根尖分生組織細(xì)胞的有絲分裂實(shí)驗(yàn)改進(jìn)

摘 要：“觀察根尖分生組織細(xì)胞的有絲分裂”是細(xì)胞分裂的重要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。該實(shí)驗(yàn)的成功率低，教學(xué)效果差。通過對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，創(chuàng)新使用改良的苯酚品紅作為染色劑，觀察染色體效果較好；并在此基礎(chǔ)上，又采用10-10mol/ L生長素處理大蒜根尖細(xì)胞，能明顯提高有絲分裂細(xì)胞數(shù)，尤其是中后期細(xì)胞的數(shù)目，實(shí)驗(yàn)效果好。

關(guān)鍵詞：根尖細(xì)胞；有絲分裂；生長素；改良的苯酚品紅

中圖分類號(hào)：G434 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

“觀察根尖分生組織細(xì)胞的有絲分裂”為人教版高中《生物學(xué)（必修1）》第6章第1節(jié)“細(xì)胞的增殖”的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容[1]。本實(shí)驗(yàn)旨在讓學(xué)生制作臨時(shí)裝片技術(shù)，觀察辨別染色體特征，識(shí)別細(xì)胞分裂各時(shí)期，達(dá)到鞏固知識(shí)的目的，并為后面學(xué)習(xí)減數(shù)分裂做鋪墊。在實(shí)際教學(xué)中，開展該實(shí)驗(yàn)的成功率較低，教學(xué)效果差，一線教師對此進(jìn)行了大量的探討。李志超通過觀察比較，發(fā)現(xiàn)大蒜根尖有絲分裂效果顯著高于洋蔥，實(shí)驗(yàn)溫度和取材時(shí)根的長度組合對大蒜有絲分裂有顯著影響[2] ；李愛玲發(fā)現(xiàn)根尖分生區(qū)細(xì)胞在10 00至14 00細(xì)胞分裂旺盛，是最佳采根時(shí)間[3] ；李今發(fā)現(xiàn)大蒜在4 ℃有絲分裂程度較高，是最佳培養(yǎng)溫度[4] ；肖桂芝發(fā)現(xiàn)大蒜根尖生長長度在2cm至4cm時(shí)，有絲分裂比其他長度更旺盛[5] ；趙廣宇研究了廢電池水對細(xì)胞分裂的影響[6]。這些研究集中在實(shí)驗(yàn)材料、根尖長度和實(shí)驗(yàn)時(shí)間等方面，對于利用其他化學(xué)試劑促進(jìn)有絲分裂的報(bào)道不多見。

高中生物學(xué)教材提到生長素的作用，生長素能參與細(xì)胞內(nèi)一系列化學(xué)反應(yīng)，調(diào)節(jié)根的伸長生長和細(xì)胞分裂，低濃度的生長素促進(jìn)根的生長，高濃度的生長素抑制生長。生長素對根尖細(xì)胞分裂是否起作用，能否促進(jìn)根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂，尚未有相關(guān)報(bào)道。我們采用2019年版人教社教材給定的最適濃度10-10mol/ L生長素培養(yǎng)大蒜的根[7] ，以期利用生長素提高細(xì)胞有絲分裂實(shí)驗(yàn)效果，為提高本實(shí)驗(yàn)的開展效果提供借鑒。

一、實(shí)驗(yàn)材料

大蒜；體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%鹽酸溶液；濃度為0. 01g/ mL或0. 02g/ mL的甲紫溶液（舊稱龍膽紫，制備的方法是將甲紫溶解到醋酸溶液配制而成），質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0. 1%番紅染液（取0. 1g番紅溶解于100mL水配制而成）和改良的苯酚品紅染液（用堿性品紅染料依次加入酒精、苯酚、冰醋酸、甲醛、山梨醇混合而成）。

顯微鏡，載玻片，蓋玻片，培養(yǎng)皿，剪刀，鑷子，滴管。

二、方法

（一）大蒜根尖的培養(yǎng)

取大蒜一個(gè)，剝?nèi)ネ鈱痈稍锏镊[片葉后，把蒜瓣分別放在培養(yǎng)皿中加蒸餾水培養(yǎng)。蒜瓣根部浸在溶液中，先在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每天定時(shí)替換一次蒸餾水。待大蒜長出2cm長的不定根，將大蒜和培養(yǎng)皿放入冷藏室內(nèi)待用。

（二）有絲分裂臨時(shí)裝片的制作

剪取2mm至3mm，用卡諾氏液（體積比95%酒精∶冰醋酸= 3∶1）固定細(xì)胞形態(tài)2h后，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇沖洗。把沖洗后的根尖細(xì)胞放入盛有等體積鹽酸和酒精混合液的玻璃皿中，25 ℃下解離。待大蒜根尖軟化后，用鑷子取出，放入盛有清水的玻璃皿中漂洗。分別用0. 01g/ mL或0. 02g/ mL的甲紫溶液、0. 1%番紅染液和改良的苯酚品紅染液染色，壓片后用顯微鏡觀察。用鑷子將這段根尖取出，放在載玻片上，加一滴清水，用鑷子尖端弄碎根尖，蓋上蓋玻片，之后用拇指輕輕按壓蓋玻片，制成臨時(shí)裝片。

（三）生長素對大蒜根尖有絲分裂的影響

另取大蒜一個(gè)，剝?nèi)ネ鈱喻[片葉后，分別將蒜瓣用水和1×10-10mol/ L生長素溶液培養(yǎng).待大蒜長出2cm長的不定根，在8 00至16 00，每隔1 h剪取2mm至3mm的大蒜根尖組織，用卡諾氏液（體積比95%酒精∶冰醋酸= 3∶1）固定細(xì)胞形態(tài)，用乙醇沖洗。經(jīng)解離、漂洗、染色和制片4個(gè)過程，用顯微鏡觀察。

（四）統(tǒng)計(jì)

觀察分布均勻，染色清晰且呈現(xiàn)正方形的細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取5個(gè)根尖，每個(gè)根尖選取5個(gè)視野，共計(jì)25個(gè)視野。統(tǒng)計(jì)各個(gè)視野下大蒜有絲分裂的前期、中期、后期和末期的細(xì)胞數(shù)目，以及間期細(xì)胞的數(shù)目。計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)有絲分裂的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。其中，有絲分裂的細(xì)胞數(shù)等于前期、中期、后期和末期的細(xì)胞總和。總細(xì)胞數(shù)等于有絲分裂細(xì)胞數(shù)與間期細(xì)胞數(shù)。中后期細(xì)胞指數(shù)是指中期細(xì)胞數(shù)與后期細(xì)胞數(shù)之和與總細(xì)胞數(shù)的比值。有絲分裂指數(shù)是指有絲分裂各期細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（一）不同堿性染料處理的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中采用10×40倍顯微鏡觀察，分別用甲紫、番紅和改良的苯酚品紅3種堿性染料處理的臨時(shí)裝片。其中，甲紫和番紅染料與核酸的結(jié)合能力較強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)不同程度被染料染色，影響染色體的計(jì)數(shù)和觀察。改良的苯酚品紅染料染色8min至10min，要比甲紫、番紅染色（3～ 5min）都要長，但是細(xì)胞質(zhì)不著色，染色體呈現(xiàn)淡紫色，見圖1。

（二）生長素對根尖分生區(qū)細(xì)胞有絲分裂的影響

顯微鏡采用10×40倍，觀察25個(gè)視野下的大蒜根尖分生區(qū)細(xì)胞有絲分裂情況。實(shí)驗(yàn)組用10-10mol/ L生長素培養(yǎng)，對照組用蒸餾水培養(yǎng)。

表1對照組結(jié)果顯示，大蒜根尖分生細(xì)胞在10 00和14 00要比其他時(shí)間分裂旺盛 其中14 00出現(xiàn)分裂最高峰 分裂指數(shù)達(dá)到4. 00% 10 00出現(xiàn)另一個(gè)高峰 分裂指數(shù)是3. 23% 中后期指數(shù)最高的時(shí)期是15 00，達(dá)到1. 69%。

表2實(shí)驗(yàn)組結(jié)果顯示，用10-10mol/ L生長素培養(yǎng)大蒜根尖細(xì)胞也存在高峰，8 00時(shí)為最高峰 有絲分裂指數(shù)達(dá)到9. 45% 但是隨著時(shí)間推后 有絲分裂指數(shù)依次下降 在16 00 用生長素培養(yǎng)與用蒸餾水培養(yǎng)的大蒜根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)都是最低 細(xì)胞處于中后期比例在9 00處于最高，達(dá)到3. 93%。

四、討論

關(guān)于染色的方法，教材采用甲紫染料染色。因甲紫或番紅都與細(xì)胞質(zhì)中的RNA親和性高，以至于在觀察染色體出現(xiàn)模糊狀態(tài)，影響了它們與細(xì)胞核中DNA結(jié)合，不利于觀察。而改良的苯酚品紅染料與RNA親和性差，沒有干擾與DNA的結(jié)合，觀察染色體較為清晰，效果明顯。僅從結(jié)果看，用改良的苯酚品紅染料是本實(shí)驗(yàn)理想的染料。

用清水培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞，考慮到在判斷細(xì)胞所處的時(shí)期有誤差，但肯定的是，在一天中分裂指數(shù)會(huì)出現(xiàn)多個(gè)高峰，如10 00、14 00，這與李愛玲的研究是一致的[3]。而用10-10mol/ L的生長素處理大蒜細(xì)胞，細(xì)胞分裂指數(shù)和中后期指數(shù)明顯高于清水組，從開始到結(jié)束，整體上呈現(xiàn)下降趨勢。這說明，生長素確實(shí)可以提高細(xì)胞分裂指數(shù)，尤其是提高中后期細(xì)胞數(shù)目比例。為提高本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)效果，用10-10mol/ L的生長素處理大蒜，建議在8 00左右就取材解離細(xì)胞最為合適。至于為什么8 00要比10 00和14 00時(shí)的效果更好，我們認(rèn)為，有絲分裂不僅與溫度有關(guān)，而且還與生長素的調(diào)節(jié)相關(guān)。此外，我們開展的實(shí)驗(yàn)正處于南方夏季，溫度較高，其他時(shí)間以及其他地方任意時(shí)間，有絲分裂效果如何，這些都需要進(jìn)一步探討。

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[7]人民教育出版社 課程教材研究所 生物課程教材研究開發(fā)中心.普通高中教科書生物學(xué)選擇性必修1穩(wěn)態(tài)與調(diào)節(jié)[M].北京：人民教育出版社，2019：94.

（責(zé)任編輯：加順花）