?N-芳基氨基甲酸芐酯的合成及抗真菌活性研究?

摘要：為發(fā)現(xiàn)更多抗真菌藥物分子，設(shè)計合成16種N-芳基氨基甲酸芐酯類目標(biāo)化合物，并進行結(jié)構(gòu)鑒定；以醚菌酯為陽性對照，采用菌絲線性生長速率法，測定目標(biāo)化合物對常見的10種植物病原真菌的體外抑制活性，以及5種高抗菌活性的目標(biāo)化合物對蘋果輪紋病原菌和番茄早疫病原菌的毒力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有目標(biāo)化合物對10種供試真菌都有不同程度的抑制活性，其中，化合物B11抗菌活性最高，對9種供試真菌的抑制率均超過80%，對馬鈴薯干腐病原菌的抑制率為98.1%，對番茄早疫病原菌的EC50為7.6 μg/mL。構(gòu)效關(guān)系研究表明，-F和-Me的引入有利于提高活性，是該類化合物的優(yōu)勢基團；-F和-Me的組合可大幅度提高活性，是優(yōu)勢基團疊加效應(yīng)的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：N-芳基氨基甲酸芐酯；植物病原真菌；抗真菌活性；構(gòu)效關(guān)系

中圖分類號：S482.2 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）10-0070-05

Synthesis and Antifungal Activity of N-Arylaminomethyl Benzyl Ester

YANG Shan-shan1，2，SHA Yun-ying1，2，YAN Wei-ting2，GUO Wei-lu2，WANG Yang-li2，

ZHANG Yu-mo2，LIU Zhu-yun1，3

（1. Jiangsu Intelligent Pharmaceutical Industry-Education Integration Platform， Taizhou 225300， PRC; 2. Taizhou Polytechnic College， Taizhou 225300， PRC; 3. Nanjing Tech University， Nanjing 210000， PRC）

Abstract： To discover novel antifungal molecules， we designed and synthesized 16 target compounds of N-arylaminomethyl benzyl esters and identified their structures. With kresoxim-methyl as the positive control， the inhibitory effects of the target compounds on 10 common phytopathogenic fungi were determined by the mycelial growth rate method. Furthermore， the toxicity of 5 highly antifungal target compounds to Botryosphaeria dothidea and Alternaria solani was determined. The results showed that all the target compounds inhibited the growth of the 10 tested fungi. Among them， compound B11 had the highest antifungal activity， with the inhibition rates over 80% against 9 tested fungi. In addition， compound B11 demonstrated the inhibition rate of 98.1% against Fusarium sambucinum and the EC50 of 7.6 μg/mL against A. solani. The analysis of structure-activity relationship showed that -F and -Me increased the compound activity， being the dominant functional groups of such compounds. The combination of -F and -Me significantly enhanced the compound activity， which was attributed to the combined effect of dominant functional groups.

Key words： N-arylaminomethyl benzyl ester; phytopathogenic fungi; antifungal activity; structure-activity relationship

目前有超過19 000種植物病原真菌可以感染農(nóng)作物和植物，導(dǎo)致農(nóng)作物質(zhì)量和產(chǎn)量下降，從而造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。相比于其他微生物群體，植物病原真菌是造成全球農(nóng)業(yè)損失的主要原因，每年導(dǎo)致的經(jīng)濟損失已超過2000億美元[3]。除此之外，一些植物病原真菌也會引起食品安全問題，因為其代謝產(chǎn)生的真菌毒素可損傷人和動物的健康[4]。植物真菌病害已成為最具破壞性的因素之一，其對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響不容忽視。迄今為止，控制植物病原真菌最有效的方法是化學(xué)殺菌劑，然而傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑的長期使用不但會導(dǎo)致真菌耐藥性的產(chǎn)生，也會引起環(huán)境污染和土壤退化等問題[5-6]。因此開發(fā)新型抗菌劑就顯得十分必要。

氨基甲酸酯（Carbamate）及其衍生物具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和較強的細胞膜滲透能力，在藥物化學(xué)中占有重要的地位，廣泛應(yīng)用于農(nóng)用化學(xué)品、藥物前體和藥物中間體[7-8]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，氨基甲酸酯可以用作殺菌劑、除草劑及殺蟲劑[8]。目前已有多種氨基甲酸酯類化合物應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，例如苯菌靈（Benomyl）、氯炔靈（Chlorbufam）及速滅威（Metolcarb）等[9]。

目前關(guān)于N-芳基氨基甲酸芐酯對植物病原真菌抑制活性的報道較少。為篩選更多高活性抗真菌先導(dǎo)化合物，豐富氨基甲酸酯類化合物的活性研究，本試驗通過合成16種N-芳基氨基甲酸芐酯類目標(biāo)化合物，鑒定目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)和檢測對10種常見植物病原真菌的抑制活性，并對其構(gòu)效關(guān)系進行分析。

1 材料與方法

1.1 供試植物病原菌

10種供試植物病原真菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥中心提供，分別為：蘋果輪紋病原菌（Physalospora piricola）、煙草赤星病原菌（Alternaria alternata）、西瓜枯萎病原菌（Fusarium oxysporium f. sp. Niveum）、水稻稻瘟病原菌（Pyricularia oryza）、馬鈴薯干腐病原菌（Fusarium solani）、白菜黑斑病原菌（Alternaria brassicae）、小麥赤霉病原菌（Fusariumgraminearum）、蘋果腐爛病原菌（Valsa mali）、番茄早疫病原菌（Alternaria solani）、玉米彎孢病原菌（Curvularia lunata）。

1.2 主要儀器與試劑

IKA C-MAG HS7磁力攪拌器、Bruker AVANCE NEO核磁共振儀、SW-CJ-1BC潔凈操作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、PRX-4500智能培養(yǎng)箱（寧波賽福實驗儀器有限公司）。

合成16種目標(biāo)化合物的主要試劑（表1），葡萄糖、瓊脂、二甲基亞砜（DMSO）、醚菌酯（97%）、四氫呋喃、乙酸乙酯、石油醚、碳酸氫鈉、無水硫酸鈉，合成目標(biāo)化合物所用的主要試劑為分析純，其他試劑為化學(xué)純。

1.3 試驗方法

1.3.1 目標(biāo)化合物的合成 參照Mdeni N L[10]的方法合成所有目標(biāo)化合物，試劑用量一致。以A1為例，合成步驟如下：

將5 mmol苯胺溶于干燥四氫呋喃中，0 ℃攪拌下加入6 mmol碳酸氫鈉，之后緩慢滴加6 mmol氯甲酸芐酯，滴加完畢后，將溫度緩慢升至室溫。待TLC檢測反應(yīng)完全，用乙酸乙酯萃?。?×30 mL），所得有機相經(jīng)飽和食鹽水洗滌和無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸餾除去溶劑，殘余物用硅膠（200～300目）柱層析進行分離純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯（體積比為5∶1）混合液，即可得目標(biāo)化合物。按公式（1）計算化合物產(chǎn)出率。

產(chǎn)出率=（實際產(chǎn)量/理論產(chǎn)量）×100% （1）

所有目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)均通過核磁共振氫譜（1H NMR）和核磁共振碳譜（13C NMR）進行鑒定。

1.3.2 抗真菌活性測定 （1）抗真菌活性初篩 采用菌絲線性生長速率法[11]，測試目標(biāo)化合物對10種供試真菌的體外抑制活性，以市售抗菌藥物醚菌酯作為陽性對照。檢測方法如下：

將200 g去皮土豆切成1 cm3的小塊，加入1 L蒸餾水煮沸20 min，過濾土豆塊，保留濾液；將20 g葡萄糖與18 g瓊脂加入濾液中，攪拌均勻即得PDA培養(yǎng)基。稱取10.0 mg待測目標(biāo)化合物溶于10 mL5% DMSO中，將配好的藥液與190 mL滅菌后的PDA培養(yǎng)基混合均勻，即得帶藥培養(yǎng)基，濃度為50 μg/mL。之后將直徑5 mm的菌餅放置于帶藥培養(yǎng)基上，置于28 ℃、濕度為80%的環(huán)境下黑暗培養(yǎng)約72 h，采用十字交叉法測量菌落直徑，并按公式（2）計算菌絲生長抑制率。每種目標(biāo)化合物及對照對應(yīng)10種供試真菌，共170個處理，每處理3次重復(fù)。

抑制率=（dc-ds）/（dc-d0）×100% （2）

式中，dc—空白對照組菌落平均直徑（mm）；ds—樣品組菌落平均直徑（mm）；d0—菌落直徑（5 mm）。

（2）抗真菌毒力測定 在抗真菌活性初篩的基礎(chǔ)上，選取5種對真菌高抑制活性的目標(biāo)化合物，測定對蘋果輪紋病原菌、番茄早疫病原菌的毒力。通過倍半稀釋法配制藥物濃度為80.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 μg/mL的系列培養(yǎng)基，并測定對應(yīng)的菌絲生長抑制率，計算5種目標(biāo)化合物抗真菌的EC50值和95% CI。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對抗真菌活性檢測數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理。

抗真菌毒力測定中，以藥物濃度的對數(shù)值（lgC）為自變量x，該濃度下平均抑制率（0～1）的幾率值為因變量y，采用Graphpad Prism 6.0 軟件進行線性擬合，得出毒力回歸方程y = kx + b，并算出半數(shù)有效濃度（EC50）及95%置信區(qū)間（95% CI）。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)化合物合成的產(chǎn)出率、物理性狀及核磁數(shù)據(jù)

合成16種目標(biāo)化合物的名稱、產(chǎn)出率、物理性質(zhì)及核磁共振氫譜（1H NMR）數(shù)據(jù)見表2。

合成目標(biāo)化合物的產(chǎn)出率在82%～99%之間。核磁數(shù)據(jù)中，由于芐基的存在，所有化合物都存在一個單峰δH ≈ 5.20 ppm（s，2H），為Ph-CH2-O；酰胺鍵O=C-NH為活潑氫，出現(xiàn)在δH = 6.50～6.80 ppm（s，1H）。

2.2 目標(biāo)化合物的抗真菌活性

2.2.1 抗真菌活性初篩 由表3可知，所有目標(biāo)化合物在50 μg/mL時對10種供試真菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用；B11對9種供試真菌的抑制率均超過80%，對水稻稻瘟病、馬鈴薯干腐病、蘋果腐爛病的病原菌抑制率分別達到了91.8%、98.1%、92.6%，活性優(yōu)于陽性對照醚菌酯；B1對蘋果輪紋病、馬鈴薯干腐病、小麥赤霉病、番茄早疫病的4種病原菌抑制率達80%以上，A1對蘋果輪紋病、小麥赤霉病、番茄早疫病3種病原菌抑制率高于80%，B10對馬鈴薯干腐病、蘋果腐爛病、番茄早疫病的3種病原菌抑制率高于80%。

由圖1可知，16個目標(biāo)化合物中，9個化合物的平均抑制率為58.2%～85.8%，高于陽性對照醚菌酯（平均抑制率57.7%）；B11表現(xiàn)出最高活性，平均抑制率達85.8%，是醚菌酯的1.5倍；A1、B1、B5和B10的平均抑制率超過了70%。

帶有取代基的B系列化合物中，-F（氟原子）和-Me（甲基）的引入可提高化合物（B1、B5）的活性，而其他取代基的引入則會降低化合物（B2～B4、B6～B9）的活性。

10種供試真菌中，番茄早疫病原菌和蘋果輪紋病原菌對應(yīng)的高活性化合物數(shù)量較多，可認為是該類化合物的敏感菌株。而煙草赤星病、西瓜枯萎病、水稻稻瘟病、白菜黑斑病和玉米彎孢病5種供試真菌對應(yīng)的高活性化合物數(shù)量較少，總體上敏感度較低。

2.2.2 5種高抗菌活性目標(biāo)化合物的抗真菌毒力 由表4、表5可知，高活性化合物A1、B1、B5、B10、B11對蘋果輪紋病原菌的抑制活性均高于陽性對照，其EC50值在8.82～22.3 μg/mL范圍內(nèi)，均小于醚菌酯（EC50＞50 μg/mL）；B5對番茄早疫病原菌的EC50值與陽性對照相同，A1、B11低于陽性對照，B1、B10高于陽性對照。

3 結(jié)論

試驗設(shè)計合成16種N-芳基氨基甲酸芐酯類化合物，并通過NMR驗證了結(jié)構(gòu)。體外抗真菌活性測定發(fā)現(xiàn)5種高活性化合物，N-（3，5-二氟苯基）氨基甲酸芐酯（B11）的活性最高，可作為抗真菌藥物候選分子?；钚詳?shù)據(jù)分析得到如下結(jié)論：（1）酰胺鍵與苯環(huán)之間的橋鏈長度與化合物活性緊密相關(guān)。當(dāng)酰胺鍵與苯環(huán)直接相連時，化合物的活性總體較高（A1 vs A2～A4）；（2）取代基的引入影響化合物的結(jié)構(gòu)。與其他取代基相比，-F和-Me的引入有利于提高活性，屬于優(yōu)勢基團（A1 vs B1～B9）；（3）-F和-Me的組合可大幅度提高活性，是優(yōu)勢基團疊加效應(yīng)的結(jié)果（B10～B12）。以上研究結(jié)果可為氨基甲酸酯類抗真菌藥物的研發(fā)提供參考。

參考文獻：

[1] JAIN A，SARSAIYA S，WU Q，et al. A review of plant leaf fungal diseases and its environment speciation[J]. Bioengineered， 2019， 10（1）：409-424.

[2] ZHOU Y，YANG C J，LUO X F， et al. Design， synthesis，and biological evaluation of novel Berberine derivatives against phytopathogenic fungi[J]. Pest Management Science，2022，78（10）：4361-4376.

[3] YIN X D，MA K Y，WANG Y L，et al. Design，synthesis，and antifungal evaluation of 8-Hydroxyquinoline metal complexes against phytopathogenic fungi[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2020，68（40）：11096-11104.

[4] YANG S S，LV Q Y，F(xiàn)U J，et al. New 7-Chloro-9-methyl-2-phenyl-3，4-dihydro-β-carbolin-2-iums as promising fungicide candidates： design，synthesis，and bioactivity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2022，70（14）：4256-4266.

[5] CHEN Y J，MA K Y，DU S S，et al. Antifungal exploration of quinoline derivatives against phytopathogenic fungi inspired by quinine alkaloids[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2021，69（41）：12156-12170.

[6] YANG C J，LI H X，WANG J R，et al. Design，synthesis and biological evaluation of novel evodiamine and rutaecarpine derivatives against phytopathogenic fungi[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2022， 227：113937.

[7] 張曉鵬，梁冰潔，裴瑩瑩，等. 氨基甲酸酯類化合物的合成進

展[J]. 化學(xué)通報，2010，73（10）：886-891.

[8] 張福豪. 含氨基甲酸酯/羧酸酯基的取代嘧啶甲酰胺的合成及殺菌活性研究[D].山東： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

[9] MALHOTRA H，KAUR S，PHALE P S. Conserved metabolic and evolutionary themes in microbial degradation of carbamate pesticides[J]. Frontiers in Microbiology， 2021，12： 648868.

[10] MDENI N L，ADENIJI A O，OKOH A I，et al. Analytical evaluation of carbamate and organophosphate pesticides in human and environmental matrices： a review[J]. Molecules （Basel， Switzerland），2022，27（3）：618.

[11] TRAN V H，KIM H K. CaI2-Catalyzed direct transformation of N-Alloc-，N-Troc-，and N-Cbz-protected amines to asymmetrical ureas[J]. New Journal of Chemistry，2019，43（35）：14093-14101.

[12] ZHANG Y H，YANG S S，ZHANG Q，et al. Discovery of N-phenylpropiolamide as a novel succinate dehydrogenase inhibitor scaffold with broad-spectrum antifungal activity on phytopathogenic fungi[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2023，71（8）：3681-3693.

（責(zé)任編輯：謝培庚）