新煙堿類殺蟲劑哌蟲啶在3種典型土壤中的生物有效性

摘要：為探究新煙堿類殺蟲劑哌蟲啶在3種典型土壤中的降解及其生物有效性，本研究在室內(nèi)模擬土壤生境，以赤子愛勝蚯蚓和哌蟲啶分別作為受試模式生物和目標污染物，采用蚯蚓生物富集量和間接生物測量法，研究哌蟲啶在不同類型土壤中的生物有效性。研究結(jié)果表明：哌蟲啶在棕壤、紅壤和黑土中的降解半衰期分別為11.45-12.62、12.42-14.38 d和5.19-10.21 d，在3種典型土壤中的降解速度為黑土gt;棕壤gt;紅壤。哌蟲啶在蚯蚓體內(nèi)的生物累積量隨其在土壤中含量的增加而增大，在10 mg·kg-1哌蟲啶處理下，棕壤、紅壤和黑土中蚯蚓體內(nèi)哌蟲啶的含量分別為190、210 ng·g-1和160 ng·g-1，生物富集法研究表明，哌蟲啶在黑土中的生物有效性較低，在紅壤和棕壤中的生物有效性相對較高。不同處理的蚯蚓受到哌蟲啶的氧化脅迫，其蛋白質(zhì)含量、抗氧化酶活性、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶活性和丙二醛含量具有顯著的差異性（Plt;0.05），各指標在黑土中受到的影響較小，在棕壤和紅壤中受到的影響較大，哌蟲啶在有機質(zhì)含量豐富的黑土中生物有效性較弱，而在棕壤和紅壤中生物有效性較強。

關(guān)鍵詞：哌蟲啶；蚯蚓；生物有效性；降解

中圖分類號：X53；X592 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）02-0254-08 doi：10.11654/jaes.2023-0297

土壤中有機污染風(fēng)險評估一般將有機污染物在土壤中的總含量作為評價指標，但這只反映了有機污染物在土壤中的富集程度，而無法準確預(yù)測出有機污染物的生物有效含量和生態(tài)風(fēng)險。生物有效性（Bioavailability）是指在生命體對化學(xué)物質(zhì)暴露程度的物理、化學(xué)和生物學(xué)的綜合作用下，化學(xué)物質(zhì)被生物吸收的程度和可能產(chǎn)生的毒性。利用生物有效性可以對土壤中污染物進行生態(tài)風(fēng)險評估，評價方法一般包括直接生物測量法、間接生物測量法（生物標志物或繁殖等）或直接化學(xué)測量法。污染物的直接生物測量法常通過生物累積量或臨界機體殘留濃度（Critical body residues，CBRs）進行評價，Verbruggen等的研究指出SPME方法能預(yù)測土壤中有機污染物在土壤生物（蚯蚓）體內(nèi)的富集量。間接生物測量法必須與一些生物反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，從生物的毒性測試中得出影響濃度，有機污染物在土壤中的風(fēng)險可以借助生物的反應(yīng)進行評價。

哌蟲啶（IPP）作為首個國內(nèi)自主研發(fā)的新型新煙堿類殺蟲劑，通過作用于昆蟲的乙酰膽堿受體破壞其神經(jīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致?lián)p傷和死亡，主要用于防治同翅目和鱗翅目害蟲。哌蟲啶環(huán)境相容性好，對鳥類和蜜蜂更安全。哌蟲啶作為傳統(tǒng)煙堿類農(nóng)藥的替代品被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)市場，其生物活性是吡蟲啉的40-50倍。如今新煙堿類殺蟲劑在市場中所占的比例越來越大，新煙堿類農(nóng)藥會在土壤、沉積物和地表水中持續(xù)存在，因此具有潛在的環(huán)境風(fēng)險?，F(xiàn)有研究主要集中于哌蟲啶的毒性和環(huán)境行為。Fu等報道了哌蟲啶在不同土壤中處于好氧條件下的礦化、結(jié)合殘留及可提取態(tài)的吸收分布和轉(zhuǎn)化規(guī)律，以及哌蟲啶的代謝降解規(guī)律，明確了哌蟲啶在好氧土壤中可能的代謝產(chǎn)物及降解途徑。周龍?zhí)锩鞔_了哌蟲啶對水稻和環(huán)境的安全濃度與安全間隔期。然而，哌蟲啶在土壤中的生物有效性還未見研究報道。

蚯蚓是標準的土壤毒性測試生物，因具有體積小、分布廣、與土壤緊密接觸和對污染物敏感的特點，而在土壤的生態(tài)系統(tǒng)中具有極其重要的作用，非常適合用于評估土壤中許多化學(xué)物質(zhì)的生物有效性，其中赤子愛勝蚯蚓是毒性評價中最常用的蚯蚓品種。蚯蚓在污染物的脅迫下，體內(nèi)的抗氧化酶體系會消除多余的活性氧（ROS）來抵抗氧化損傷；Zhang等報道指出，蚯蚓暴露于哌蟲啶后，體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）活性和丙二醛（MDA）含量均顯著升高。蚯蚓的這些指標均為污染物介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的有用分子生物指標，通過其變化可評價新煙堿類殺蟲劑哌蟲啶在土壤中的生物有效性。

土壤的物理／化學(xué)特性可以顯著改變蚯蚓對哌蟲啶的生物有效性，本研究選取3種典型土壤類型為環(huán)境介質(zhì)，以赤子愛勝蚯蚓為模式生物，采用直接生物測量法（生物富集量）和間接生物測量法（蚯蚓的抗氧化酶活性），利用蚯蚓對哌蟲啶生物富集量和蚯蚓抗氧化酶活性的變化評價哌蟲啶在不同類型土壤中的生物有效性，以期闡明在不同性質(zhì)土壤中哌蟲啶對土壤生物的環(huán)境風(fēng)險，研究結(jié)果對評價土壤中哌蟲啶殘留對土壤生物的生態(tài)風(fēng)險，以及對合理使用農(nóng)藥，確保生態(tài)環(huán)境安全具有科學(xué)意義。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：島津UV2600紫外分光光度計，安捷倫Agilent 1100液相色譜儀（配紫外檢測器），RE252旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，KQ3200超聲波清洗器，振蕩器，SPE-C18固相萃取小柱，布氏漏斗，圓底燒瓶，真空抽濾機，抽濾瓶。

試劑：乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），無水硫酸鈉（130℃烘干6h），哌蟲啶（原藥，江蘇克勝集團提供，純度為93.00％）。

1.2受試生物

赤子愛勝蚓購于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)泮河校區(qū)資環(huán)實驗站，挑選體質(zhì)量為300-600 mg對污染物具有中等敏感性的健康成蚓。試驗前將蚯蚓放于人工土壤中馴養(yǎng)一段時間，試驗時選取環(huán)帶明顯且大小較一致的健康成蚓。

1.3供試土壤

供試棕壤采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)泮河校區(qū)試驗田，根據(jù)中國土壤系統(tǒng)分類命名為普通簡育濕潤淋溶土（Typic-Hapli-Udic Argosols）。紅壤采于江西省南昌市進賢縣張公鎮(zhèn)（28.3°N，116.2°E），根據(jù)中國土壤系統(tǒng)分類命名為黏化富鋁濕潤富鐵土（Argi-Allit-Udic Ferrosols）。黑土取自黑龍江省齊齊哈爾市（50.38°N，120.25°E），根據(jù)中國土壤系統(tǒng)分類命名為黏化濕潤均腐土（Argi-Udic Isohumosols）。采樣深度為2-20cm，采用四分法取適量土壤于塑料布上自然風(fēng)干，風(fēng)干后過40目篩裝袋備用。供試土壤理化性質(zhì)見參考文獻。

1.4土壤染毒

稱取過篩的3種土壤進行染毒，根據(jù)該農(nóng)藥正常施用量（37.5-52.2 g·hm-2）分別添加同體積不同濃度的哌蟲啶母液，使土壤中哌蟲啶含量分別為1、5、10 mg·kg-1，空白對照組（CK）土壤加入同等體積的乙腈，在通風(fēng)條件下放置染毒土壤2h，以除去有機溶劑乙腈，每個處理設(shè)置5個平行。將上述土壤充分混勻后，在每個花盆中放入1 kg染毒土壤和15條蚯蚓，每周在土壤表面放置牛糞，每條蚯蚓提供0.5 g。用帶扎孔的保鮮膜封口，橡皮筋扎住。培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為20℃，定期補充培養(yǎng)箱水分以保持土壤濕度，12 h光照、12 h黑暗下交替培養(yǎng)。根據(jù)研究報道的哌蟲啶在土壤中的降解特性，于染毒后第0、3、5、10、15、20天取土壤樣品測定哌蟲啶殘留量，并于第15天測定蚯蚓的抗氧化酶活性和MDA含量及蚯蚓體內(nèi)哌蟲啶的殘留量。

1.5樣品中哌蟲啶殘留檢測

準確稱取染毒后的樣品（土壤20.00 g或蚯蚓5.00 g）放于250 mL碘量瓶中，向其中加入2 mL蒸餾水和100 mL乙腈，機械振蕩1 h。樣品提取液經(jīng)布氏漏斗抽濾后，經(jīng)裝有無水硫酸鈉的筒形漏斗過濾到250 mL平底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至3 mL左右，再利用SampliQ C18固相萃取小柱進行凈化：首先用5 mL甲醇預(yù)淋小柱，然后用5 mL蒸餾水預(yù)淋至干，將處理后的樣品轉(zhuǎn)移至柱中，使其以每秒兩滴左右的速度自然滴下，用30 mL色譜純乙腈（每次加入5 mL）洗脫樣品，小柱的流速不超過1 mL·min-1，將收集的洗脫液用氮吹儀吹干，乙腈定容到10 mL刻度試管中，再經(jīng)0.22 um有機相濾膜過濾后，采用高效液相色譜檢測。

哌蟲啶殘留的測定條件：參照哌蟲啶殘留量測定方法，使用Agilent 1100高效液相色譜儀（紫外檢測器），色譜柱選用C18（5 um，25 cmx4.6 mm），流動相為乙腈：水=40： 60（VIV），流速1 mL·min-1，進樣量10uL，檢測波長359 nm，柱溫30℃，外標法定量，線性范圍在0.5x10-9-2.5x10-7g。哌蟲啶在土壤中的添加回收率為81.73％-89.05％，變異系數(shù)為3.59％-5.25％，哌蟲啶在蚯蚓中的添加回收率為78.29％-85.63％，變異系數(shù)為5.38％-9.38％，最小檢測量為2.5x10-3 mg·kg-1。

1.6哌蟲啶在土壤中的生物有效性

采用直接和間接生物測定法檢測哌蟲啶在土壤中的生物有效性，通過測定不同類型土壤中哌蟲啶的殘留量，20 d時蚯蚓對哌蟲啶的生物積累量，15 d時蚯蚓體內(nèi)SOD、CAT、POD和GST活性及MDA含量等指標評價哌蟲啶在不同類型土壤中的生物有效性。參考Gu等的提取方法提取蚯蚓體內(nèi)酶液，酶液蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法，通過標準曲線計算得出蛋白質(zhì)含量。分別使用動物的CAT測定試劑盒（A007-1-1）、POD測定試劑盒（A084-3-1）和SOD測定試劑盒（A001-3-1），測定蚯蚓體內(nèi)CAT、POD和SOD的活性。用動物MDA測定試劑盒（TBA）檢測蚯蚓MDA含量。所有檢測試劑盒均來自建成生物工程研究所（南京）。由于蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量很高，本試驗將酶液稀釋5倍后再測定。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行方差分析，采用單因素方差分析（ANOVA），通過Plt;0.05的最小顯著性差異，評價各處理總體均值的差異；采用Sigmaplot 12.5和Excel 2016制圖，并利用一級降解動力學(xué)模型計算降解半衰期。

2結(jié)果與分析

2.1哌蟲啶在3種典型土壤中的降解動態(tài)

哌蟲啶在3種典型土壤中的降解動態(tài)見圖1。在初始含量為10 mg kg-1的處理下，3d后哌蟲啶在紅壤、棕壤和黑土中的降解率分別為21.7％、27.9％和31.7％，培養(yǎng)10 d后，在3種土壤中的降解率依次為40.9％、47.5％和53.7％，其他兩個含量表現(xiàn)出相似的模式。哌蟲啶在土壤中的降解動態(tài)遵循一級降解動力學(xué)特征，降解數(shù)學(xué)模型的各項參數(shù)如表1所示。不同含量的哌蟲啶在紅壤、棕壤和黑土中的降解半衰期（T1/2）分別為12.42-14.38、11.45-12.62 d和5.19-10.21 d，哌蟲啶在不同類型土壤中的降解速率具有一定差異性，在黑土中降解最快，在紅壤中降解較慢，這可能與土壤pH和有機質(zhì)含量具有一定的相關(guān)性。土壤pH影響微生物的活性，紅壤pH為5.40，棕壤和黑土分別為6.71和7.28，哌蟲啶在酸性土壤中降解較慢；黑土土壤有機質(zhì)含量最高（56.54 g·kg-1），紅壤中有機質(zhì)含量最低（6.45 g·kg-1），有機質(zhì)含量顯著影響哌蟲啶在土壤中的降解。

2.2蚯蚓對哌蟲啶的生物富集量

在試驗第15天，從各處理土壤中取出10條蚯蚓，提取和檢測蚯蚓體內(nèi)哌蟲啶的殘留量，結(jié)果見表2。由表2可知，隨著土壤染毒程度的增大，蚯蚓體內(nèi)的哌蟲啶富集量越來越大。在哌蟲啶含量為5 mg·kg-1的棕壤，紅壤和黑土中，蚯蚓體內(nèi)哌蟲啶的生物富集量分別為100、170 ng·g-1和90 ng·g-1，其生物富集系數(shù)（蚯蚓體內(nèi)含量／土壤中含量）分別為0.020、0.034和0.018；在10 mg·kg-1的土壤處理中，蚯蚓體內(nèi)生物富集量分別為190、210 ng·g-1和160 ng·g-1，對哌蟲啶的生物富集系數(shù)分別為0.019、0.021和0.016，說明哌蟲啶在蚯蚓體內(nèi)不具有明顯的生物蓄積效應(yīng)，哌蟲啶在水中的溶解度為0.6 g·L-1（25℃），其理化特性也決定了其具有較低的生物富集系數(shù)。生物富集法研究表明，哌蟲啶在3種典型土壤中的生物有效性較弱，其中在黑土中的生物有效性最低。

2.3哌蟲啶對蚯蚓蛋白質(zhì)含量和抗氧化酶活性的影響

蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化如圖2a所示。在棕壤中，1 mg·kg-1和5 mg·kg-1處理的蚯蚓蛋白質(zhì)含量分別比CK顯著降低了18.61％和12.13％，而10 mg·kg-1處理的蛋白質(zhì)含量比CK顯著增加了18.79％，說明哌蟲啶在棕壤中的生物有效性較強，對土壤生物影響較大。在黑土中，1 mg·kg-1處理的蚯蚓蛋白質(zhì)含量比CK減少了9.16％，而5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理的蚯蚓蛋白質(zhì)含量比CK增加了7.81％和2.65％，與CK無顯著性差異，說明哌蟲啶在黑土中的生物有效性較弱。在紅壤中，5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理的蚯蚓蛋白質(zhì)含量顯著降低，分別比CK降低了31.11％和13.64％，由于蚯蚓的回避作用，10 mg·kg-1處理的哌蟲啶的生物有效性降低。

蚯蚓的SOD活性如圖2b所示。在棕壤中，3個不同處理的SOD活性均顯著升高，1 mg·kg-1和5 mg'kg-1處理分別比CK提高了69.36％和97.21％，在紅壤中，5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理分別比CK提高了87.13％和22.81％，說明哌蟲啶在棕壤和紅壤中的生物有效性較強。在黑土中，1 mg·kg-1處理具有輕微抑制SOD活性的作用，而5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理使蚯蚓SOD活性分別提高了24.10％和29.60％，說明哌蟲啶在黑土中的生物有效性較弱。

蚯蚓的CAT活性如圖2c所示。在棕壤中，5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理的CAT活性分別比CK提高了13.69％和26.36％，1 mg·kg-1處理與CK無顯著差異，在黑土中，1、5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理的CAT活性分別比CK提高了10.37％，14.30％和19.94％，5 mg·kg與1 mg·kg-1和10 mg·kg-1均無顯著差異，說明哌蟲啶在棕壤和黑土中的生物有效性較弱。在紅壤中，1、5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理的CAT活性分別比CK顯著提高了25.47％、72.27％和74.61％，1 mg·kg-1和5mg·kg-1處理間具有顯著差異，說明哌蟲啶在紅壤中的生物有效性較強。

蚯蚓的POD活性如圖2d所示。在3種土壤中，1mg·kg-1處理的蚯蚓POD活性均與CK無顯著差異，5mg·kg-1和10 mg·kg-1處理下，棕壤中的蚯蚓POD活性分別比CK提高了5.13％和76.82％，黑土中的蚯蚓POD活性分別比CK提高了19.29％和120.00％，紅壤中的蚯蚓POD活性分別比CK提高了42.30％和30.11％，說明高濃度處理的哌蟲啶生物有效性較強。

2.4哌蟲啶對GST活性的影響

蚯蚓體內(nèi)解毒酶GST活性的變化趨勢如圖3所示。GST是生物體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，是細胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)，當生物體受到外源污染物刺激，體內(nèi)ROS平衡被打破，生物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)不能完全清理過氧化物等一些有害物質(zhì)時，體內(nèi)GST活性會增加。由圖3可知，在黑土中，1 mg·kg-1處理和CK無顯著差異，而5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理對GST活性的抑制率分別為12.10％和17.95％，說明哌蟲啶在黑土中的生物有效性較弱。在棕壤中，由于受到哌蟲啶的污染脅迫，5 mg·kg-1處理的GST活性比CK顯著提高了60.73％，但10 mg·kg-l處理的GST活性比CK顯著降低了15.27％，在紅壤中，5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理對GST活性的激活率分別為45.86％和40.57％，說明哌蟲啶在棕壤和紅壤中的生物有效性較強。

2.5哌蟲啶對蚯蚓體內(nèi)MDA含量的影響

哌蟲啶對蚯蚓體內(nèi)MDA含量的影響見圖4。在棕壤中，隨著哌蟲啶含量的增大，蚯蚓體內(nèi)MDA含量增多，1、5、10 mg·kg-1處理的MDA含量分別比CK增加了1.26、2.03、2.09倍，說明蚯蚓在哌蟲啶污染的土壤環(huán)境中脂質(zhì)過氧化程度增強，產(chǎn)生了較多的MDA，表明哌蟲啶在棕壤中對蚯蚓的生物有效性較強。在黑土中，1mg·kg-1處理影響較小，與CK無顯著差異，而5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理的MDA含量分別比CK增加了0.79倍和1.81倍。在紅壤中，隨著哌蟲啶含量的增大，蚯蚓體內(nèi)MDA含量逐漸增加，說明哌蟲啶的生物有效性隨其含量的增大而增強，但10 mg·kg-I處理的MDA含量小于5 mg·kg-1處理，1 mg·kg-1和10 mg·kg-1兩個處理無顯著差異，可能的原因為蚯蚓在高含量哌蟲啶處理的紅壤中具有回避效應(yīng)，試驗結(jié)束時蚯蚓集中分布在小盆的上部和邊緣，造成高含量的哌蟲啶在紅壤中對蚯蚓的生物有效性降低。棕壤和紅壤中的哌蟲啶對蚯蚓的生物有效性較強，黑土中的生物有效性最弱，可能是土壤有機質(zhì)對哌蟲啶的影響較大。

3討論

3.1新煙堿類農(nóng)藥在土壤中的降解

農(nóng)藥進入到土壤環(huán)境中后會轉(zhuǎn)化為可提取殘留物（ER）和結(jié)合殘留物（BR）或被礦化。Fu等研究發(fā)現(xiàn)，在中性和堿性土壤中，哌蟲啶的非對映異構(gòu)體在結(jié)合殘留形成或礦化過程中均具有顯著的差異性，而對映體之間無顯著差異，總礦化度小于應(yīng)用總量的8％。手性農(nóng)藥在環(huán)境中的歸宿會受到許多因素的影響，如土壤性質(zhì)（pH、有機質(zhì)和CEC等）。

本研究中哌蟲啶在3種土壤中的降解動態(tài)符合一級降解動力學(xué)特征，與文獻報道一致。土壤的成分結(jié)構(gòu)對新煙堿類農(nóng)藥的降解影響較大，同時也影響其遷移性和生物有效性，新煙堿類農(nóng)藥在土壤中的降解影響其在環(huán)境中的歸趨，不同的土壤環(huán)境顯著影響其降解速率。Anderson等的研究表明，新煙堿類農(nóng)藥在土壤中的降解與其總有機碳含量相關(guān)，而土壤有機碳含量與有機質(zhì)顯著正相關(guān)。在本研究中，哌蟲啶在黑土中的降解速度較快，這可能與其有機質(zhì)含量有關(guān)，土壤有機質(zhì)含量高，土壤微生物數(shù)量和活性均相應(yīng)較高，從而促進土壤中農(nóng)藥的降解；Bonmatin等研究發(fā)現(xiàn)新煙堿類殺蟲劑在土壤中的降解除了與土壤性質(zhì)及有機質(zhì)含量有關(guān)，還受pH、土壤微生物活性、溫度等的影響；Li等研究發(fā)現(xiàn)哌蟲啶淹水培養(yǎng)時與土壤的結(jié)合殘留量和土壤性質(zhì)有關(guān)（酸性gt;堿性gt;中性）；本研究發(fā)現(xiàn)哌蟲啶在紅壤、棕壤和黑土中的降解半衰期分別為12.42-14.38、11.45-12.62 d和5.19-10.21 d，紅壤和棕壤差異不顯著，但與黑土具有顯著性差異，黑土中降解半衰期明顯縮短，可能是由于土壤性質(zhì)的不同導(dǎo)致哌蟲啶在土壤中的降解速率存在差異，另外黑土的有機碳含量相對較高，土壤對哌蟲啶的吸附能力較強，哌蟲啶在黑土中檢出量的降低可能也是影響因素之一。

3.2農(nóng)藥的生物有效性評估

采用生物有效性評價土壤中的污染物污染水平，并以其為標準進行污染水平研究和風(fēng)險評價具有非常重要的研究意義。農(nóng)藥在環(huán)境中的生物有效性是準確評估農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險的重要參考指標，生物體與農(nóng)藥接觸，體內(nèi)抗氧化酶體系產(chǎn)生響應(yīng)，其作為氧化應(yīng)激的生物標志物能反映農(nóng)藥的生物有效性。

污染物在蚯蚓體內(nèi)的生物累積是由于化學(xué)物質(zhì)進入蚯蚓體內(nèi)，蚯蚓的吸收和排泄過程達到平衡，直接測定蚯蚓對污染物的生物累積量可評價污染物的生物有效性。Chevillot等對新煙堿類殺蟲劑在蚯蚓體內(nèi)的生物累積進行研究，結(jié)果表明新煙堿類殺蟲劑在成年和幼年蚯蚓中具有選擇性的生物累積效應(yīng)，當蚯蚓單獨暴露于新煙堿類殺蟲劑時，農(nóng)藥的生物累積效應(yīng)在成年和幼年蚯蚓中都存在，隨著蚯蚓的逐漸長大，農(nóng)藥對蚯蚓DNA損傷加重，從而對繁殖產(chǎn)生顯著影響。噻蟲脒在蚯蚓體內(nèi)的生物累積量最高為871ng·g-1（以干質(zhì)量計），揭示了新煙堿類農(nóng)藥可能會進入野生動物食物鏈，具有一定的潛在風(fēng)險。本研究利用直接生物測量的生物累積量探究哌蟲啶在不同土壤中的生物有效性，暴露于10 mg·kg-1哌蟲啶的蚯蚓，其在棕壤、紅壤和黑土中的哌蟲啶的生物累積量分別為190、210 ng·g-1和160 ng·g-1，與噻蟲脒相比，哌蟲啶的生物有效性較弱。

蚯蚓體內(nèi)存在著受有機污染物抑制或能響應(yīng)污染物誘導(dǎo)的酶類，當受到有機污染物脅迫時，蚯蚓自身會啟動防御系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的應(yīng)激蛋白來抵抗環(huán)境壓力或分解代謝蛋白質(zhì)滿足對能量的需求。Dani等的研究發(fā)現(xiàn)新煙堿類農(nóng)藥吡蟲啉暴露會導(dǎo)致糖異生作用上調(diào)，氨基酸濃度下降。本研究采用蚯蚓蛋白質(zhì)含量的變化評價哌蟲啶在土壤中的生物有效性，暴露于相同含量的哌蟲啶時，黑土中的蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化較小，說明其在黑土中的生物有效性較弱。

Zhang等的研究發(fā)現(xiàn)，1 mg·kg-1哌蟲啶處理可促進蚯蚓02，的形成，SOD酶活性升高，隨哌蟲啶含量升高，蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性逐漸降低；其他新煙堿類農(nóng)藥具有相同的作用機制，如蚯蚓暴露于4 mg·kg-1的吡蟲啉中時其體內(nèi)的SOD活性降低，蚯蚓暴露于噻蟲胺和噻蟲嗪中時其體內(nèi)的SOD活性隨著農(nóng)藥濃度的升高而降低。Zhang等的研究表明，0.66 mg·kg-1和2 mg·kg-1吡蟲啉處理具有誘導(dǎo)蚯蚓CAT活性的作用，5 mg·kg-1的處理對蚯蚓的CAT活性具有顯著的抑制作用。POD作為一種血紅素蛋白，其作用是消除生物體內(nèi)的過氧化氫，使其變?yōu)樗缡艿竭料x啉氧化應(yīng)激作用的影響，斑馬魚POD活性顯著變化。Wang等的研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉具有干擾蚯蚓體內(nèi)羧酸酯酶（CarE）和CST活性的作用，MDA是脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，對蚯蚓具有細胞毒性。通過對MDA含量的測定來反映脂質(zhì)過氧化水平，間接評價蚯蚓細胞受污染物損傷的程度。Zhang等的研究發(fā)現(xiàn)，隨著哌蟲啶含量的升高，蚯蚓體內(nèi)MDA含量逐漸升高；Chandran等的研究表明，氧化應(yīng)激可能是新煙堿類農(nóng)藥毒性的作用機制，吡蟲啉會導(dǎo)致三鰭搖蚊MDA含量升高，具有輕度誘導(dǎo)生物脂質(zhì)過氧化的作用。在3種不同土壤類型中，對暴露哌蟲啶15 d的蚯蚓進行研究，蚯蚓的抗氧化酶活性、GST活性和MDA含量在不同處理中具有顯著性差異，說明哌蟲啶在土壤中的生物有效性不但與暴露含量相關(guān)，也與土壤的理化性質(zhì)關(guān)系密切，在有機質(zhì)含量豐富的黑土中，哌蟲啶的生物有效性較弱，而在棕壤和紅壤中其生物有效性較強，這與采用直接生物測量研究的結(jié)果一致。

4結(jié)論

（1）哌蟲啶在3種不同類型土壤中的降解速率具有顯著的差異性，在紅壤、棕壤和黑土中的降解半衰期分別為12.42-14.38、11.45-12.62 d和5.19-10.21 d，在黑土中降解最快，在紅壤中降解較慢。

（2）哌蟲啶在蚯蚓體內(nèi)的生物累積量隨著其在土壤中含量的增加而增大。在棕壤、紅壤和黑土中，蚯蚓對哌蟲啶的生物富集系數(shù)分別0.019-0.025、0.021-0.036和0.016-0.020，在10 mg·kg-1處理中，棕壤、紅壤和黑土蚯蚓體內(nèi)的生物富集量分別為190、210 ng·g-1和160 ng·g-1，說明哌蟲啶在蚯蚓體內(nèi)不具有明顯的生物蓄積效應(yīng)，且在黑土中生物有效性較弱。

（3）在不同類型土壤中的蚯蚓受到哌蟲啶的氧化脅迫后，其抗氧化酶活性、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶活性和丙二醛含量具有顯著的差異性，各指標在黑土中受到的影響較小，在棕壤和紅壤中受到的影響較大，在有機質(zhì)含量豐富的黑土中，其生物有效性較弱，而在棕壤和紅壤中，生物有效性較強。