熱應(yīng)激對從江香豬十二指腸黏膜結(jié)構(gòu)、HIF-1及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

摘 要： 旨在研究熱應(yīng)激（heat stress， HS）對從江香豬十二指腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)的影響，同時跟蹤檢測低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1）的表達(dá)特征及調(diào)控機(jī)制。試驗選取24頭育肥期從江香豬，隨機(jī)分為6組，除對照組（Con），其余5組進(jìn)行不同時間熱應(yīng)激處理（6、12、24、48、72 h），試驗過程中檢測從江香豬直腸溫度和呼吸頻率，試驗結(jié)束時采集各組從江香豬十二指腸。蘇木精-伊紅染色（HE）和阿利新藍(lán)-過碘酸雪夫反應(yīng)（AB-PAS）觀察各組十二指腸組織結(jié)構(gòu)和杯狀細(xì)胞數(shù)量變化；TUNEL染色檢測十二指腸細(xì)胞凋亡率；實時熒光定量（qRT-PCR）、蛋白免疫印跡（Western blot）和免疫組織化學(xué)分別檢測緊密連接相關(guān)蛋白、HIF-1及其上游調(diào)控因子HSP90和PHD-2的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，熱應(yīng)激可使從江香豬直腸溫度和呼吸頻率明顯升高，腸絨毛高度下降，隱窩深度增加，絨腺比降低，閉合蛋白（Occludin）和緊密連接蛋白1（ZO-1）表達(dá)水平呈時間依賴性下降，杯狀細(xì)胞數(shù)量增多。TUNEL檢測結(jié)果顯示，HS處理72 h后，十二指腸上皮細(xì)胞凋亡率顯著上升（Plt;0.001）。免疫組織化學(xué)、qRT-PCR和Western blot對HIF-1α、HSP90和PHD-2的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，相較于對照組，HS處理72 h后十二指腸黏膜上皮HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)量隨HS時間延長而增加；HSP90陽性細(xì)胞在對照組和熱應(yīng)激組中均集中于黏膜上皮，其表達(dá)趨勢與HIF-1α一致；PHD-2表達(dá)特征與HSP90相反，其表達(dá)強(qiáng)度在HS組中明顯減弱，且隨HS時間增加，PHD-2 mRNA和蛋白水平均呈時間依賴性下降。以上結(jié)果說明，HS可引起十二指腸上皮細(xì)胞凋亡，損傷十二指腸黏膜屏障；HIF-1的表達(dá)升高與十二指腸細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，且可能同時受HSP90和PHD-2調(diào)控。

關(guān)鍵詞： 熱應(yīng)激；從江香豬；腸黏膜屏障；低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）；表達(dá)調(diào)控

中圖分類號：S828.89

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4690-10

收稿日期：2023-11-07

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金（32102630）；貴州大學(xué)博士基金（［2020］65號）；貴州大學(xué)實驗室開放項目SYSKF2024-29

作者簡介：劉勇慶（1998-），男，山東濰坊人，碩士，主要從事動物熱應(yīng)激相關(guān)研究，E-mail：2231514747@qq.com

*通信作者：李 慧，主要從事動物熱應(yīng)激相關(guān)研究，E-mail：hli23@gzu.edu.cn

Effects of Heat Stress on Duodenal Mucosal Structure， HIF-1 and Its Related Protein

Expression in Congjiang Xiang Pigs

LIU" Yongqing， ZHANG" Gang， XIONG" Yanling， SUN" Zhongxin， GAO" Fan， LIU" Ting， LI" Hui*

（College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang 550025，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the effects of heat stress （HS） on the duodenal mucosal barrier structure and the character of hypoxia inducible factor 1 （HIF-1） expression and regulation in Congjiang Xiang pigs. Twenty-four fattening pigs were divided into 6 groups randomly， the control group （Con） kept under normal conditions， and the other 5 groups were treated with heat stress for 6， 12， 24， 48， 72 h）， respectively. Rectal temperature and respiratory rate were measured during treatment， and the duodenum of each group was collected at the end of the experiment. The change of duodenal tissue structure and goblet cell number in each group were observed with hematoxylin-eosin staining （HE） and alcian blue-periodate Schiff reaction （AB-PAS）. The apoptosis cell of duodenal was detected by TUNEL staining. Real-time fluorescence quantification （qRT-PCR）， Western blot and immunohistochemistry were used to detect the expression changes of tight junction related proteins， HIF-1 and its upstream regulatory factors respectively. The results showed that， compared with the control group， HS could induce rectal temperature and respiratory rate increase， and the villus height kept decreasing with extension of HS time， while the crypt depth increased synchronously， the ratio of villus height/gland depth and the expression of Occludin and ZO-1 decreased significantly. On the contrary， the number of goblet cells kept increasing. TUNEL showed the apoptosis rate of group HS 72 h was significantly higher than that of control group （Plt;0.001）.The positive expression of HIF-1α was mainly observed in small intestinal epithelial cells， and which expression enhanced at HS 72 h， the trend was as same as which HIF-1α mRNA and protein expression. The character of HSP90 expression were basically consistent with HIF-1α while the profile of PHD-2 was obviously the opposite. These results indicated that HS could induce apoptosis of small intestinal epithelial cells and damage duodenal mucosal barrier. The increase of HIF-1 expression is closely related to the apoptosis of small intestine cells， and may be regulated by both HSP90 and PHD-2.

Key words： heat stress; Congjiang Xiang pig; intestinal mucosal barrier; hypoxia inducible factor 1（HIF-1）; expression regulation

*Corresponding author： LI Hui，E-mail：hli23@gzu.edu.cn

熱應(yīng)激是動物受到超過自身體溫調(diào)節(jié)能力的高溫刺激時產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)［1］?？蓪?dǎo)致動物免疫力下降，疾病頻發(fā)，家禽家畜中以雞、豬和牛對溫度最為敏感［2］。豬因皮下脂肪厚，汗腺不發(fā)達(dá)等生理特點(diǎn)，極易出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)，溫度高于25℃ 即可引起母豬妊娠率下降，仔豬死亡率升高，育肥豬各類疾病頻發(fā)，經(jīng)濟(jì)損失巨大［3-4］。腸道對熱應(yīng)激極為敏感，在高溫下，機(jī)體為調(diào)節(jié)溫度表現(xiàn)為體表血流量增加，內(nèi)臟血流量減少，導(dǎo)致腸道出現(xiàn)病理性缺氧，不僅影響營養(yǎng)吸收，還可引發(fā)局部或全身炎癥反應(yīng)［5］。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor， HIF）是真核細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，由低氧調(diào)節(jié)的α亞基（HIF-α）和對氧不敏感的β亞基（HIF-β）組成，根據(jù)α亞基的不同，將已發(fā)現(xiàn)的3種HIF分別命名為HIF-1，HIF-2和HIF-3［6-7］。HIF-1在機(jī)體中分布極為廣泛，可靶向調(diào)控多個低氧基因的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)、無氧代謝、細(xì)胞凋亡、線粒體代謝和細(xì)胞增殖等方面都發(fā)揮著重要的作用［8］。研究顯示，熱休克蛋白90（heat shock protein 90， HSP90）和脯氨酸羥化酶-2（prolyl-4-hydroxylases-2， PHD-2）是HIF-1非氧依賴調(diào)控和氧依賴調(diào)控中的代表性因子，二者可通過不同途徑調(diào)節(jié)HIF-1的表達(dá)［9］。但目前為止，有關(guān)熱應(yīng)激下HIF-1表達(dá)特征的研究極少，其調(diào)控機(jī)制和作用還未見報道。

本試驗通過調(diào)控環(huán)境溫濕度，構(gòu)建從江香豬熱應(yīng)激模型，研究熱應(yīng)激對十二指腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)的影響，同時跟蹤觀察HIF-1的表達(dá)特征，通過對HSP90和PHD-2表達(dá)的檢測，初探熱應(yīng)激下十二指腸HIF-1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物分組

從貴州大學(xué)豬場試驗基地選取24頭（雌雄各半）3月齡健康從江香豬，平均體重（15±2）kg。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為6組，1組設(shè)為對照組（Con），其余5組設(shè)為熱應(yīng)激組（HS）。調(diào)控環(huán)境溫濕度［10］，使對照組環(huán)境溫濕度指數(shù)（temperature-humidity index， THI）≤74，處于舒適區(qū)，熱應(yīng)激組78lt;THI≤84處于中度熱應(yīng)激狀態(tài)，并進(jìn)行不同時間熱應(yīng)激處理（6、12、24、48、72 h）。試驗豬自由采食飲水，在固定時間（熱應(yīng)激處理后6、12、24、48、72 h）測量直腸溫度，同時根據(jù)豬胸、腹部每分鐘起伏次數(shù)，統(tǒng)計呼吸頻率。

THI=（1.8×T+32）-0.55×RH100×［（1.8×T+32）-58］

其中，T代表環(huán)境溫度，RH代表環(huán)境相對濕度。

1.1.2 樣品采集

試驗豬在不同時間熱應(yīng)激處理結(jié)束后（6、12、24、48、72 h），前腔靜脈采血，置于抗凝采血管中，而后進(jìn)行安樂死；對照組與熱應(yīng)激處理72 h組同時處死。剖腹取出十二指腸，組織學(xué)檢測樣品快速放入4%多聚甲醛中固定，分子學(xué)檢測樣品剪碎后置于液氮速凍，而后轉(zhuǎn)移至-80℃保存。

1.1.3 主要試劑

4%多聚甲醛溶液（廣東西隴科學(xué)股份有限公司）、HE染色試劑盒、AB-PAS染色試劑盒、TRIzol、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）；BCA微量蛋白定量試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；β-actin一抗（全式金公司）；HSP90一抗、PHD-2一抗、Occludin一抗、ZO-1一抗（武漢三鷹）山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗（Abcam）；HIF-1α一抗（Abcam）；即用型免疫組化SP（鼠/兔）（福州邁新生物科技有限公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析試劑。

1.2 方法

1.2.1 腸絨毛高度及隱窩深度的測量

固定于4%多聚甲醛溶液的十二指腸組織，取出后流水緩慢沖洗，常規(guī)方法制作連續(xù)石蠟切片，隔十取一進(jìn)行HE染色。光鏡下測量切片中完整腸絨毛高度和隱窩深度，每張切片統(tǒng)計視野不少于5個，統(tǒng)計切片不少于10張，而后進(jìn)行分析。

1.2.2 AB-PAS染色和杯狀細(xì)胞計數(shù)

連續(xù)石蠟切片，隔十取一脫蠟至水，而后按照試劑盒說明書進(jìn)行染色。光鏡下觀察統(tǒng)計杯狀細(xì)胞的數(shù)量。每張切片統(tǒng)計視野不少于5個，統(tǒng)計切片不少于10張，而后進(jìn)行分析。

1.2.3 TUNEL染色

按照試劑盒操作步驟，石蠟切片脫蠟至水，滴加蛋白酶K工作液，PBS清洗后滴加TUNEL反應(yīng)液，再次清洗，而后在樣本上加入DAPI染液，避光孵育后PBS清洗，封片，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。

1.2.4 免疫組織化學(xué)

石蠟切片脫蠟至水，使用檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）在微波爐中加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。按照SP免疫組化試劑盒操作要求，分別滴加anti-HSP90（1∶400）、anti-HIF-1α（1∶300）和anti-PHD-2（1∶300）抗體，4℃過夜孵育，清洗后加入相應(yīng)二抗，而后進(jìn)行DAB顯色和蘇木精復(fù)染，分化、返藍(lán)、脫水、透明后封片。試驗同時設(shè)置陰性對照，一抗用PBS代替，其余步驟與試驗組一致。

1.2.5 實時熒光定量PCR

使用TRIzol提取組織總RNA，而后按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。利用premer 6.0，根據(jù)NCBI GenBank中豬HSP90、HIF-1α、PHD-2 mRNA序列，設(shè)計相對應(yīng)的引物。

1.2.6 Western blot

研缽中加入液氮，放入冷凍的十二指腸組織進(jìn)行充分研磨，成粉后轉(zhuǎn)移至離心管。離心管中加入含有抑制蛋白降解的蛋白裂解液，靜置離心后收集上清。采用BCA法測定總蛋白濃度，并將對照組與試驗組的總蛋白濃度調(diào)為一致。而后按比值加入4×蛋白上樣緩沖液，100℃變性10 min。使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，加入anti-β-actin（1∶10 000）、anti-HSP90（1∶5 000）、anti-HIF-1α（1∶500）和anti-PHD-2（1∶8 000），4℃過夜，TBST洗滌后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育，再次清洗后滴加ECL發(fā)光液，進(jìn)行成像分析。用Image Pro Plus 6.0對條帶進(jìn)行光密度分析。

1.2.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單因素方差分析后再進(jìn)行LSD多重比較。與對照組相比，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，統(tǒng)計顯著性定義為：*. Plt;0.05；**. Plt;0.01；***. P＜0.001；ns. 差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 熱應(yīng)激對腸絨毛結(jié)構(gòu)及細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

試驗首先就對照組和不同時間熱應(yīng)激處理組直腸溫度和呼吸頻率進(jìn)行測量觀察，結(jié)果顯示，與對照組相比，熱應(yīng)激6 h即出現(xiàn)直腸溫度和呼吸頻率的顯著升高，而后基本保持不變（圖1a、1b）。HE染色結(jié)果顯示，對照組十二指腸吸收細(xì)胞排列緊密，界限清晰，少量杯狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞嵌于吸收細(xì)胞之間，基膜完整（圖1c）。熱應(yīng)激處理6～12 h時，腸絨毛結(jié)構(gòu)未見明顯變化（圖1d、1e），但24 h時，吸收細(xì)胞間界限不清，胞質(zhì)著色變淺，基膜不完整或消失（圖1f），隨著熱應(yīng)激時間的延長，至72 h時，大量吸收細(xì)胞胞核消失，黏膜上皮脫落，固有層毛細(xì)血管充血（圖1g、1h）。對腸絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行統(tǒng)計分析，可見熱應(yīng)激下腸絨毛高度下降，隱窩深度增加，絨腺比下降（圖1i、1k）。

對各組十二指腸緊密連接相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測，可見Occludin表達(dá)量在熱應(yīng)激6 h時即出現(xiàn)明顯下降（Plt;0.01），而后呈時間依賴性降低，ZO-1表達(dá)量的變化更為顯著，從6 h時即出現(xiàn)極顯著的下降（Plt;0.001，圖2a～2c）。

2.2 熱應(yīng)激對十二指腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

試驗使用AB-PAS染色來顯示杯狀細(xì)胞，結(jié)果可見，對照組腸黏膜中有少量嵌于吸收細(xì)胞之間的藍(lán)色杯狀細(xì)胞（圖3a）。熱應(yīng)激至72 h時，杯狀數(shù)量顯著增多（圖3b～3f）。對各組杯狀細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，熱應(yīng)激6h時，腸隱窩處的杯狀細(xì)胞開始增多（P＜0.01），而后呈現(xiàn)持續(xù)增多的趨勢（圖3g）。

2.3 熱應(yīng)激對十二指腸細(xì)胞凋亡的影響

試驗使用TUNEL染色對十二指腸凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，對照組腸絨毛頂端的小腸上皮細(xì)胞可見零星凋亡細(xì)胞，熱應(yīng)激處理72 h后，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且基本為小腸上皮細(xì)胞（圖4a）。使用image pro plus軟件對凋亡細(xì)胞進(jìn)行分析，對照組與試驗組凋亡率差異極顯著（P＜0.001，圖4b）。

2.4 熱應(yīng)激下HIF-1α、HSP90和PHD-2的表達(dá)定位

免疫組化結(jié)果顯示，對照組HIF-1α表達(dá)范圍較廣，但表達(dá)強(qiáng)度較弱，十二指腸上皮細(xì)胞和隱窩細(xì)胞均為陽性細(xì)胞。熱應(yīng)激處理72 h后，HIF-1α在十二指腸上皮細(xì)胞和隱窩細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（圖5a、5b、5j）。HSP90的表達(dá)特征與HIF-1α基本一致（圖5d、5e、5k）。對照組PHD-2陽性細(xì)胞主要位于十二指腸上皮細(xì)胞，但熱應(yīng)激處理72h后，細(xì)胞中PHD-2的表達(dá)強(qiáng)度明顯下降（圖5g、5h、5l）。

2.5 熱應(yīng)激對HIF-1α、HSP90和PHD-2表達(dá)量的影響

試驗對各組HIF-1α、HSP90和PHD-2的表達(dá)量進(jìn)行檢測，qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，HIF-1α mRNA表達(dá)量在熱應(yīng)激處理24h后顯著增加，72h時表達(dá)量最高（圖6a）。HSP90 mRNA表達(dá)趨勢與HIF-1α一致，但其對熱應(yīng)激刺激更為敏感，在6h時即出現(xiàn)明顯升高（圖6b）。PHD-2 mRNA的表達(dá)趨勢與HIF-1α和HSP90相反，其表達(dá)量呈顯著的時間依賴性下降（圖6c）。Western blot結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果基本一致，隨著熱應(yīng)激時間的延長，HIF-1α和HSP90的表達(dá)量均顯著上升，而PHD-2的表達(dá)量顯著下降（圖6d～6g）。

3 討 論

3.1 熱應(yīng)激引起的病理變化

急性熱應(yīng)激一般指3 d以內(nèi)持續(xù)高溫下機(jī)體產(chǎn)生的非特異性防御反應(yīng)［11］。隨著極端高溫和厄爾尼諾現(xiàn)象的不斷出現(xiàn)，急性熱應(yīng)激對集約化養(yǎng)殖造成的影響越來越大［12］。腸道和肝作為熱應(yīng)激下受損最早和最嚴(yán)重的器官，越來越受到學(xué)者關(guān)注［13］。研究顯示，熱應(yīng)激下腸黏膜受損引起的通透性增加，是導(dǎo)致機(jī)體系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙等多種疾病的主要原因［14］；腸道負(fù)責(zé)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，也是重要的防御屏障［15］。腸黏膜由黏膜上皮、固有層和黏膜肌層組成，其中，黏膜上皮的小腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成腸黏膜物理屏障，杯狀細(xì)胞及其分泌物形成腸黏膜化學(xué)屏障，二者與微生物形成的生物屏障、免疫細(xì)胞構(gòu)成的免疫屏障共同組成機(jī)體最大的先天性免疫屏障——腸黏膜屏障，在動物生長過程中能有效抵御有害微生物、毒素等物質(zhì)的入侵。

本研究對熱應(yīng)激下十二指腸腸黏膜結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行跟蹤觀察，結(jié)果顯示，急性熱應(yīng)激24 h即可造成腸黏膜上皮脫落，絨腺比降低，杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，黏膜屏障損傷，且隨著熱應(yīng)激時間的延長，受損程度加劇。這一結(jié)果與Yu等［16］和熊云霞等［5］的研究一致，但和Pearce等［17］的結(jié)果略有不同，究其原因，可能與熱應(yīng)激時間有關(guān)，Pearce等［17］的研究截止于熱應(yīng)激處理后6 h，故部分組織的結(jié)構(gòu)還未出現(xiàn)變化。

3.2 熱應(yīng)激對腸道黏膜屏障的影響

本研究同時對細(xì)胞間緊密連接進(jìn)行研究，結(jié)果顯示參與緊密連接結(jié)構(gòu)形成的蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)量同步下降，這一結(jié)果與許笑［18］和任書男［19］的結(jié)果一致，即腸黏膜的損傷總是伴隨Occludin和ZO-1同步下降，但與劉帥［20］的研究不同。Occludin作為一種跨膜蛋白，相鄰細(xì)胞間Occludin的胞外環(huán)相互作用，形成細(xì)胞間隙，可以選擇性調(diào)節(jié)細(xì)胞旁路的通透性，而其C-結(jié)構(gòu)域和ZO的PDZ結(jié)構(gòu)域互相作用，與胞內(nèi)膜的肌動蛋白骨架相連［21］。二者與封閉蛋白和連接黏附分子共同形成相鄰上皮側(cè)面的緊密連接，阻止管腔內(nèi)物質(zhì)自由進(jìn)出。

3.3 熱應(yīng)激對小腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

高溫和低氧均可引起細(xì)胞凋亡，作為機(jī)體高度進(jìn)化后基因調(diào)控的細(xì)胞過程，可清除細(xì)胞而不產(chǎn)生有害物質(zhì)［22］。熱應(yīng)激不僅引起腸道溫度升高，同時伴隨病理性低氧，因此本研究同步對熱應(yīng)激下十二指腸細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞缺氧反應(yīng)主要調(diào)節(jié)因子HIF-1的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，熱應(yīng)激72 h時，細(xì)胞凋亡率顯著上升，且凋亡細(xì)胞基本為小腸上皮細(xì)胞，HIF-1α表達(dá)的時間和位點(diǎn)與凋亡細(xì)胞有時空同步性，這一結(jié)果與Chen等［23］和Varasteh等［24］的研究結(jié)果一致，暗示HIF-1與熱應(yīng)激下小腸上皮細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。HIF-1作為機(jī)體低氧適應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子，在凋亡中發(fā)揮多種作用，其既可能通過增加自噬減緩凋亡［25］，也可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，死亡受體和線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡［26-27］，目前，其在熱應(yīng)激下對小腸上皮凋亡的作用有待進(jìn)一步研究。

3.4 HIF-1及其相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控

隨著對HIF-1研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)其生成調(diào)控極為復(fù)雜，可通過磷酸化、羥基化、乙?；榷喾N途徑調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性和穩(wěn)定性［28］。PHD-2是HIF-1氧依賴途徑核心調(diào)控因子，常氧條件下，可羥基化HIF-1α ODDD區(qū)域中特殊的脯氨酸殘基，導(dǎo)致HIF-1α通過泛素化途徑降解，低氧條件下，降解途徑打斷，HIF-1α入核與HIF-1β結(jié)合，進(jìn)而激活多個低氧適應(yīng)性因子的表達(dá)［7］。與此同時，HIF-1α還受多種生長因子和HSP90的調(diào)控，作為一種分子伴侶，HSP90可引起HIF-1α的構(gòu)象變化，與RACK1競爭性結(jié)合-1α從而保護(hù)HIF免受蛋白酶體降解［29］。本研究顯示，熱應(yīng)激下PHD-2的表達(dá)呈時間依賴性下降，而HSP90的表達(dá)與之正好相反，這一結(jié)果提示，熱應(yīng)激下，HIF-1的表達(dá)可能同時受到PHD-2和HSP90的調(diào)控。

4 結(jié) 論

本研究對急性熱應(yīng)激下十二指腸腸黏膜的結(jié)構(gòu)變化和HIF-1的表達(dá)調(diào)控特征進(jìn)行跟蹤觀察，結(jié)果顯示急性熱應(yīng)激可使腸絨毛高度下降，絨腺比降低，緊密連接蛋白表達(dá)量下降，破壞十二指腸黏膜物理屏障和化學(xué)屏障，使腸黏膜通透性增加；與此同時，熱應(yīng)激下HIF-1的表達(dá)量呈時間依賴性上升，其表達(dá)時間和位點(diǎn)與凋亡的腸上皮細(xì)胞具有時空同步性，這表明HIF-1與腸上皮的凋亡有密切的關(guān)系，且HIF-1的表達(dá)可能同時受到HSP90和PHD-2的調(diào)控。

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（編輯 范子娟）