玉米秸稈水熱生物炭施用對土壤重金屬Cd生物有效性和微生物群落的影響

關(guān)鍵詞：水熱炭化；水熱炭；重金屬；生物有效性；微生物群落

健康的土壤是人類賴以生存和發(fā)展的重要基礎(chǔ)。據(jù)統(tǒng)計，鎘（Cd）在我國重金屬污染土壤中的點位超標率最高，達7%。土壤重金屬污染具有隱蔽性、長期性、不可降解性和生物累積性，且重金屬可隨食物鏈傳播，威脅生態(tài)環(huán)境安全和人類健康，已成為全球性環(huán)境問題。因此，修復重金屬污染土壤，維持生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)健康發(fā)展迫在眉睫。

目前，原位鈍化修復技術(shù)不但能改變土壤重金屬的賦存形態(tài)，降低其移動性和生物有效性，而且具有經(jīng)濟高效、操作簡單、無二次污染等優(yōu)點，已成為常用的土壤重金屬污染修復技術(shù)之一。低成本且環(huán)境友好的生物炭因具有較多的孔結(jié)構(gòu)、較大的比表面積和豐富的含氧官能團，能夠有效固定重金屬，降低其生物有效性，已被廣泛應用于修復重金屬污染土壤。水熱生物炭（簡稱水熱炭）是指生物質(zhì)在中等溫度（180-260℃）和自生壓力下，以水為反應介質(zhì)，經(jīng)水解、脫水、脫羧、縮聚及芳香化等產(chǎn)生的生物炭，該反應過程被稱為水熱炭化。與高溫缺氧（300-1200℃）條件下產(chǎn)生的熱解生物炭（簡稱熱解炭）相比，水熱炭的制備無需原料預處理，耗能低，產(chǎn)率高，表面含氧官能團（羥基、羧基和羰基等）更豐富，對重金屬污染土壤修復具有良好的應用潛力。例如，Ren等發(fā)現(xiàn)污泥水熱炭降低了土壤Cd的生物有效性（15.38%），并有效減少了白菜地上部和地下部對Cd的吸收（分別減少了52.29%和57.53%）。Xia等發(fā)現(xiàn)施用水熱炭后，土壤中銅、鉛和Cd的生物有效性、淋溶毒性及在水稻中的富集量均有不同程度的下降。此外，水熱溫度會直接影響水熱炭的理化性質(zhì)，而水熱炭的理化性質(zhì)及其添加率均會對土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生較大影響，進而影響土壤重金屬的生物有效性。

目前，前人研究多關(guān)注水熱炭施用對土壤重金屬生物有效性和作物吸收的影響，對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)注較少。土壤微生物在陸地生態(tài)系統(tǒng)的生物化學循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，是衡量土壤質(zhì)量與生態(tài)功能的重要指標，然而其多樣性和群落結(jié)構(gòu)等易受環(huán)境因素影響。因此，本研究以玉米秸稈為原料于不同水熱溫度下制備水熱炭，采用盆栽試驗，探究不同水熱炭及其添加率對Cd污染土壤的修復效果和微生物響應，為水熱炭基材料修復土壤重金屬污染提供科學依據(jù)，也為玉米秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物的高值資源化利用提供新途徑。

1材料與方法

1.1實驗材料

本研究使用的玉米秸稈取自北京市密云區(qū)某有機肥廠．洗凈、干燥并粉碎過2mm篩備用。供試土壤取自北京市密云區(qū)未被重金屬污染的玉米地表層土壤（0-20cm），將其自然風干后過2mm尼龍篩備用。供試土壤類型為壤土，pH為8.38，有機質(zhì)含量27.58g·kg-1，全氮含量1.77g·kg-1，銨態(tài)氮含量9.57mg·kg-1，硝態(tài)氮含量40.62mg·kg-1，全磷含量1.52g·kg-1，速效磷含量46.70mg·kg-1，全鉀含量23.25g·kg-1，速效鉀含量280mg·kg-1，未檢測到Cd。供試盆栽植物為油菜，品種為京研春油1號。

1.2水熱炭制備及盆栽試驗

稱取一定量粉碎后的玉米秸稈與去離子水均勻混合后（固液比1：9）置于2L高溫高壓反應釜中（KCF-2，北京世紀森朗實驗儀器有限公司），分別于180、200℃及220℃反應1h。反應結(jié)束后，通冷卻水迅速將反應釜冷卻至室溫，然后將水熱產(chǎn)物經(jīng)真空抽濾進行固液分離，固體水熱炭于60℃烘24 h后，研磨過100目篩并置于干燥皿中備用，三種水熱炭分別記為HC180、HC200和HC220。

盆栽試驗于北京市農(nóng)林科學院連棟溫室中開展。將一定量風干過篩后的土壤浸入硝酸鎘溶液中，使土壤Cd含量為1.0mg·kg-1．培養(yǎng)15d。將2.0kg重金屬污染土壤與3種水熱炭分別以1%和3%的比例充分混合，共設(shè)置7個處理（表1），其中以不添加水熱炭的處理作為對照（CK），每個處理均設(shè)3次重復。所有土壤均施人等量化肥，即每盆0.76g尿素、1.16g磷酸氫二銨和0.70g氯化鉀。每盆撒入10粒油菜種子，并于第10天間苗至2棵。盆栽期間土壤含水率保持田間持水量的70%。培養(yǎng)40d后，將收獲后的油菜地上部葉片用去離子水洗凈擦干，測定葉片鮮質(zhì)量和植株高度，殺青（105℃，30min）后于60℃烘干至質(zhì)量恒定，最后粉碎過100目篩備用。此外，收集根際土壤和非根際土壤，根際土壤于-80℃保存用于微生物分析，非根際土壤經(jīng)自然風干過100目篩后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3指標測試

元素（C、H、N、S）組成使用元素分析儀（Vario ELIII，Elementar）測定。樣品的灰分測定方法參考GB/T212-2008，0含量用差減法確定。采用傅里葉紅外光譜分析儀（Nicolet6700）表征水熱炭的表面官能團。樣品pH按照土水比1：2.5用pH計測定。土壤電導率（EC）按照土水比1：5用電導率儀測定。土壤有機質(zhì)（OM）含量采用重鉻酸鉀容量法測定。樣品的溶解性有機碳（DOC）含量經(jīng)振蕩提取后（土水比1：20，180r·min-1，24h）用總有機碳分析儀（Multi N／C 3100TOC/TN，Analytikjena）測定。油菜葉片的葉綠素相對含量（SPAD值）采用SPAD-502 Plus型手持式葉綠素儀測定。土壤總Cd含量經(jīng)HCI-HN03-HF-HC104消解后測定，油菜葉片Cd含量經(jīng)HN03-HC104消解后測定，土壤有效態(tài)Cd含量經(jīng)0.005mol·L-1 DTPA、0.10mol·L-1三乙醇胺和0.01mol·L-1 CaCl2混合液浸提1h后取上清液測定。上述消解／提取液中的Cd含量采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，NexION 300X，PerkinElmer）測定。土壤微生物測定由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTC AAT-3’）對細菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)段進行PCR擴增。利用IlluminaMiseq高通量測序平臺測序。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用3次重復的平均值±標準誤差表示。使用SPSS 25對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（Dun-can檢驗）和Pearson相關(guān)性分析。使用Canoc0 5進行冗余分析（RDA）。采用Origin 2018進行圖形繪制。

2結(jié)果與討論

2.1玉米秸稈水熱炭的理化性質(zhì)

玉米秸稈及其水熱炭的理化性質(zhì)如表2所示。結(jié)果表明玉米秸稈經(jīng)水熱炭化處理后，水熱炭的pH為5.11-5.33，呈弱酸性，這可能是由于水熱過程中產(chǎn)生的有機酸附著在水熱炭上。前人發(fā)現(xiàn)豬糞水熱炭的pH也呈弱酸性。隨著水熱溫度升高，水熱炭的C含量逐漸升高，H和0含量逐漸降低，這是由于較高的水熱溫度促進了脫水和脫羧反應，H/C和O/C原子比分別由1.76和0.85降低到1.32-1.57和0.53-0.71，與前人研究結(jié)果一致。隨著水熱溫度升高，水熱炭的N含量略升高，這可能是由于水熱過程中碳水化合物和蛋白質(zhì)之間發(fā)生了美拉德反應。Wang等也報道了類似現(xiàn)象。此外，3種玉米秸稈水熱炭的DOC含量為18.99-31.69mg·g-1，低于番茄廢棄物水熱炭的DOC含量。具有高反應活性和遷移能力的溶解性有機質(zhì)可被土壤微生物利用，進而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和污染物遷移轉(zhuǎn)化等。

圖1是3種水熱炭的紅外光譜圖。結(jié)果顯示3種水熱炭的官能團主要包括-OH（3340cm-1）、-CH（2917cm-1和2850cm-1）、C=C（1600cm-1）、-COOR（1369cm-1）、C-0（1160cm-1）、C-0-C（1109cm-1和1054cm-1）和Si-O-Si（788cm-1和450cm-1）此外，隨著水熱溫度升高，水熱炭表面含氧官能團的相對強度逐漸增大。

2.2不同處理對油菜生長的影響

水熱炭施用對油菜生長的影響如表3所示。結(jié)果表明，與CK相比，所有處理均顯著降低了油菜葉片鮮質(zhì)量（Plt;0.05），油菜株高和葉片SPAD值也分別降低了4.81%-29.73%和5.31%-36.91%。Yin等也發(fā)現(xiàn)添加1%蘆葦秸稈水熱炭降低了生菜地上部鮮質(zhì)量（32.2%，Plt;0.05）。本研究中施用水熱炭對油菜生長產(chǎn)生了負面作用，可能是未經(jīng)水洗等預處理的水熱炭直接或間接導致的毒害作用。一方面，3種水熱炭均呈弱酸性（表2），說明水熱過程中產(chǎn)生的有機酸附著在水熱炭上，此外，水熱過程中還會產(chǎn)生其他潛在毒性物質(zhì)如酚類、醛類和多環(huán)芳烴等。潛在毒性物質(zhì)的種類和濃度對作物生長的影響是不同的。另一方面，上述潛在毒性物質(zhì)也可能對土壤有益微生物的生長和活性產(chǎn)生負面影響，進而影響作物生長，研究表明水洗、微生物老化等方式可以降低水熱炭的植物毒性。然而，Lang等發(fā)現(xiàn)添加1%玉米秸稈水熱炭對快菜鮮質(zhì)量和株高無顯著負面影響，可能與土壤類型和作物種類不同有關(guān)。此外，與1%水熱炭相比，添加3%水熱炭表現(xiàn)出更強的植物毒性，油菜鮮質(zhì)量、株高和SPAD均更低。

2.3不同處理對土壤性質(zhì)的影響

不同處理對土壤性質(zhì)的影響如表4所示。結(jié)果表明，與CK相比，水熱炭施用使土壤pH提高了0.01-0.29個單位（Pgt;0.05），這可能是由于水熱炭的存在增強了土壤微生物的還原反應，促進了氫質(zhì)子的消耗。Lang等和Sun等也發(fā)現(xiàn)添加水熱炭會提高土壤pH。一般而言，土壤pH升高會增強土壤對重金屬的吸附能力，降低土壤重金屬的生物有效性。與CK相比，處理組土壤的OM和DOC含量分別提高了21.32%-102.20%和18.53%-56.17% （Plt;0.05）。Lang等也發(fā)現(xiàn)不同原料（玉米秸稈、牛糞和狐尾藻）水熱炭均能提高抗生素污染土壤的OM含量（4.53%-22.07%．Plt;0.05）。這可能是由于水熱炭自身含有較多的有機質(zhì)，且水熱炭在土壤中會釋放大量溶解性有機質(zhì)。前人研究發(fā)現(xiàn)土壤中施用熱解炭也會出現(xiàn)類似現(xiàn)象。此外，相同水熱炭添加率下，提高水熱溫度有助于提高土壤OM和DOC含量，相同水熱溫度下，提高水熱炭添加率也會提高土壤OM和DOC含量。

2.4不同處理對土壤DTPA-Cd含量和油菜葉片Cd含量的影響

土壤中的DTPA-Cd含量和油菜葉片中的Cd含量如圖2所示。結(jié)果表明，與CK相比，添加水熱炭后土壤中的DTPA-Cd含量降低了5.01%-20.98%，油菜葉片中的Cd含量降低了10.82%-34.16%，說明水熱炭添加不但降低了土壤Cd的生物有效性，還有效抑制了油菜葉片對Cd的吸收，降低了Cd隨食物鏈傳播的風險。一方面，生物炭添加到土壤中會逐漸發(fā)生老化，產(chǎn)生更多含氧官能團，有助于土壤重金屬的固定。另一方面，所有處理均顯著提高了土壤OM和DOC含量，增強了其與土壤重金屬之間的相互作用，降低了重金屬的生物有效性。此外，水熱炭制備溫度越高，土壤Cd的生物有效性越低，油菜葉片對Cd的吸收也越少，其中T6處理（H220，3%）的效果最佳。這可能與HC220具有更多的含氧官能團，且能更大幅度地提高土壤OM和DOC含量有關(guān)。

2.5不同處理對土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1根際土壤微生物的Alpha多樣性指數(shù)

Shannon指數(shù)和Chaol指數(shù)分別反映土壤微生物群落的多樣性和豐度。表5表明所有處理的覆蓋度均大于0.99，說明高通量測序結(jié)果可靠，且各處理均顯著改變了根際土壤細菌群落的多樣性和豐度。具體而言，與CK相比，施用水熱炭土壤的Shannon指數(shù)和Chaol指數(shù)分別提高了10.43%-23.66%（Plt;0.05）和6.42%-12.55% （Plt;0.05），意味著所有處理均顯著提高了土壤細菌的多樣性和豐度，其中T5處理的提高幅度最大。這可能是由于多孔水熱炭不僅能為土壤微生物提供良好的生長環(huán)境，且能提高微生物所需的養(yǎng)分含量及其生物有效性，促進了微生物的增殖。此外，相同水熱炭添加率下，隨著水熱溫度升高，Shannon指數(shù)和Chaol指數(shù)逐漸升高。相同水熱溫度下，水熱炭添加率由1%提高到3%后，Shan-non指數(shù)和Chaol指數(shù)均無顯著差異（Pgt;0.05，T1和T2的Shannon指數(shù)除外）。Lang等也發(fā)現(xiàn)添加不同原料水熱炭（牛糞、玉米秸稈和狐尾藻）均能提高抗生素污染土壤細菌的多樣性和豐度（Plt;0.05）。然而，Wu等和Sun等均發(fā)現(xiàn)添加木屑水熱炭降低了水稻土壤細菌的多樣性和豐度。相反的結(jié)果可能是由于水熱炭制備條件、水熱炭添加率和土壤類型不同。前人研究發(fā)現(xiàn)較高的水熱溫度和較長的水熱時間易導致水熱炭具有較高的植物毒性，且高量施用水熱炭會對土壤微生物活性產(chǎn)生抑制作用。

2.5.2根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)

土壤微生物群落對重金屬的遷移轉(zhuǎn)化起著重要作用，它們能夠通過胞外絡(luò)合、胞外沉淀和胞內(nèi)積累等方式固定重金屬，從而改變重金屬的賦存形態(tài)和生物有效性。根際土壤優(yōu)勢細菌在門水平和屬水平上的群落結(jié)構(gòu)組成分別如圖3a和圖3b所示。由圖3a可知，門水平上土壤細菌豐度前5的物種分別為Actino-bacteriota （23.27%-51.45%）、Proteobacteria（14.16%-37.53%）、Chloroflexi（14.09%-21.39%）、Bacteroidota（2.57%-7.71%）和Acidobacteriota（ 3.85%-5.61%）等，相對豐度之和為85.61%-89.96%，這與其他Cd污染土壤中觀察到的細菌群落組成一致。此外，不同處理之間土壤細菌門水平的群落結(jié)構(gòu)差異較大。與CK相比，添加水熱炭后土壤中Actinobacteriota的相對豐度降低了5.52-28.17個百分點（Plt;0.05），而Proteo-bacteria、Bacteroidota和Gemmatimonadota的相對豐度分別提高了3.90-23.37、2.20-5.14個和0.14-0.66個百分點（Plt;0.05）。Actinobacteriota參與土壤養(yǎng)分循環(huán)、作物生長和有機物降解等，因此本研究中施用水熱炭后油菜生長受到抑制可能與其相對豐度降低有關(guān)。此外，相同水熱溫度下，當三種水熱炭的添加率分別由1%提高到3%時，Actinobacteriota和Gemmatimonadota的相對豐度均降低，而Proteobacte -ria和Bacteroidota的相對豐度均升高。然而，Lang等發(fā)現(xiàn)添加玉米秸稈水熱炭顯著提高了抗生素污染土壤中Actinobacteriota的相對豐度，促進了快菜生長，相反的結(jié)果可能是由于土壤類型和作物種類不同。此外，Proteobacteria易在養(yǎng)分豐富的土壤環(huán)境中存活，因此其相對豐度的提高可能是由于施用水熱炭提高了土壤中的養(yǎng)分濃度。Lang等和Sun等也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。Proteobacteria擁有多種涉及重金屬抗性或固定化的重金屬氧化酶基因的成員，能高度耐受重金屬污染，施用水熱炭后土壤DTPA-Cd含量降低可能與Proteobacteria的相對豐度升高有關(guān)。Zhang等發(fā)現(xiàn)添加熱解炭也提高了Cd污染土壤中Proteobacteria的相對豐度。Bacteroidota與土壤中復雜有機物的降解密切相關(guān)，且它是土壤中碳水化合物的主要降解者。因此，水熱炭表面附著的有機酸可能被土壤Bacteroidota降解。圖3b表明在屬水平上，分布比較廣泛的菌種是。與CK相比，添加水熱炭的土壤中Arthrobacter和Marmorico-la的相對豐度分別降低了2.95-21.61個和0.53-1.69個百分點，而Sphingomona.s的相對豐度提高了0.17-1.51個百分點。據(jù)報道Arthrobacter能夠降解多種底物，對土壤養(yǎng)分循環(huán)至關(guān)重要，而Sphingomonas對提高土壤固氮和作物抗鹽能力起著重要作用。

2.5.3相關(guān)性分析

將水熱炭添加率與土壤性質(zhì)和微生物群落進行了Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如表6所示。其中，水熱炭添加率與土壤EC、OM、DOC、Proteobacteria和Bac -teroidota呈極顯著正相關(guān)。土壤EC、OM及DOC均與土壤Proteobacteria和Bacteroidota呈極顯著正相關(guān)，與土壤DTPA - Cd和Actinobacteriota呈極顯著負相關(guān)。土壤DTPA - Cd與Actinobacteriota呈顯著正相關(guān)。此外，土壤Actinobacteriota與Proteobacteria、Bac-teroidota呈極顯著負相關(guān)，Proteobacteria與Bacteroido-to呈極顯著正相關(guān)，Chloroflexi與Acidobacteriota呈極顯著正相關(guān)。

為進一步探究土壤性質(zhì)和門水平微生物群落與土壤DTPA-Cd之間的關(guān)系，進行了RDA分析，結(jié)果如圖4所示。圖4表明第一軸和第二軸的變異解釋率分別為44.06%和5.63%，累計解釋率為49.69%。土壤DTPA-Cd濃度與土壤OM和DOC含量呈負相關(guān)關(guān)系，說明提高土壤OM和DOC含量有助于降低土壤Cd的生物有效性，Wang等和Zhang等也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。此外，土壤DTPA-Cd濃度與Actinobacteriota的相對豐度呈正相關(guān)關(guān)系，與Proteobacteria和Bacte-roidota的相對豐度呈負相關(guān)關(guān)系，且土壤DOC含量是影響細菌群落組成的關(guān)鍵因素（Plt;0.05）。

3結(jié)論

（1）未經(jīng)處理的玉米秸稈水熱生物炭具有一定的植物毒性，抑制了油菜生長，顯著提高了土壤有機質(zhì)含量（21.32%-102.20%）和溶解性有機碳含量（18.53%-56.17%），但對土壤pH無顯著影響。

（2）玉米秸稈水熱生物炭施用降低了土壤中Cd的生物有效性（5.01%-20.98%），抑制了油菜葉片對Cd的吸收（10.82%-34.16%），且隨著水熱溫度和水熱炭添加率升高，土壤DTPA-Cd濃度和油菜葉片Cd濃度均逐漸降低。

（3）玉米秸稈水熱生物炭施用提高了土壤細菌的多樣性和豐度，改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，且土壤溶解性有機碳含量是影響細菌群落組成的關(guān)鍵因素。

（4）玉米秸稈水熱生物炭對重金屬污染土壤表現(xiàn)出很大的修復潛力，然而其對重金屬的長期修復效應，及如何同時實現(xiàn)重金屬固定和改善作物生長值得進一步探究。