?利用SSR標記技術檢測西瓜種子的遺傳純合度?

摘要：為快速高效檢測西瓜種子純度和判定種子真?zhèn)?，研究?36份西瓜種子進行了DNA快速提取，并設計合成了25對SSR引物，通過PCR擴增與瓊脂凝膠電泳技術篩選核心引物，對52份未知純度西瓜種子進行鑒定。結果表明：篩選的17對核心引物（HY、XG1、XG2、XG3、XG4、XG5、XG7、XG9、XG10、XG11、XG13、XG14、XG15、XG17、XG19、XG22、XG23）多數(shù)多態(tài)性好，擴增條帶清晰，可用于鑒定西瓜種子或植株的雜合度；利用篩選出的6組核心引物對未知純度種子進行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中50份西瓜種子為雜合子，2份西瓜種子純合度無法鑒定。

關鍵詞：西瓜；SSR標記；純度鑒定

中圖分類號：S651 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）10-0001-05

Detection of Genetic Purity in Watermelon Seeds Based on SSR Markers

ZHOU Chi1，LIN Yan1，2，LI Xin1，ZHANG Qing-zhuang1，RAO Li-qun2，RUAN Wan-hui1

（1. Hunan Vegetable Research Institute， Changsha 410125， PRC; 2. College of Bioscience and Biotechnology，

Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract： This study aims to detect the purity and examine the authenticity of watermelon seeds in a rapid and efficient manner. DNA was extracted from 236 watermelon seed samples， and 25 pairs of SSR primers were designed and synthesized. The core primers were then screened by PCR amplification and agar gel electrophoresis and used to identify 52 watermelon seed samples with unknown genetic purity. The results showed that most of 17 pairs of core primers （HY， XG1， XG2， XG3， XG4， XG5， XG7， XG9， XG10， XG11， XG13， XG14， XG15， XG17， XG19， XG22， and XG23） were polymorphic， with clear amplification bands， and thus can be used to identify the heterozygosity of watermelon seeds or plants. Furthermore， selected six pairs of core primers were used for the identification of seeds with unknown genetic purity， which revealed that 50 watermelon seed samples were heterozygous and 2 samples could not be identified for homozygosity.

Key words： watermelon; SSR markers; identification of genetic purity

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. & Nakai]

屬于葫蘆科西瓜屬一年生蔓生藤本植物，中國是世界上西瓜生產和消費第一大國[1]。雜種優(yōu)勢在西瓜生產中有著重要的地位，在生產中，雜交種純度受人工去雄時機、隔離區(qū)選擇和母本對環(huán)境的敏感性等多種因素影響，制種過程很難保證西瓜雜交種子的遺傳純度。然而，使用遺傳純度低的西瓜種子會導致后代性狀分離、產量降低和品種遺傳退化，直接影響農產品品質及農民收益[2-3]。因此，對雜交F1代種子進行純度檢測和真?zhèn)舞b定至關重要[4]。西瓜品種傳統(tǒng)鑒定一般采用形態(tài)學鑒定法，即DUS（特異性、一致性、穩(wěn)定性）測試，然而形態(tài)學鑒定法易受環(huán)境因素影響，特別是在區(qū)分近似品種的形態(tài)特征時，容易產生人為誤差，對鑒定人經(jīng)驗要求較高[5]。

因此，研究一種準確且方便的鑒定純合度技術尤為重要。

隨著農業(yè)生物技術的發(fā)展，通過分析植物DNA的多態(tài)性，在DNA水平上比較品種之間基因組結構與組成的分子鑒定方法越來越受到關注。SSR（Simple sequence repeats）分子標記法具有多態(tài)性高、重復性強等優(yōu)點，廣泛應用于分子植物輔助育種和純度鑒定。SSR分子標記技術不僅可以鑒別純合子和雜合子，而且操作簡便、準確性高，具有較大的應用前景[6]。核心SSR分子標記在我國西瓜遺傳多樣性分析和雜交種純度鑒定上的應用已非常廣泛。何玉等[7]

利用SSR分子標記技術對西瓜‘W1806’與甜瓜‘M1805’各3個批次及其親本間的多態(tài)性進行引物篩選和種子的純度鑒定，證明了SSR分子標記法對西瓜的純度鑒定是可靠的。尤佳琪等[8]篩選的SSR引物適用于‘黑津’和‘申蜜968’雜交種純度的快速鑒定，并分析比較了各親本種質SSR引物的多態(tài)性表現(xiàn)，構建出親本材料的遺傳特異性DNA指紋圖譜。孫波等[9]利用SSR分子標記技術對‘雪龍三號’西瓜品種進行引物篩選和種子純度鑒定，鑒定結果與大田檢測結果吻合率高達99%。程維舜等[10]利用熒光標記SSR技術對西瓜雜交種及其親本間的擴增譜帶多態(tài)性進行了引物篩選和種子純度鑒定，證明SSR標記技術可用于‘武農8號’雜交種純度室內快速檢測。

該研究從236份西瓜種子中提取DNA為模板，參考標準NY/T 2472—2013設計合成25對引物，通過PCR擴增技術，篩選了6組核心引物，用于52份純合度未知西瓜的純度鑒定，以期為建立快速準確的西瓜雜合種子遺傳純度檢測體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為湖南省蔬菜研究所保存的西瓜種子，共計236份，其中純合子西瓜種子184份，純度待測種子52份（表1）。主要試驗試劑有2×Taq PCR StarMix、StarMarker D2000、StarStain Red Plus、10×TBE，均購自北京擎科生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5424常溫高速離心機（德國艾本德股份公司）；TGyrate迷你渦旋混勻儀[OSE-VX-03，天根生化科技（北京）有限公司]；070-851型PCR儀（德國Biometra公司）；PowerPac Basic電泳儀電源（美國Bio-Rad公司）；Gel-Logic 212 Pro凝膠成像儀（Carestream公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA提取、純度檢測 采用CTAB法提取236份西瓜種子的基因組DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測DNA的純度與完整性，采用NanoDrop法檢測DNA濃度。

1.3.2 引物設計 參考標準NY/T 2472—2013設計了25對引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表2。

1.3.3 PCR擴增體系 PCR擴增體系（20 μL）包括：DNA模板2 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，2×Taq PCR StarMix10 μL，加入ddH2O補足至20 μL。PCR擴增反應程序為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，54～61℃退火30 s，72℃延伸20 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產物于4℃條件下保存。對PCR產物進行瓊脂凝膠電泳檢測，電泳后用凝膠成像儀拍照記錄。

1.3.4 核心引物篩選 對236份西瓜DNA樣品與25對引物分別進行PCR擴增，觀測其電泳條帶。在所有引物中尋找能分別擴增2個純合種西瓜其中1個的引物，再尋找1對2個純合種西瓜均無條帶的引物，將3對符合以上條件的引物組合，對未知純度的西瓜種子進行篩選。

2 結果與分析

2.1 引物鑒定結果

將25對引物與236份西瓜種子DNA分別進行PCR擴增，引物PCR產物長度見表3。SSR分子標記鑒定中，PCR產物過短容易與引物二聚體混淆，過長則會增加鑒定成本，故后續(xù)核心引物篩選試驗中剔除HY引物。

由表4可知，XG1可以擴增出所有西瓜種子的DNA樣品，XG2、XG3、XG8可擴增出大部分DNA樣品且條帶清晰明顯；XG6、XG12、XG18、XG21電泳具有引物二聚體拖尾現(xiàn)象，故不將其作為核心引物。根據(jù)引物的電泳情況，篩選到17對特異性引物（HY、XG1、XG2、XG3、XG4、XG5、XG7、XG9、XG10、XG11、XG13、XG14、XG15、XG17、XG19、XG22、XG23），大部分多態(tài)性好，擴增條帶清晰，可用于西瓜種子純度的鑒定。

2.2 核心引物篩選結果

根據(jù)核心引物篩選方法篩選出6組鑒定西瓜種子純合度的引物組合，由表5可知，52份未知種子中有50份為雜合子，其他2份西瓜種子（47、116）純合度無法鑒定。擴增檢測的部分結果見圖1、2。

3 討論與結論

研究對236份西瓜種子進行DNA快速提取，在236份西瓜材料中，共184份西瓜已知純合度，52份西瓜純合度未知。參考標準NY/T 2472—2013設計合成25對引物，根據(jù)電泳情況篩選到17對特異性引物（HY、XG1、XG2、XG3、XG4、XG5、XG7、XG9、XG10、XG11、XG13、XG14、XG15、XG17、XG19、XG22、XG23），大部分多態(tài)性好，擴增條帶清晰，可用于鑒定西瓜種子或植株的雜合度。選擇多態(tài)性好的引物組成6組核心引物對52份未知純度西瓜種子進行鑒定，結果顯示52份未知純度種子中有50份西瓜種子為雜合子，2份西瓜種子純合度無法鑒定。

SSR分子標記技術不僅能鑒定種子是否為純合子，還能檢測雜交種子的“純度”，即親本的“純粹度”。通過SSR分子標記技術篩選的核心引物可鑒定未知純合度西瓜種子，也可驗證已知純合度的西瓜種子。后期將進行田間驗證，以確保所篩選到的SSR分子標記引物鑒定結果可以真實且準確反映西瓜的遺傳純合度。

參考文獻：

[1] 孫立新，王曉君，吳敬學，等. 中國西瓜甜瓜生產區(qū)域布局變遷及驅動因素研究[J]. 中國農業(yè)資源與區(qū)劃，2023，44（8）：42-51.

[2] 羊杏平，劉廣，侯喜林，等 利用RAPD和ISSR 2種分子標記鑒定西瓜雜交種的遺傳純度[J]. 江蘇農業(yè)學報，2010，26（6）：1313-1318.

[3] 李麗，張力，劉玲，等. SSR標記評價西瓜品種的一致性[J]. 農業(yè)生物技術學報，2014，22（5）：590-597.

[4] 劉子記，詹園鳳，朱婕，等. 利用SSR標記鑒定西瓜雜交種純度的研究[J]. 熱帶作物學報，2016，37（9）：1714-1718.

[5] 馬雙武，韋小敏，王吉明. 我國西瓜雜交種子純度鑒定方法綜

述[J]. 長江蔬菜，2006（10）：27-30.

[6] 楊會會，李賀威，趙永威，等. 利用多重PCR鑒定西瓜雜交種純度[J]. 中國瓜菜，2020，33（2）：17-21.

[7] 何玉，楊坤. 利用SSR技術鑒定西瓜甜瓜種子純度[J]. 中國瓜菜，2020，33（1）：13-17.

[8] 尤佳琪，李超漢，楊紅娟，等. 基于SSR標記的西瓜新品種‘黑津’和‘申蜜968’的純度鑒定[J]. 分子植物育種，2024，22（17）：5648-5656.

[9] 孫波，鄒甜，王志偉，等. 利用SSR技術鑒定西瓜品種純度[J]. 中國瓜菜，2018，31（6）：16-19.

[10] 程維舜，羅茜，洪娟，等. 利用熒光標記SSR鑒定西瓜雜交種的純度研究[J]. 中國果菜，2020，40（12）：36-41.

（責任編輯：王婷）