條用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。在97%相似水平下進(jìn)行OTU聚類以進(jìn)行物種注釋，15個(gè)樣品OTU數(shù)量為3 139～3 599個(gè)，總計(jì)產(chǎn)生OTU為49 210個(gè)。各樣品的稀釋性曲線均隨測(cè)序的深入逐漸平緩并逐漸與橫坐標(biāo)平行，各樣品的測(cè)序數(shù)量約為55 000條時(shí)測(cè)序趨向于飽和，說(shuō)明此測(cè)序數(shù)據(jù)量能夠體現(xiàn)各樣品真實(shí)物種多樣性。通過(guò)分析樣本量飽和度，隨樣本數(shù)量的增加曲線趨于與橫坐標(biāo)平行，可知樣本量足夠，測(cè)序結(jié)果可用做進(jìn)一步的多樣性分析。

2.3.2 促生細(xì)菌對(duì)人參根際細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度的影響 由圖2可知，3種促生菌處理與清水對(duì)照處理人參根際細(xì)菌8個(gè)菌門相對(duì)豐度大于1%，包括變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae），變形菌門是主要優(yōu)勢(shì)菌門，對(duì)比清水對(duì)照，3種促生菌菌肥處理中，土壤中的變形菌門含量明顯升高，硝化螺旋菌門含量減少。所有處理的優(yōu)勢(shì)菌門及各處理根系細(xì)菌門水平相對(duì)豐度差異較大，說(shuō)明促生細(xì)菌改變了人參根際土壤細(xì)菌門的含量，根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣化。

由圖3可知，不同促生細(xì)菌處理后人參根際優(yōu)勢(shì)菌屬整體上由多到少為硝脂單胞菌屬（Sphingomonas）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、根瘤菌屬（Rhizobium）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、嘉利翁氏菌屬（Gaiella）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、鹽厭氧菌屬（Haliangium）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、貪噬菌屬（Variovorax）和Rhizomicrobium。各處理屬水平相對(duì)豐度范圍分別為2.41%～3.54%、2.06～3.04%、0.64%～2.27%、0.84%～2.03%、0.73%～1.58%、0.55%～1.55%、0.35%～1.49%和0.28%～1.23%。以上結(jié)果表明，外源促生細(xì)菌處理對(duì)人參根際細(xì)菌屬水平組成比例有較大影響，通過(guò)外源促生細(xì)菌處理可改變根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，有效地改變根際細(xì)菌的屬水平組成比例，促進(jìn)或抑制特定菌群的生長(zhǎng)，從而優(yōu)化根際微生態(tài)環(huán)境，為人參的生長(zhǎng)提供更為有利的條件。

2.3.3 促生細(xì)菌對(duì)人參根際細(xì)菌群落影響的差異比較 對(duì)門、綱、目、科水平各處理菌群豐度進(jìn)行比較，其具有顯著性差異Biomaker的進(jìn)化分支圖和差異菌屬示于圖4～圖9。

由圖4可知，G115促生細(xì)菌處理與清水對(duì)照處理相比，顯著增加菌群分類，包括門水平為變形菌門（Proteobacteria），綱水平為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），目水平為鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、根瘤菌目（Rhizobiales），科水平為柄桿菌科（Caulobacteraceae）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）；顯著減少的菌群包括門水平為放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria），綱水平為未鑒定的酸桿菌綱（Acidobacteria）、嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）。

由圖5可知，G119促生菌處理與清水對(duì)照處理相比，顯著增加菌群分類包括門水平為變形菌門（Proteobacteria），綱水平為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），目水平為鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales），科水平為鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）；顯著減少的菌群門水平為放線菌門（Actinobacteria），綱水平為未鑒定的放線菌綱（Actinobacteria）、嗜熱油菌綱（Thermoleophilia），目水平為黃單胞菌目（Xanthomonadales）。

由圖6可知，G209促生細(xì)菌處理與清水對(duì)照處理相比，顯著增加菌群分類包括門水平為變形菌門（Proteobacteria），綱水平為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），目水平為鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales），科水平為鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）；顯著減少的菌群包括門水平為放線菌門（Acidobacteria），綱水平為未鑒定的放線菌綱（Acidobacteria）。

由圖7可知，G115促生菌處理后顯著增加且豐度大于1%的菌屬包括根瘤菌屬（Rhizobium）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、Rhizomicrobium、柄桿菌屬（Caulobacter）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）和獨(dú)島桿菌屬（Dokdonella），其比對(duì)照增加的比例分別為254.69%、190.63%、185.71%、284.62%和180.00%；顯著減少的菌屬相對(duì)豐度均低于1%，包括土微菌屬（Pedomicrobium）等。

由圖8可知，G119促生菌處理后顯著增加且豐度大于1%的菌屬包括根瘤菌屬（Rhizobium）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）和鞘脂菌屬（Sphingobium），其增加的比例分別為132.81%、141.67%和156.36%；顯著減少的菌屬相對(duì)豐度均低于1%，包括酸胞菌屬（Acidbacter）、木洞菌屬（Woodsholea）和紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）等。

由圖9可知，G209促生菌處理后顯著增加且豐度大于1%的菌屬包括根瘤菌屬（Rhizobium）和鞘脂菌屬（Sphingobium），其比對(duì)照增加的比例分別為126.67%和210.00%。

綜上可知，G115、G119和G209促生細(xì)菌處理對(duì)人參根際細(xì)菌屬水平影響較大，其中，根瘤菌屬（Rhizobium）是促生菌處理后與對(duì)照差異顯著且豐度大于1%的共有菌屬，所有豐度大于1%的屬促生菌處理后其增加的相對(duì)豐度比例均在120%以上。

不同促生菌處理與清水對(duì)照處理的根際細(xì)菌屬水平差異比較結(jié)果表明，不同促生菌間對(duì)屬水平上的根際細(xì)菌群落組成和豐度的影響有顯著的遺傳差異，通過(guò)外源促生菌處理可以改變?nèi)藚偎缴系母H細(xì)菌群落組成和豐度，進(jìn)而改變屬水平上的根際細(xì)菌遺傳多樣性。

2.4 促生細(xì)菌對(duì)人參根際細(xì)菌群落多樣性的影響

由圖10可知，各處理的Shannon指數(shù)由大到小依次為CK、G119、G209、G115，其中G119和G209促生菌處理與清水對(duì)照處理相比無(wú)顯著性差異，G115處理與清水對(duì)照處理相比差異顯著；各處理的Simpson指數(shù)由大到小依次為CK、G119、G209、G115，其中G119和G209促生菌處理與清水對(duì)照處理相比無(wú)顯著差異，G115促生菌處理與清水對(duì)照處理相比差異顯著；各處理的Chao1指數(shù)由大到小依次為CK、G209、G119、G115，其中G119和G209促生菌處理與清水對(duì)照處理相比無(wú)顯著差異，G115促生菌處理與清水對(duì)照處理相比差異顯著；各處理的ACE值由大到小依次為CK、G209、G119、G115，其中G119和G209促生菌處理與清水對(duì)照處理相比無(wú)顯著差異，G115促生菌處理與清水對(duì)照處理相比差異顯著。

由以上結(jié)果可知，G119和G209促生菌處理后的人參根際細(xì)菌群落多樣性和豐富度基本不變，而G115促生菌處理后人參根際細(xì)菌群落多樣性和豐富度反而均降低。說(shuō)明通過(guò)外源促生菌處理可改變?nèi)藚⒏H細(xì)菌群落多樣性和豐富度，但不同促生菌間效果差異很大，既有多樣性和豐富度改變較小的促生菌，也有顯著降低的促生菌，因促生菌種類不同而異。

2.5 促生細(xì)菌對(duì)人參根際細(xì)菌群落功能的影響

促生細(xì)菌處理和清水對(duì)照處理的根際細(xì)菌在一級(jí)功能層均獲得6個(gè)方面的生物代謝功能，包括有機(jī)系統(tǒng)（Organismal Systems）、新陳代謝（Metabolism）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、細(xì)胞過(guò)程（Cellular Processes）和人類疾?。℉uman Diseases），其中有機(jī)系統(tǒng)、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理是占比最多的功能（gt;90%），各處理之間在一級(jí)功能層預(yù)測(cè)的基因數(shù)無(wú)顯著差異。

促生細(xì)菌處理和清水處理對(duì)照的根際細(xì)菌獲得的二級(jí)功能層，包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)（Membrane Transport）、氨基酸代謝（Amino Acid Metabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydrate Metabolism）、復(fù)制和修復(fù)（Replication and Repair）等35種預(yù)測(cè)功能，其中G119促生菌處理與清水對(duì)照處理相比預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)增加的功能體現(xiàn)在信號(hào)分子和互作（Signaling Molecules and Interaction）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal Transduction）、細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)（Cellular Processes and Signaling）、細(xì)胞活動(dòng)（Cell Motility）、循環(huán)系統(tǒng)（Circulatory System）、感染疾?。↖nfectious Diseases）、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡（Cell Growth and Death）等方面；而G119促生菌處理與清水對(duì)照處理相比預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)減少的功能體現(xiàn)在包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝等方面。

促生菌處理和清水對(duì)照處理的根際細(xì)菌獲得的三級(jí)功能層，包括轉(zhuǎn)運(yùn)體（Transporters）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABC transporters）、DNA修復(fù)和重組蛋白（DNA repair and recombination proteins）、雙組分系統(tǒng)（Two component system）、細(xì)菌移動(dòng)蛋白（Bacterial Motility Proteins）等33種預(yù)測(cè)功能（圖11），其中G119促生菌處理與清水對(duì)照處理相比預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)增加的功能體現(xiàn)在分泌系統(tǒng)（Secretion System）、雙組分系統(tǒng)、染色體（Chromosome）、伴侶和折疊催化劑、細(xì)菌移動(dòng)蛋白和其他未知功能等方面，而G119促生菌處理與清水對(duì)照處理相比預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)減少的功能體現(xiàn)在包括丙酮酸鹽代謝、膜代謝、糖酵解和糖異生等方面。

由以上結(jié)果可知，通過(guò)外源促生細(xì)菌處理可改變?nèi)藚⒏H細(xì)菌多方面的功能，改變功能的效果是雙向，既有增加的效果，也有降低的效果。

3 討論

3.1 不同促生菌對(duì)人參幼苗生物量、根際土壤理化指標(biāo)和酶活的變化

在本研究中，3種促生細(xì)菌對(duì)人參生長(zhǎng)的影響程度隨接種分離株的不同有差異。生物量結(jié)果根鮮重方面來(lái)看，G209和G119菌株的生長(zhǎng)均明顯優(yōu)于對(duì)照。何艷慧^［17］所用的促生菌株Rs-198可以顯著提高辣椒根部的生物量。本研究與前人的結(jié)果一致，芽孢桿菌屬和蒼白桿菌屬分離株與未接種對(duì)照相比，產(chǎn)量有所提高^［18］。同時(shí)何艷慧^［17］的結(jié)果表明，3種促生細(xì)菌復(fù)配施用在不發(fā)生病害的情況下可以獲得最高生物量和產(chǎn)量。G204分離株具有所評(píng)價(jià)的所有促生特性，但效果不是最好的，表示植物促生長(zhǎng)機(jī)制可能沒有疊加，也可能存在替代，類似的結(jié)果已經(jīng)得到證實(shí)^［19］。植物根系活力會(huì)影響根系分泌物或根際微生物對(duì)土壤酶活性的影響^［20］，表明這是植物與土壤相互作用的重要指標(biāo)。

3.2 不同促生菌對(duì)人參根際土壤微生物群落組成的變化

雖然微生物肥料已投放市場(chǎng)，并對(duì)其中使用的菌種進(jìn)行了研究，但對(duì)向當(dāng)?shù)赝寥牢⑸锶郝渲刑砑哟罅客鈦?lái)微生物的影響研究不足。有必要評(píng)估微生物群落轉(zhuǎn)移的重要性，以及它們?nèi)绾斡绊懲寥篮妥魑?，便于精?zhǔn)添加，從而改變土壤在養(yǎng)分循環(huán)中的性能和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力^［21］。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化直接影響著土壤的質(zhì)量和健康，多樣性指數(shù)越高、土壤微生態(tài)系統(tǒng)越復(fù)雜，其功能越穩(wěn)定^［22］。Krobe等^［23］通過(guò)T-RFLP技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌FZB42噴施于生菜根際和葉片時(shí)，并未對(duì)生菜根際的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。與此相反，本研究通過(guò)外源促生菌處理可以改變?nèi)藚⒏H細(xì)菌群落門水平和屬水平的組成和豐度以及細(xì)菌群落多樣性和豐富度，但不同促生菌間效果差異很大。李旖曦等^［24］通過(guò)接種外源植物促生細(xì)菌（Plant Growth-Promoting Bacteria，PGPB）顯著改變蜈蚣草根際微生物群落的相對(duì)豐度、均勻度和結(jié)構(gòu)組成，其中變形菌門、放線菌門對(duì)外源PGPB的響應(yīng)較顯著。本研究與前人的結(jié)果一致，不同處理促生菌處理對(duì)人參根際細(xì)菌門水平、屬水平影響均較大，變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是所有處理的優(yōu)勢(shì)菌門，各處理根際細(xì)菌門水平相對(duì)豐度差異較大；根瘤菌屬是促生菌處理后與對(duì)照差異顯著且豐度大于1%的共有菌屬，所有豐度大于1%的菌屬在促生菌處理后其增加的相對(duì)豐度比例均在120%以上，促生菌處理后根際土壤中根瘤菌相對(duì)豐度增加，與既往報(bào)道結(jié)果一致^［25-26］，這可能成為其作為PGPB應(yīng)用的間接有利因素。G119和G209處理后的人參根際細(xì)菌群落多樣性和豐富度基本沒有變化，而G115處理后人參根際細(xì)菌群落多樣性和豐富度反而降低。由此可見，促生菌不僅具有促進(jìn)人參生長(zhǎng)的直接功能，而且還可間接對(duì)根際細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生影響。因此，在驗(yàn)證促生菌促生功能以外有必要進(jìn)行根際微生態(tài)變化的考量。

本研究篩選出的3個(gè)菌種有望在人參生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，在人參生長(zhǎng)的關(guān)鍵階段引入這3個(gè)菌種，減少化肥農(nóng)藥的使用，能夠保障人參的品質(zhì)與安全?？紤]將這3種菌進(jìn)行組合應(yīng)用，以發(fā)揮其協(xié)同作用，進(jìn)一步提高防治效果。對(duì)此，課題組將繼續(xù)研究?jī)?yōu)異促生菌制備復(fù)合應(yīng)用型菌肥，將其進(jìn)行不同配比和時(shí)間施用后對(duì)人參的響應(yīng)狀況做進(jìn)一步分析評(píng)價(jià)。對(duì)于實(shí)際應(yīng)用中的復(fù)雜環(huán)境還需進(jìn)一步驗(yàn)證和優(yōu)化，開展更多的田間試驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用研究，以驗(yàn)證菌種在實(shí)際生產(chǎn)中的效果和可行性。針對(duì)不同的人參種植區(qū)域和土壤條件，制定相應(yīng)的菌種應(yīng)用方案。由于不同的地理環(huán)境和土壤條件可能對(duì)菌種的生長(zhǎng)和活性產(chǎn)生影響，因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)當(dāng)?shù)氐木唧w情況，選擇合適的菌種類型和配比，以達(dá)到最佳的生產(chǎn)效果。結(jié)合人參的生長(zhǎng)習(xí)性和栽培環(huán)境，調(diào)整菌種的配比和使用方式，以實(shí)現(xiàn)最佳防治效果，為人參促生新型復(fù)合菌肥的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

綜上所述，采用接種人參根際促生細(xì)菌G115、G119和G209的農(nóng)田栽參試驗(yàn)，明確3種菌的促生效應(yīng)以及不同時(shí)間施加對(duì)土壤中微生物的影響。研究表明，3種外源促生細(xì)菌處理顯著改善土壤有效磷、速效鉀含量，以及土壤酶活性，提高了人參的根鮮重；外源促生細(xì)菌處理可改變根際優(yōu)勢(shì)菌門的組成和比例，不同促生菌對(duì)根際細(xì)菌門水平和屬水平的群落組成和豐度的影響存在顯著的遺傳差異，其中根瘤菌屬是3種促生細(xì)菌處理后與對(duì)照差異最顯著且豐度大于1%的共有菌屬。同時(shí)，外源促生細(xì)菌處理可改變?nèi)藚⒏H細(xì)菌群落的遺傳多樣性，顯著增加根系分泌物、細(xì)菌感受信號(hào)等功能。

參考文獻(xiàn)：

［1］ SHIN K， GUO H Y， CHA Y， et al. Cereboost^TM， an American ginseng extract， improves cognitive function via up-regulation of choline acetyltransferase expression and neuroprotection［J］. Regulatory Toxicology and Pharmacology， 2016， 78： 53-58.

［2］ KLOEPPER J W， SCHROTH M N， VéGéTALE ET P B. Plant growth-promoting rhizobacteria on radishes［C］. Proceedings of the 4^th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria，Tours，F(xiàn)rance，1978：879-882.

［3］ 賀文婧， 陸旭桐， 蔣毅寧， 等. 植物根際促生菌研究文獻(xiàn)計(jì)量分析［J］. 土壤通報(bào)， 2023， 54（4）： 978-988.

［4］ LIU L， LI Y H， LI S L， et al. Comparison of next-generation sequencing systems［J］. Journal of Biomedicine amp; Biotechnology， 2012， 2012： 251364.

［5］ MOROZOVA O， MARRA M A. Applications of next-generation sequencing technologies infunctional genomics［J］. Genomics， 2008， 92（5）： 255-264.

［6］ 何宛晟， 盧廣林， 趙權(quán)， 等. 不同改良劑對(duì)人參土壤及其生長(zhǎng)發(fā)育的影響［J］. 分子植物育種， 2018， 16（20）： 6826-6831.

［7］ 董林林， 徐江， ?，|浩， 等. 改良措施對(duì)農(nóng)田土壤微生態(tài)及人參存苗率的影響［J］. 中國(guó)中藥雜志， 2016， 41（23）： 4334-4339.

［8］ 姬文秀， 李虎林， 冷雪， 等. 產(chǎn)ACC脫氨酶人參內(nèi)生細(xì)菌的分離和促生特性分析［J］. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019， 41（2）： 168-174.

［9］ 祁瑜，黃永梅，王艷，等.施氮對(duì)幾種草地植物生物量及其分配的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，31（18）：5121-5129.

［10］ TU X J， HU Z B， ZHAO T， et al. High-throughput determination of the organic matter content in soil and municipal sludge by headspace gas chromatography［J］. Analytical Methods， 2019， 11（47）： 5963-5968.

［11］ 毛雪梅.土壤中有效氮、磷、鉀測(cè)定方法相關(guān)性研究［J］.世界有色金屬，2020（4）：160-161.

［12］ PIOTROWSKA A， WILCZEWSKI E. Effects of catch crops cultivated for green manure and mineral nitrogen fertilization on soil enzyme activities and chemical properties［J］. Geoderma， 2012， 189： 72-80.

［13］ HAN L L， SU D R， LV S H， et al. Responses of biogeochemical characteristics and enzyme activities in sediment to climate warming under a simulation experiment in geographically isolated wetlands of the Hulunbuir Grassland， China［J］. International Journal of Environmental Research and Public Health， 2017， 14（9）： 968.

［14］ EDGAR R C. UPARSE： highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads［J］. Nature Methods， 2013， 10（10）： 996-998.

［15］ XU J， YANG Q. Isolation and characterization of rice straw degrading Streptomyces griseorubens C-5［J］. Biodegradation， 2010， 21（1）： 107-116.

［16］ PRICE M N， DEHAL P S， ARKIN A P. FastTree： computing large minimum evolution trees with profiles instead of a distance matrix［J］. Molecular Biology and Evolution， 2009， 26（7）： 1641-1650.

［17］ 何艷慧. 解鹽促生菌Pseudomonas sp. rs-198全基因組學(xué)分析及其與植物根際互作機(jī)制研究［D］. 石河子： 石河子大學(xué)， 2020.

［18］ HAHM M S， SUMAYO M， HWANG Y J， et al. Biological control and plant growth promoting capacity of rhizobacteria on pepper under greenhouse and field conditions［J］. Journal of Microbiology， 2012， 50（3）： 380-385.

［19］ ISLAM S， AKANDA A M， PROVA A， et al. Isolation and identification of plant growth promoting rhizobacteria from cucumber rhizosphere and their effect on plant growth promotion and disease suppression［J］. Frontiers in Microbiology， 2016， 6： 1360.

［20］ KONG L， WANG Y B， ZHAO L N， et al. Enzyme and root activities in surface-flow constructed wetlands［J］. Chemosphere， 2009， 76（5）： 601-608.

［21］ PEREIRA E SILVA M C， SEMENOV A V， SCHMITT H， et al. Microbe-mediated processes as indicators to establish the normal operating range of soil functioning［J］. Soil Biology and Biochemistry， 2013， 57： 995-1002.

［22］ RUTGERS M， VAV I， WIND B，" et al. Rapid method for assessing pollution-induced community tolerance in contaminated soil ［J］. Environ Toxicol Chemistry， 1998， 17： 2210-2213.

［23］ KRBER M，WIBBERG D，GROSCH R， et al. Effect of the strain bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing ［J］. Frontiers in Microbiology，2014，5：252.

［24］ 李旖曦， 陳涵冰， 王耀強(qiáng)， 等. 耐砷促生菌對(duì)超富集植物蜈蚣草砷吸收及根際微生物群落的調(diào)控作用［J］. 微生物學(xué)報(bào)， 2023， 63（6）： 2401-2414.

［25］ PRAKAMHANG J， TITTABUTR P， BOONKERD N， et al. Proposed some interactions at molecular level of PGPR coinoculated with Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110 and B. japonicum THA6 on soybean symbiosis and its potential of field application［J］. Applied Soil Ecology， 2015， 85： 38-49.

［26］ YADAV J. Enhancement of nodulation and yield of chickpea by coinoculation of lndigenous" Mesorhizobium spp. and plant growth-promoting rhizobacteria in Eastern Uttar Pradesh ［J］. Communications in Soil Science and Plant Analysis，2012， 43：605-621.

Effects of Three Types of Growth-Promoting Bacteria on Growth and Rhizosphere Bacterial Population of Ginseng

WANG Qiuyu， WANG Yue， NIU Fuao， HAN Dan， NAN Li

（College of Agriculture，Yanbian University， Yanji 133002， China）

Abstract：In order to promote soil improvement of ginseng fields and development of functional microbial fertilizer， three kinds of plant growth-promoting bacteria （Erwinia G115， Ochrobactrum G119 and Lysinibacillus G209） were used to treat the soil of ginseng fields. The composition structure of ginseng rhizosphere bacterial population， soil physical and chemical properties and the growth status of ginseng seedlings were measured to study the growth-promoting effect of rhizosphere growth-promoting bacteria on ginseng and its effect on rhizosphere microbial community and function. The results indicated that compared to the control group， the treatments with growth-promoting bacteria on ginseng seedlings showed insignificant changes in rhizosphere soil organic matter， total nitrogen， pH， and leaf dry weight， whereas there were significant differences observed in available phosphorus， available potassium， invertase， rhizosphere soil urease， and root fresh weight. Compared with the control group， the treatments with the three growth-promoting bacteria revealed that the relative abundance of eight bacterial phyla in the ginseng rhizosphere， including Proteobacteria and Actinobacteria， exceeded 1% at the phylum level. Among these， Proteobacteria was the dominant phylum.The three growth-promoting bacteria treatments had a significant impact on the genus level of bacteria in the ginseng rhizosphere. Specifically， Rhizobium was a common genus that showed significant differences and an abundance greater than 1% after treatment with growth-promoting bacteria compared to the control. For all genera with an abundance greater than 1%， the relative abundance proportion increased by more than 120% after treatment with the growth-promoting bacteria.By using PICRUSt software， the functional profiles of bacterial communities in the ginseng rhizosphere after treatment with the three growth-promoting bacteria were predicted， yielding six categories of biological metabolic functions at the Level 1 functional layer， 35 predicted functions at the Level 2 functional layer， and 33 predicted functions at the Level 3 functional layer. Compared to the control group， exogenous application of growth-promoting bacteria could alter various functions of bacteria in the ginseng rhizosphere， and the effects of these changes were bidirectional， resulting in both increases and decreases in functionalities.The treatment of exogenous PGPB changed the genetic diversity of the bacterial community in ginseng， and significantly increased the functions of root exudates and bacterial sensing signals.

Keywords：panax ginseng; growth-promoting bacteria; rhizosphere bacteria; population structure; function prediction