彝藥小紅參對LPS誘導(dǎo)大鼠乳腺炎的作用機制及研究

摘要：目的 探究彝藥小紅參對大鼠乳腺炎的影響。方法 小紅參湯組成：小紅參30 g，制成水煎液。將50只SD大鼠隨機分為5組，分別為A（空白對照組）、B（LPS模型組）、C（LPS+2.5mg/kg小紅參湯低劑量組）、D（LPS+5mg/kg小紅參湯中劑量組）、E（LPS+10mg/kg小紅參湯高劑量組）。將分娩SD大鼠與仔鼠分隔1h后開始灌胃，LPS+小紅參湯低、中、高劑量組予小紅參湯稀釋液（0.125、0.25、0.5mg/mL）灌胃；空白對照組和LPS模型組予生理鹽水灌胃，每日1次，共5 d。末次灌胃1h后造大鼠LPS乳腺炎模型，空白對照組灌注生理鹽水。間隔12h后對LPS+小紅參湯低、中、高劑量組繼予等量小紅參湯灌胃，空白組和模型組繼予等量生理鹽水灌胃。造模24h后取第4對乳腺組織HE染色觀察；選擇Elisa測定大鼠血清中IL-1、IL-6與TNF-α的含量。結(jié)果 模型組乳腺組織損傷嚴(yán)重，血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量升高；實驗組乳腺組織損傷減輕，血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量降低。結(jié)論 彝藥小紅參能減輕大鼠急性乳腺炎癥，降低血清中的炎癥因子。

關(guān)鍵詞：急性乳腺炎；LPS；彝藥小紅參

中圖分類號：R271.44

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-2349（2024）10-0076-05

Mechanism and Study of Yi Medicine Xiao Hongshen on LPS-Induced Mastitis in Rats

DUAN Rong¹， LI Ben-fa¹， CHEN Wan-yi¹， HUANG Min²

（1. Yunnan Hospital of Traditional Chinese Medicine/The First Affiliated Hospital of Yunnan University

of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China;

2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

【Abstract】Objective： To study the effects of the Yi medicine Xiao Hongshen on rat mastitis. Methods： The decoction of Xiao Hongshen was prepared with 30g of Xiao Hongshen. Fifty SD rats were randomly divided into five groups： Group A （control）， Group B （LPS model）， Group C （LPS + low dose Xiao Hongshen decoction， 2.5 mg/kg）， Group D （LPS + medium dose Xiao Hongshen decoction， 5 mg/kg）， and Group E （LPS + high dose Xiao Hongshen decoction， 10 mg/kg）. After separating lactating SD rats from their pups for 1 hour， intragastric administration was initiated. Groups C， D， and E received diluted Xiao Hongshen decoction at concentrations of 0.125， 0.25 and 0.5 mg/mL， respectively， while the control and model group received normal saline. This was administered once daily for 5 days. One hour after the last administration， the LPS-induced mastitis model was created for all groups except the control， which received saline. After 12 hours， groups C， D， and E continued to receive the corresponding doses of Xiao Hongshen decoction， while the control and model groups continued to receive saline. At 24 hours post-modeling， the fourth pair of mammary gland tissues were collected for histological examination using HE staining. ELISA was employed to measure serum levels of IL-1， IL-6， and TNF-α. Results： The model group exhibited severe mammary tissue damage， along with elevated serum levels of IL-1， IL-6， and TNF-α. In contrast， the treatment groups showed reduced tissue damage and lower serum levels of IL-1， IL-6， and TNF-α. Conclusion： Xiao Hongshen， a Yi medicine， can alleviate acute mastitis inflammation in rats and reduce the levels of inflammatory factors in the serum.

【Key words】Acute Mastitis; LPS; Yi medicine Xiao Hongshen

急性乳腺炎屬于急性化膿性感染性疾病，常發(fā)生在哺乳初期，可見于哺乳期每個階段。此疾病在初起期時主要臨床表現(xiàn)為乳房局部腫脹、疼痛，局部皮膚灼熱、發(fā)紅，乳房體積增大，局部變硬，有壓痛或搏動性疼痛，常伴有發(fā)熱、頭痛、身痛、頭暈、乏力等全身癥狀。若失治誤治，易形成膿腫，即為成膿期，此階段需要較長的治療和痊愈時間，嚴(yán)重影響哺乳期女性與嬰兒的健康和生活質(zhì)量，造成一定的疾病負擔(dān)，甚至危及生命。乳汁淤積及感染性致病菌是其病因^［1-2］。目前診療過程中，抗生素在治療急性乳腺炎中取得了良好的療效，但部分患者受多重耐藥及泛耐藥菌株不斷增加困擾，導(dǎo)致臨床治療療效差，反而加重患者病情，已經(jīng)成為目前治療的難題^［3］。

急性乳腺炎中醫(yī)命名為“乳癰”，中醫(yī)藥治療乳癰歷史悠久，經(jīng)驗豐富，集聚個性化強、療效顯著、安全性高、經(jīng)濟等優(yōu)點，患者樂于接受。研究表明，中醫(yī)藥治療目前已成為哺乳期初期乳癰的首選治療方案，越來越受到醫(yī)學(xué)界的認可和患者的信賴^［4］。小紅參為茜草科拉拉藤屬植物，為紫參RubiayunnanensisDiels的干燥根及根莖^［5］，之名首見于蘭茂所著的《滇南本草》^［6］，為云南彝族代表性特色藥物。小紅參歸心、肝、肺經(jīng)，尤擅活血通經(jīng)、祛瘀生新、調(diào)養(yǎng)氣血等^［7］。在民間治療胃腸道疾病、心血管疾病以及外傷、皮膚病等療效顯著^［8］。隨著藥理學(xué)研究的不斷探索，小紅參應(yīng)用更具說服力，已被證明其可調(diào)控TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，具有抗炎功效^［9］。臨床研究表明其還改善心肌缺血、對癌細胞生長有抑制作用、抗氧化、可改善腸道微生物菌群等，現(xiàn)今廣泛應(yīng)用于皮膚病，心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等疾病治療中，并取得良好療效^{［8，10-11］}。但關(guān)于其在急性乳腺炎中的相關(guān)研究鮮有報道。由此，本研究探討小紅參對LPS誘導(dǎo)大鼠乳腺炎的作用機制及研究，以期為臨床治療乳腺炎用藥提供理論證據(jù)及應(yīng)用思路，為小紅參的臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 50只健康雌性SD產(chǎn)后大鼠，月齡均為2～3月，每只體重（250±20）g。購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.2 實驗藥物與試劑 小紅參湯劑的組成是：小紅參30 g。小紅參用清水浸泡0.5～1 h，煎煮2次，第1次0.5 h，第2次0.3 h，將2次煎煮藥液混合后，經(jīng)濃縮、濾出1 g/eae8695a42b265aba5fdbaf258bb8c29mL，冷藏保存，由云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房供應(yīng)，后經(jīng)生理鹽水稀釋后進行給藥。大鼠IL-1β（貨號：ERC007）、大鼠IL-6（貨號：ERC003）和腫瘤壞死因子-α（貨號：ERC102a）選用ElISA試劑盒（廠家：欣博盛生物）。PBS（廠家：賽維爾；貨號：G0002-2L），二甲苯（廠家：西隴化工股份有限公司；貨號：33535），無水乙醇（廠家：成都市科隆化學(xué)品有限公司；貨號：GB/T678-2002），蘇木素（廠家：賽維爾；貨號：G1004-100ML），伊紅染色液（廠家：索萊寶；貨號：G1108），中性樹膠（廠家：賽維爾；貨號：WG10004160），多聚甲醛（廠家：光復(fù)；貨號：CNAB035-Q）。

1.3 實驗儀器 高速低溫離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），-80℃冰箱（海爾集團），4°冰箱（海爾集團），水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），制冰機（常熟市學(xué)科電器有限公司），電子分析天平（天津精科天平廠），隔水式培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），高速離心機（德國Eppendorf公司），Elx800酶標(biāo)儀（自帶電腦），EIx800紫外分光光度計（JINGHCLA），電熱恒溫培養(yǎng)箱（紹興昇輝儀器有限公司），掌上離心機（SCILOGEX），渦旋混勻儀（武漢賽維爾科技有限公司），20ul、200ul、1000ul槍頭（Axygen公司），1.5mL、5mL、50mL離心管（北京蘭杰柯科技有限公司），切片機（廠家：實維儀器；型號：LEICARM2135），倒置顯微鏡（廠家：尼康；型號TS2）。

2 實驗方法

2.1 脂多糖誘導(dǎo)的大鼠乳腺炎模型的建立及藥物干預(yù)^［12］ 將50只SD大鼠隨機分為五組，分別為A（空白對照組）、B（LPS模型組）、C（LPS+2.5mg/kg小紅參湯低劑量組）、D（LPS+5mg/kg小紅參湯中劑量組）、E（LPS+10mg/kg小紅參湯高劑量組）。將分娩伴有乳汁分泌SD大鼠（分娩后5～7d）與仔鼠分隔1h后開始灌胃，LPS+小紅參湯低、中、高劑量組予小紅參湯稀釋液（0.125、0.25、0.5mg/mL）灌胃，給藥劑量按20mL/kg計算；空白對照組和LPS模型組予生理鹽水代替小紅參湯灌胃，每日1次，共5 d。第6d開始造模，第6d末次灌胃1h后取10%水合氯醛麻醉大鼠，選取仰臥位固定大鼠，將第4乳頭充分暴露在體視顯微鏡下，消毒雙乳并剪斷雙乳乳頭尖端（約1mm），向雙乳乳導(dǎo)管灌注LPS溶液，雙乳共計100ul（0.2mg/mL）?？瞻讓φ战M灌注生理鹽水。造模間隔12h后對LPS+小紅參湯低、中、高劑量組繼予等量小紅參湯稀釋液灌胃，空白對照組和LPS模型組繼予等量生理鹽水灌胃。末次給藥12h后處死大鼠，取材送檢。

2.2 制作乳腺組織病理切片 消毒后取第4對乳腺組織，用PBS清洗，4%的多聚甲醛浸泡固定24～48h；后將固定好的組織依次放入70、80、95、100%乙醇濃度的酒精中浸泡脫水，將脫水好的組織二甲苯中浸泡透明后放入石蠟中浸泡滲透，采用石蠟包埋，后按烤片、脫蠟、水化、蘇木素復(fù)染、伊紅染色、脫水、透明流程制作，最后用中性樹膠進行封片。在顯微鏡下放大100、400倍全片掃描，觀察實驗后各組乳腺組織是否有病理學(xué)改變。

2.3 ELISA法檢測血清中IL-6、TNF-α、IL-1β的表達 準(zhǔn)備生物素化抗體工作液，取出試驗板條（已平衡至室溫），空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（100 ul/孔）。每孔加入生物素化抗體工作液（100 ul/孔），后使用微量振蕩器振蕩（室溫22～25℃），轉(zhuǎn)速100 r/min左右，避光振蕩60min。洗板5次后每孔加入酶結(jié)合物工作液（100 ul/孔），使用微量振蕩器振蕩（室溫22～25℃），轉(zhuǎn)速100r/min左右，避光振蕩20 min。再次洗板5次加入顯色底物（TMB）100 ul/孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育15 min。加入反應(yīng)終止液100 ul/孔，混勻后即刻測量OD450值（3 min內(nèi)）。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

本課題研究數(shù)據(jù)采用SPSS29.0建立數(shù)據(jù)庫，進行統(tǒng)計學(xué)分析，描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；組間比較通過ANOVA進行分析，兩兩比較采用最小顯著差異（LSD-t）t檢驗進行。

4 結(jié)果

4.1 小紅參湯劑對乳腺炎大鼠乳腺組織影響 觀察發(fā)現(xiàn)空白對照組中組織結(jié)構(gòu)完好，乳腺小葉及乳腺泡周圍未見明顯漿細胞、炎細胞浸潤，腺泡內(nèi)無分泌物聚集；與空白對照組相比，LPS大鼠乳腺炎模型+小紅參中藥湯劑低劑量組中間質(zhì)纖維組織增生，腺泡內(nèi)分泌物聚集，導(dǎo)管上皮細胞增生，有炎細胞，漿細胞浸潤；與LPS大鼠乳腺炎模型+小紅參中藥湯劑低劑量組相比，LPS大鼠乳腺炎模型+小紅參中藥湯劑中劑量組中腺泡內(nèi)分泌物減少，導(dǎo)管上皮細胞輕度增生，有少量炎癥細胞和漿細胞；與LPS大鼠乳腺炎模型+小紅參中藥湯劑中劑量組相比，LPS大鼠乳腺炎模型+小紅參中藥湯劑高劑量組中腺泡內(nèi)分泌物聚集減少，炎細胞，漿細胞減少。具體見圖1。

4.2 小紅參湯劑對乳腺炎大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的影響 選擇欣博盛ELISA雙抗體夾心法試劑盒檢測IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，用prism軟件 t檢驗單因素進行統(tǒng)計分析。結(jié)果描述：模型組與對照組相比，IL-6、IL-1β、TNF-α的表達升高；LPS 大鼠乳腺炎模型+小紅參中藥湯劑低劑量組（2.5 mg/kg）、LPS 大鼠乳腺炎模型+小紅參中藥湯劑中劑量組（5 mg/kg）、LPS 大鼠乳腺炎模型+小紅參中藥湯劑高劑量組（10 mg/kg）與模型組相比，IL-6、IL-1β、TNF-α的表達降低。具體見圖2，表1。

5 討論

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細菌（E.coli）外膜的重要組分，是重要的致病力因素，其入侵宿主后可引發(fā)劇烈的炎性反應(yīng)。LPS誘導(dǎo)大鼠乳腺炎模型與臨床上常見的乳腺炎相似，為探討乳腺炎發(fā)病機制和篩選治療藥物提供依據(jù)。為此，筆者擬采用 LPS誘導(dǎo)的大鼠乳腺炎模型，研究小紅參湯劑對急性乳腺炎的治療效果及機理^［13］。前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠乳腺組織內(nèi)有較多的炎癥細胞，如中性粒細胞等，與急性乳腺炎的臨床表現(xiàn)相一致^［14-15］，表明該動物模型已建立成功。通過LPS刺激，乳腺上皮細胞（BMEC）觸發(fā)炎癥反應(yīng)，釋放促炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α，這些細胞因子通過自我激活和影響鄰近細胞的方式，加劇了炎癥的進程。在醫(yī)療實踐中，檢測IL-6、IL-1β、TNF-α促炎性細胞因子的水平變化，是評估乳腺炎癥狀態(tài)嚴(yán)重性的一個重要手段^［16］。研究表明，通過抑制炎癥相關(guān)細胞因子，如白介素-1（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的生成，可以有效減輕乳腺炎癥的不良后果^［17］。在本次研究中，應(yīng)用小紅參湯進行干預(yù)后，觀察到血清中的促炎細胞因子水平（IL-6、IL-1β、TNF-α）有所下降，經(jīng)檢驗，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義，存在差異，且表明在小紅參湯高劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α促炎細胞因子改善最佳。同時，通過病理學(xué)檢查觀察到炎癥病變逐漸緩解，乳腺炎癥狀況得到改善，尤其在較高劑量下效果更為顯著，腺泡內(nèi)分泌物多少、導(dǎo)管上皮細胞增生程度，炎細胞，漿細胞浸潤情況與小紅參湯低、中、高劑量干預(yù)成負相關(guān)，小紅參在改善脂多糖誘導(dǎo)大鼠的乳腺組織病理損傷中發(fā)揮了重要作用。這表明小紅參可以通過降低IL-6、IL-1β、TNF-α的生成，發(fā)揮其抗炎作用，可以在臨床中推廣使用。

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（收稿日期：2024-04-15）