穩(wěn)定表達(dá)豬 BRD4-BD1/2 蛋白的豬肺泡巨噬細(xì)胞傳代細(xì)胞系的構(gòu)建及其用于 ASFV 增殖的效果觀察

摘 要： 前期研究發(fā)現(xiàn)宿主表觀遺傳調(diào)控蛋白——含溴結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)4（bromodomain-containing protein 4， BRD4）有助于非洲豬瘟病毒 （African swine fever virus， ASFV） 的復(fù)制，為了深入研究 BRD4 對 ASFV 復(fù)制的影響，通過篩選出顯著促進(jìn) ASFV 復(fù)制的 BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域，利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的 3D4/21 細(xì)胞系，分析 ASFV 在 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系與 WT 細(xì)胞系之間的復(fù)制差異。首先，以家豬基因 BRD4-BD1/2 為靶標(biāo)，構(gòu)建了含有 3x Flag 標(biāo)簽的重組質(zhì)粒 pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2，并將其與質(zhì)粒 pMD2.G 和 pSPAX2 共同轉(zhuǎn)染至 HEK-293T 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，獲得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染 3D4/21 細(xì)胞后通過嘌呤霉素藥物篩選，成功獲得了穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的 3D4/21 細(xì)胞系。利用 RT-qPCR 和 Western blot 技術(shù)分別檢測了 ASFV 感染 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞后 CP204L 和 B602L 基因的轉(zhuǎn)錄水平以及相應(yīng)蛋白表達(dá)水平，并通過 HAD50 測定評價(jià) ASFV 的復(fù)制能力。研究結(jié)果表明：成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的 3D4/21 細(xì)胞系。與 3D4/21-WT 細(xì)胞系相比，BRD4-BD1/2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系能夠顯著促進(jìn) ASFV 復(fù)制。本研究提供了深入研究 BRD4 蛋白在 ASFV 復(fù)制中功能的生物材料，并為 ASFV 疫苗候選株的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 非洲豬瘟病毒；BRD4；BD1/2；3D4/21 細(xì)胞；穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系

中圖分類號：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4646-14

收稿日期：2023-11-29

基金項(xiàng)目：國家自然基金面上項(xiàng)目（32072830）; 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1800101）;甘肅省重大專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（22ZD6NA001）; 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（CAAS-ZDRW202409）; 甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項(xiàng)目（22JR5RA024）和特派團(tuán)項(xiàng)目（22CX8NA011）; 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2021-LVRI）

作者簡介：吳夢麗（1999-），女，河南鄭州人，碩士，主要從事動物病毒學(xué)研究， E-mail：15238649312@163.com

*通信作者：牛慶麗，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail： niuqingli@caas.cn

Construction of a Passaged Porcine Alveolar Macrophage Cell Line Stably Expressing the

Porcine BRD4-BD1/2 Protein and Its Effects on ASFV Proliferation

WU Mengli1，2， SUN" Hualin1，2， YANG" Jifei1，2， ZHAO" Yaru1，2， GUAN" Guiquan1，2， YIN" Hong1，2， 3，

NIU" Qingli1，2*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， College of Veterinary Medicine，

Lanzhou University， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou" 730000，" China;

2.African Swine Fever Regional Laboratory of China （Lanzhou）

， Gansu Province Research Center for Basic Disciplines of Pathogen Biology， Lanzhou" 730046，

China;

3.Jiangsu Co-Innovation Center for the Prevention and Control of Important Animal Infectious

Disease and Zoonosis， Yangzhou University， Yangzhou" 225009，" China）

Abstract：" Previous studies have identified that the host epigenetic regulator， bromodomain-containing protein 4 （BRD4） facilitates the replication of the African swine fever virus （ASFV）. To further investigate the impact of BRD4 on ASFV replication， the BRD4-BD1/2 domain， which significantly enhances ASFV replication， was identified. Using a lentiviral expression system， a stably expressing 3D4/21 cell line of the BRD4-BD1/2 domain was successfully constructed to analyze replication differences between the 3D4/21-BRD4-BD1/2 cell line and the wild-type （WT） cell line. Initially， a recombinant plasmid， pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2， targeting the porcine gene BRD4-BD1/2 and containing a 3x Flag tag， was constructed. This plasmid， along with plasmids pMD2.G and pSPAX2， was transfected into HEK-293T cells for lentiviral packaging to obtain infectious lentiviruses. Following lentiviral infection of 3D4/21 cells and selection with puromycin， a cell line stably expressing the BRD4-BD1/2 domain was established. The transcription levels of ASFV genes CP204L and B602L， and the expression levels of their corresponding proteins in ASFV-infected 3D4/21-BRD4-/BD1/2 cells， were detected using RT-qPCR and Western blot techniques， respectively. ASFV replication capacity was assessed using the HAD50 assay. The results showed that the stably expressing BRD4-BD1/2 domain in the 3D4/21 cell line significantly enhanced ASFV replication compared to the 3D4/21-WT cell line. This study provides biological material for in-depth research on the function of the BRD4 protein in ASFV replication and lays a theoretical foundation for the development of ASFV vaccine candidates.

Key words： African swine fever virus; BRD4; BD1/2; 3D4/21 cells; stable expression cell lines

*Corresponding author：" NIU Qingli， E-mail： niuqingli@caas.cn

非洲豬瘟 （African swine fever） 是一種能引起豬嚴(yán)重高熱的出血性疾病，病原為非洲豬瘟病毒 （African swine fever virus， ASFV）［1］。ASF 的臨床癥狀根據(jù)感染病毒毒株的毒力可以分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。一般潛伏期約為 15 d，而重癥感染的個體可能在感染后 2～10 d 內(nèi)死亡［2-3］。ASF 能夠感染家豬和野豬，致死率可達(dá) 100%，對全球豬業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響［4-5］。

ASFV 是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是一種復(fù)雜的大型二十面體雙鏈 DNA 病毒。其結(jié)構(gòu)包括病毒基因組、內(nèi)核、內(nèi)膜、衣殼和囊膜［6］。病毒復(fù)制主要發(fā)生在宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，涉及四個不同的轉(zhuǎn)錄階段，包括即刻早期、早期、中期和晚期［7］。感染的主要細(xì)胞類型包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，它們通過吞噬作用和抗原呈遞等機(jī)制在免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8-9］。

盡管原代肺泡巨噬細(xì)胞 （pulmonary alveolar macrophage，PAMs） 是目前用于研究 ASFV 感染機(jī)制和病毒復(fù)制動力學(xué)的首選細(xì)胞，但受個體差異限制以及其缺乏商業(yè)化性能，使其在某些情況下不夠理想。3D4/21 （ATCC CRL-2843）細(xì)胞是用 pSV3neo 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物后，建立了豬單髓細(xì)胞系3D4，通過 G-418 篩選建立。盡管其感染后病毒復(fù)制能力有限，但其作為一種宿主源性的體外連續(xù)傳代細(xì)胞系，可用于病毒感染后的免疫反應(yīng)和病毒與宿主之間相互作用的機(jī)制研究［10］。

含溴結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)4（bromodomain-containing protein 4， BRD4） 作為一種關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在多個生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期控制、癌癥和病毒感染等［11-12］。BRD4 包括兩個高度保守的 N 端溴結(jié)構(gòu)域（BD1和BD2），可識別組蛋白和非組蛋白上的乙酰賴氨酸殘基，同時還包含一個參與蛋白質(zhì)互作的 ET 結(jié)構(gòu)域。研究表明，BRD4 在人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、人乳頭瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）、單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）等多種病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13-15］。Wang等［16］還發(fā)現(xiàn)通過抑制 BRD4 蛋白的表達(dá)，可以激活 DNA 損傷相關(guān)的 cGAS-STING 通路，從而激發(fā)抗病毒天然免疫反應(yīng)。

BRD4 是 BET 家族中的一種關(guān)鍵蛋白質(zhì)，由兩個溴結(jié)構(gòu)域（BD1 和 BD2）和一個額外的末端域（ET）組成。它的兩個溴結(jié)構(gòu)域（BD1 和 BD2）對于 BRD4 發(fā)揮功能至關(guān)重要，通過識別并結(jié)合到乙?；M蛋白和一系列非組蛋白質(zhì)上，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，ET 結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。BD1 通常與基因轉(zhuǎn)錄的啟動和激活相關(guān)，而 BD2 則在轉(zhuǎn)錄延伸和后續(xù)步驟中發(fā)揮作用，這種功能上的差異反映了 BRD4 在基因表達(dá)調(diào)控中的復(fù)雜性和多樣性［17］。為了深入研究 ASFV 感染過程中 BRD4 不同結(jié)構(gòu)域的作用，分別構(gòu)建了帶有 3x Flag 標(biāo)簽的 BRD4 全長、 BD1/2 結(jié)構(gòu)域以及 BD1 截短體質(zhì)粒。通過 Western blot 在蛋白水平上檢測 BRD4、BD1/2、BD1 對 ASFV 復(fù)制的影響，結(jié)果表明 BRD4-BD1/2 對 ASFV 復(fù)制具有明顯的促進(jìn)作用。

鑒于 BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的重要性，作者進(jìn)一步應(yīng)用慢病毒包裝技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 的 3D4/21 細(xì)胞系。慢病毒 （lentivirus）包裝系統(tǒng)構(gòu)建是將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，以實(shí)現(xiàn)外源基因長期穩(wěn)定表達(dá)的方法。這一技術(shù)廣泛應(yīng)用于研究特定蛋白或病毒功能，例如，ASFV-E165R 蛋白在 PK-15 細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)［18］；ASFV-D1133L 蛋白在 MA-104 細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)［19］；宿主 HDAC6 蛋白在 Vero 細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)等［20］。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域可顯著促進(jìn) ASFV 的復(fù)制，證明了 BRD4-BD1/2 在 ASFV 復(fù)制中的重要性。總而言之，作者利用慢病毒包裝技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的 3D4/21 細(xì)胞系，并驗(yàn)證了其對 ASFV 復(fù)制的促進(jìn)作用。這為進(jìn)一步研究 BRD4 在 ASFV 感染中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)，同時為病毒增殖和疫苗生產(chǎn)提供了生物學(xué)材料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒

豬肺泡巨噬細(xì)胞（3D4/21）和人胚胎腎細(xì)胞 （HEK-293T）由本實(shí)驗(yàn)室保存。慢病毒包裝質(zhì)粒 pLVX-IRES-Puro、pMD2.G 和 pSPAX2 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。ASFV 基因 II 型強(qiáng)毒株 ASFV CN/GS/2018，ASFV 綠色熒光蛋白表達(dá)株 （ASFV-EGFP） 是以 ASFV CN/GS/2018 的親本株構(gòu)建了僅插入 EGFP-Tag 的重組病毒，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室（蘭州）構(gòu)建并保存。

1.2 試劑和抗體

胎牛血清 （FBS）、0.25% EDTA-Trypsin、嘌呤霉素、RPMI 1640 培養(yǎng)基和高糖 DMEM 培養(yǎng)基、RIPA 裂解液均購于 Thermo Scientific 公司。青霉素-鏈霉素-兩性霉素（三抗）購于北京索萊寶公司。限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和 BamHⅠ、DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶均購于 NEB 公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 TaKaRa 公司。膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自南京諾唯贊公司。Cell Counting Kit-8 （CCK8） 購自 APExBIO Technology LLC 公司。小鼠抗 β-actin 單克隆抗體、小鼠抗 Flag 單克隆抗體和山羊抗小鼠IgG抗體購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。小鼠抗 ASFV-p30 單克隆抗體，小鼠抗 ASFV-p72 單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3 篩選影響ASFV增殖的BRD4結(jié)構(gòu)域

分別構(gòu)建帶有 3x Flag 標(biāo)簽的 BRD4 全長、BD1/2 結(jié)構(gòu)域以及 BD1 截短體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至 3D4/21 細(xì)胞，隨后將細(xì)胞置于 37 ℃ 含 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，用含 2% FBS的 RPMI 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，感染 ASFV 24 hpi 后，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行 Western blot 分析，以評估過表達(dá) BRD4 全長及截短體對 ASFV 復(fù)制的影響。

1.4 引物設(shè)計(jì)和質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫中 Sus scrofa BRD4 基因序列（ID： 100533540），設(shè)計(jì)針對 BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的特異性引物，并插入限制性內(nèi)切酶 5′ EcoRⅠ和3′ BamHⅠ位點(diǎn)，擴(kuò)增目的片段，以慢病毒表達(dá)載體 pLVX-IRES-Puro 為載體，酶切載體與目的片段后，使用 T4 連接酶進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，涂板，測序鑒定正確后得到重組質(zhì)粒，命名為 pLVX-FLAG-BRD4-BD1/2。

1.5 重組慢病毒包裝和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

HEK-293T 細(xì)胞在生長狀態(tài)良好時鋪至 60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度約 80% 時，按照 jet PRIME 的說明，將 pLVX- FLAG-BRD4-BD1/2 （3 μg）、pMD2.G （2 μg）、psPAX2 （1 μg） 共同轉(zhuǎn)染至 HEK-293T 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后 48 h 后，收集細(xì)胞及上清培養(yǎng)液，以 3000 r·min-1 離心 10 min 后，將上清凍存于 -80 ℃。當(dāng) 3D4/21 細(xì)胞密度達(dá)到 30%～50% 時感染上述包裝好的慢病毒，感染 48 hpi 后使用 5 μg·mL-1 嘌呤霉素進(jìn)行篩選。將篩選得到的細(xì)胞稀釋后均勻接種于 96 孔板中，以確保平均每個孔只接種 1 個，以獲得單克隆細(xì)胞，繼續(xù)在含有 5 μg·mL-1 的嘌呤霉素培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的驗(yàn)證

采用 PCR 和 Western blot 方法對上述收集的細(xì)胞樣品中的 BRD4-BD1/2 表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。PCR結(jié)果顯示，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系在 2 000 bp 處出現(xiàn)與預(yù)期一致的目的條帶。

將上述細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng) 10 代后的細(xì)胞一部分加入 RIPA 裂解液和 5×loading Buffer，取 20 μL 蛋白上樣量進(jìn)行 SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白用 90 V 恒壓轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，用 TBST 配制的 5% 的脫脂奶粉溶液室溫封閉 2 h，隨后加入相應(yīng)小鼠抗Flag單克隆抗體4 ℃過夜孵育，用 TBST 洗 3 次后加入相應(yīng)的山羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育 1 h，最后用 ECL 化學(xué)發(fā)光底物全自動化學(xué)發(fā)光成像分析。

1.7 不同代次穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系細(xì)胞活性的測定

使用 CCK-8 檢測方法測定細(xì)胞活性，分別將篩選得到的生長狀態(tài)良好的 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞和陰性對照 3D4/21-WT 細(xì)胞均以每孔 104 個均勻接種至 96 孔板中。分別設(shè)置了不同的時間點(diǎn)（12、24、36、48 h）以及不同代次（F10、F20、F30）兩種細(xì)胞培養(yǎng)相同的時間，向板孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，每個時間點(diǎn)做 3 次重復(fù)。將 96 孔板放在 37℃、5% CO2 條件下，避光孵育 2 h。使用酶標(biāo)儀測量 450 nm 波長下各孔的 OD 值。

1.8 穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對 ASFV 增殖的影響

1.8.1 RT-qPCR 檢測病毒 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平

通過 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA，并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，再以 cDNA 為模板進(jìn)行 Real-time qPCR，以豬的 GAPDH 基因作為內(nèi)參，檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫 ASFV CP204L 基因序列 （GenBank： MK333184.1）， ASFV B646L 基因序列 （GenBank： MK333180.1），豬 GAPDH 基因序列（GenBank： NM 001206359.1）設(shè)計(jì)的引物序列如表1。

1.8.2 Western blot 檢測病毒蛋白表達(dá)情況

3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 細(xì)胞接種于 12 孔板，分別以不同 MOI （0、0.1、1、2） 或不同感染時間 （12、24、36、48 hpi） 感染 ASFV CN/GS/2018，收集細(xì)胞樣品并使用 RIPA 裂解液裂解蛋白，4 ℃、12 000 r·min-1 離心 10 min 后收集上清液加入 5×loading buffer，金屬浴高溫變性后進(jìn)行 SDS-PAGE，電泳結(jié)束后 100 V，1 h 30 min 恒壓轉(zhuǎn)印至 NC 膜上。轉(zhuǎn)印完成后，使用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 緩沖溶液將 NC 膜至室溫封閉 2 h 后，用 TBST 洗膜 5 次，每次 5 min；按照比例稀釋 αnti-Flag （1∶1 000），αnti-β-actin （1∶5 000），αnti-p30 （1∶1 000），αnti-p72 （1∶1 000） 抗體，4 ℃ 過夜孵育；TBST 洗膜 5 次，每次 5 min；加入 1∶10 000 稀釋的 HRP-conjugated Afinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），Goat αnti-Mouse 二抗室溫孵育 2 h；TBST 洗膜 5 次；最后，使用 ECL 化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行成像和分析。

1.9 紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象（HAD50）測定

將 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞與 3D4/21-WT 細(xì)胞同時感染 ASFV （MOI=1） 36 hpi 后，收集上清，并于 -80 ℃ 進(jìn)行多次反復(fù)凍融。隨后 1 200 r·min-1離心 10 min，取 100 μL 病毒上清液進(jìn)行 10-1～10-8 倍梯度稀釋，然后接種到鋪滿 PAM 細(xì)胞的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加入 25 μL 1% 的豬紅細(xì)胞，每個稀釋梯度設(shè)置 8 個重復(fù)，37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5～7 d，每天觀察細(xì)胞及玫瑰花環(huán)數(shù)。根據(jù) Reed-Muench 法計(jì)算病毒滴度。

1.10 不同代次 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對ASFV復(fù)制的影響

為了研究不同代次細(xì)胞系對于 ASFV 復(fù)制的影響，分別將 3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 在 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至所需要的代次。分別選取了第 10、20、30 代細(xì)胞，將其接種到 12 孔板中，感染 ASFV CN/GS/2018。在感染后的特定時間點(diǎn)（12、24、36、48 hpi）收集細(xì)胞樣品，通過 Western blot 評估不同代次細(xì)胞系對于病毒復(fù)制的影響。

使用免疫熒光檢測不同代次（F10、F20、F30）穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的穩(wěn)定表達(dá)情況。使用熒光標(biāo)記的二抗檢測 Flag-BRD4-BD1/2 的表達(dá)情況，并對不同代次細(xì)胞系進(jìn)行比較。

1.11 數(shù)據(jù)分析

使用 GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制，采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。ns.Pgt;0.05 說明數(shù)據(jù)間無顯著差異，*.P≤0.05 說明數(shù)據(jù)間有顯著差異，**. P ≤0.01 說明數(shù)據(jù)間有極顯著差異。***. P≤0.001 表明數(shù)據(jù)間差異具有極高的統(tǒng)計(jì)顯著性。****. P≤0.0001。

2 結(jié) 果

2.1 BRD4-BD1/2促進(jìn) ASFV 的復(fù)制

為了探究 BRD4 及其溴結(jié)構(gòu)域?qū)τ?ASFV 復(fù)"" 制的影響，分別構(gòu)建 BRD4、BD1/2 和 BD1 的截短體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后感染 ASFV，利用 Western blot 及 RT-qPCR 檢測其對 ASFV 復(fù)制的影響。

結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域顯著提高了 ASFV B646L 基因及其編碼的 p72蛋白和 CP204L 基因及其編碼的 p30 蛋白表達(dá)水平。這一結(jié)果表明，BRD4的 BD1/2 結(jié)構(gòu)域在 ASFV 復(fù)制中發(fā)揮了明顯的促進(jìn)作用（圖1B～D）。

2.2 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究以 pLVX-IRES-Puro 質(zhì)粒為骨架構(gòu)建了含有 Flag 標(biāo)簽的 BRD4-BD1/2 基因的重組質(zhì)粒。為了驗(yàn)證構(gòu)建的載體，進(jìn)行了 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 限制性內(nèi)切酶的雙酶切試驗(yàn)。通過瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察到兩條明顯的 DNA 條帶。

其中一條約為 5 000 bp，對應(yīng)切割后的載體條帶，另一個約為 2 000 bp，與預(yù)期的 BRD4-BD1/2 的目的基因片段大小相符。結(jié)果表明慢病毒表達(dá)載體 pLVX-IRES-Puro-3x Flag- BRD4-BD1/2 構(gòu)建成功（圖 2）。

2.3 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系的鑒定

通過慢病毒包裝系統(tǒng)感染 3D4/21-WT 細(xì)胞后，觀察到細(xì)胞形態(tài)并未顯著改變，嘌呤霉素篩選后能夠正常傳代培養(yǎng)。通過篩選出的陽性克隆細(xì)胞連續(xù)傳代后，提取穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 基因的細(xì)胞系的總蛋白。通過 Western blot 檢測，發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)的 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中 BRD4-BD1/2 基因能夠穩(wěn)定表達(dá)（圖 3）。

2.4 細(xì)胞活性檢測

使用 CCK-8 測定3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 細(xì)胞的細(xì)胞活性。分別在不同時間點(diǎn)（12、24、36和48 h）以及不同代次的細(xì)胞（F10、F20、F30），通過測量 450 nm 波長下的 OD 值。結(jié)果顯示，各時間點(diǎn)及各代次細(xì)胞的兩種細(xì)胞系的細(xì)胞活性沒有顯著差異。盡管 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞經(jīng)過改造，但其細(xì)胞活性與 WT 細(xì)胞相比，細(xì)胞活性正常，無顯著差異（Pgt;0.05）（圖 4 A、B）。

2.5 BRD4-BD1/2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系促進(jìn) ASFV 復(fù)制

為了比較分析 ASFV-EGFP 毒株在 3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 細(xì)胞中的增殖能力，作者分別在這兩種細(xì)胞系中進(jìn)行了 ASFV-EGFP 的感染試驗(yàn)。兩種細(xì)胞系均在不同的病毒滴度（MOI 分別為0、0.1、1、2）下進(jìn)行了 ASFV-EGFP 感染。隨后在感染后 36 hpi 觀察熒光強(qiáng)度。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，病毒感染 24 hpi 時 Western blot 結(jié)果并不能明顯檢測到 ASFV 主要結(jié)構(gòu)蛋白 p72 的表達(dá)，而在 36 hpi 時能夠明顯檢測到其表達(dá)，因此作者選擇 36 hpi 作為主要的試驗(yàn)時間點(diǎn)。

試驗(yàn)結(jié)果顯示在感染后 36 hpi，與 3D4/21-WT 相比，穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，這表明 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系能夠促進(jìn) ASFV-EGFP 復(fù)制（圖 5）。

2.6 不同 MOI ASFV 感染 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對 ASFV 增殖的影響

為了分析不同 MOI （0、0.1、1、2） ASFV CN/GS/2018 在 3D4/21-BRD4-BD1/2和 3D4/21- WT 細(xì)胞中的復(fù)制能力，分別將兩種細(xì)胞接種到 12 孔板，待細(xì)胞密度長至 70%，分別以不同 MOI （0、0.1、1、2） 的 ASFV CN/GS/2018 毒株感染兩種細(xì)胞。感染后 36 hpi 收取樣品。

利用 RT-qPCR 檢測 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 ASFV 基因 CP204L、B646L/GAPDH表達(dá)量。結(jié)果顯示，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 CP204L、B646L/GAPDH 表達(dá)量顯著高于 WT 細(xì)胞（Plt;0.01）（圖 6 C、D）。3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系與 WT 細(xì)胞相比均能促進(jìn) ASFV CP204L、B646L 基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

同時，利用 Western blot 檢測病毒蛋白 p30、p72 的表達(dá)，結(jié)果顯示 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中 p30、p72 蛋白表達(dá)量顯著高于 3D4/21-WT 細(xì)胞（圖 6 A）。綜上所述，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞在不同 MOI ASFV 感染時現(xiàn)出明顯的促進(jìn)病毒復(fù)制的能力。

2.7 不同時間點(diǎn) ASFV 感染 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對 ASFV 增殖的影響

為了分析 3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT細(xì)胞在感染 ASFV CN/GS/2018 不同時間點(diǎn)之間的復(fù)制能力，將兩種細(xì)胞分別接種到 12 孔板，待細(xì)胞密度長至 70%，使用 ASFV CN/GS/2018 （MOI=1） 進(jìn)行感染，分別在感染后 12、24、36、48 hpi 收取樣品。

通過 Western blot 檢測病毒蛋白 p30、p72 的表達(dá)，結(jié)果顯示 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中 p30、p72 蛋白表達(dá)量顯著高于 WT 細(xì)胞（圖 7 A、B）。利用 RT-qPCR 檢測 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 CP204L、B646L 和 GAPDH mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 CP204L、B646L / GAPDH mRNA 表達(dá)量顯著高于 WT 細(xì)胞（Plt;0.01）（圖 7 C、D）。穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系能促進(jìn) ASFV CP204L、B646L 基因的表達(dá)。

綜上所述，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞在 ASFV 感染不同時間點(diǎn)的病毒復(fù)制能力強(qiáng)于 WT 細(xì)胞。

2.8 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 ASFV 滴度測定

為了深入分析 ASFV CN/GS/2018 在 3D4/21-BRD4-BD1/2 與 3D4/21-WT 細(xì)胞系中的增殖能力，作者通過觀察豬源紅細(xì)胞在感染 ASFV 的單核巨噬細(xì)胞周圍的吸附現(xiàn)象，采用 HAD50 測定方法對兩種細(xì)胞系中的病毒滴度進(jìn)行了量化。

如圖8，使用 HAD50 值計(jì)算，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中強(qiáng)毒株 ASFV CN/GS/2018 的病毒滴度分別為 6.5和6.7 lgHAD50·0.1 mL-1，這顯著高于3D4/21-WT細(xì)胞系中的病毒滴度（5.45和5.5 lgHAD50·0.1 mL-1）。這一結(jié)果表明，在3D4/21-BRD4-BD1/2細(xì)胞系中ASFV的增殖能力顯著高于3D4/21-WT細(xì)胞系 （Plt;0.05）。

2.9 不同代次 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對于 ASFV 復(fù)制影響的評估

為了深入研究不同代次 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對于 ASFV 復(fù)制的影響，作者分別選取了第 10、20、30 代 3D4/21-BRD4-BD1/2 以及相應(yīng)代次的 3D4/21-WT 細(xì)胞，將其接種到 12 孔板中并感染 ASFV CN/GS/2018。在感染后的特定時間點(diǎn)（12、24、36、48 hpi）收集相應(yīng)的細(xì)胞樣品，通過 Western blot 進(jìn)行對比分析。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在上述特定時間點(diǎn)（12、24、36、48 hpi），3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系在第 10、20、30代次相對于相應(yīng)代次的 3D4/21-WT 細(xì)胞，均能促進(jìn) ASFV 復(fù)制，而這種促進(jìn) ASFV 復(fù)制的能力并沒有降低或消失（圖 9A～D）。

同時利用免疫熒光檢測了不同代次（F10、F20、F30）穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的 BRD4-BD1/2表達(dá)情況，試驗(yàn)結(jié)果表明：不同代次的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中 BRD4-BD1/2 均能穩(wěn)定表達(dá)（圖 9E）。

3 討 論

非洲豬瘟（African swine fever）因其死亡率高、傳染性強(qiáng)，對全球養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成重大威脅，因此成為了獸醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。關(guān)于非洲豬瘟病毒（African swine fever vrius）的研究涵蓋了發(fā)病機(jī)制、免疫逃避機(jī)制和疫苗開發(fā)等方面。最近的研究表明，ASFV 可以感染多種商業(yè)化傳代細(xì)胞系，包括 MA-104、MARC-145 在內(nèi)的多種細(xì)胞系，這些細(xì)胞系被用來替代肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）來研究 ASFV 的復(fù)制動力學(xué)［21］。同樣，3D4/21 細(xì)胞系也被用作感染 ASFV 的細(xì)胞系，以替代肺泡巨噬細(xì)胞（PAM），盡管其復(fù)制效率相對較低［22］。

本研究主要聚焦于表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白 BRD4 在 ASFV 感染中的作用，轉(zhuǎn)染 BRD4-BD1/2 能夠促進(jìn) ASFV 復(fù)制，作者推測可能與 BRD4 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。BRD4 在 HSV 感染研究中也有類似的現(xiàn)象：轉(zhuǎn)染 BRD4 全長不能直接促進(jìn) HSV 感染，而轉(zhuǎn)染 BD1/2 能夠促進(jìn) HSV 感染，這種現(xiàn)象可能是由于 BD1/2 與 BRD4 競爭性結(jié)合乙酰賴氨酸［23］。相比之下，BRD4-BD1/2 的穩(wěn)定表達(dá)可能通過特定的相互作用或調(diào)控路徑直接促進(jìn) ASFV 復(fù)制，因此作者構(gòu)建了 BRD4-BD1/2 穩(wěn)定表達(dá) 3D4/21 細(xì)胞系，驗(yàn)證了其在 ASFV 復(fù)制中的關(guān)健作用。作者的研究擴(kuò)展了對 BRD4 在病毒感染領(lǐng)域的了解，前期研究已經(jīng)證明 BRD4 在 HIV、HPV、HSV 等多種病毒感染中發(fā)揮重要作用［24-26］。然而，本研究的結(jié)果揭示了 BRD4 在 ASFV 復(fù)制中的作用，豐富了 BRD4 在免疫學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。

此外，本研究中的一個重要發(fā)現(xiàn)是，盡管 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系在增殖活性上與3D4/21-WT 細(xì)胞無顯著差異，但其可以顯著促進(jìn) ASFV 復(fù)制。RT-qPCR 和 Western blot 的結(jié)果表明 ASFV B646L 基因編碼的 p72 蛋白和 CP204L 基因編碼的 p30 蛋白的表達(dá)量在 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中顯著升高，這是衡量病毒在細(xì)胞中增殖的重要標(biāo)志，這提示 BRD4-BD1/2 可能在 ASFV 的生命周期中起到了促進(jìn)作用［27］。

此外，BRD4-BD1/2 對 ASFV 復(fù)制的持續(xù)促進(jìn)作用表明，其穩(wěn)定表達(dá)可能在 ASFV 生命周期的特定階段起到關(guān)鍵影響，為 ASFV 的生物學(xué)特性提供了新的視角。HAD50 測定結(jié)果一步證實(shí)了在 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中，ASFV 的復(fù)制能力相較于 3D4/21-WT 細(xì)胞有了顯著提升，這強(qiáng)調(diào)了BRD4-BD1/2 在 ASFV 復(fù)制過程中的重要作用。

BRD4 在調(diào)控病毒感染反應(yīng)中的作用不僅限于 ASFV。Wang 等［16］的研究表明，抑制 BRD4 可通過 DNA 損傷依賴的方式激活 cGAS-STING 途徑，進(jìn)而激發(fā)廣泛的抗病毒天然免疫反應(yīng)，顯示出對多種 DNA 和 RNA 病毒的廣譜抗病毒活性。在呼吸道合胞病毒（RSV）的研究中，BRD4 抑制被發(fā)現(xiàn)可以改變病毒感染初期宿主免疫反應(yīng)中的蛋白質(zhì)相互作用復(fù)合體，有助于治療病毒性和過敏性肺?。?8］。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了 BRD4 在調(diào)節(jié)宿主對病毒感染反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，為針對 RSV 等 RNA 病毒開發(fā)基于 BRD4 抑制的治療方法提供了依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn) BRD4 與 HPV 中的 E2 蛋白相互作用，參與 HPV 生命周期的多個關(guān)鍵步驟，這為開發(fā)針對 BRD4 的 HPV 治療策略提供了新的思路［29］。綜上所述，我們的研究以及相關(guān)文獻(xiàn)的支持，均強(qiáng)調(diào)了 BRD4 在病毒復(fù)制和宿主免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，表明針對 BRD4 的策略可能成為一種有效的抗病毒治療方法，證明了將其作為潛在抗病毒靶標(biāo)的可能性。

綜上所述，本研究不僅成功構(gòu)建了 BRD4-BD1/2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，驗(yàn)證了其在 ASFV 復(fù)制中的關(guān)鍵作用，還為 ASFV 感染機(jī)制的深入理解和疫苗開發(fā)提供了新的理論基礎(chǔ)，為今后的病毒感染治療和疫苗研發(fā)提供了新的思路。在未來的研究中，可以進(jìn)一步探索 BRD4 與 ASFV 復(fù)制機(jī)制之間的分子交互作用，以更全面地理解這一復(fù)雜的病毒感染過程。

4 結(jié) 論

本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 基因的細(xì)胞系，證明了 BRD4-BD1/2 基因在促進(jìn) ASFV 復(fù)制中的關(guān)鍵作用。我們的研究不僅揭示了 BRD4 在 ASFV 感染和復(fù)制過程中的重要功能，也強(qiáng)調(diào)了其作為防治非洲豬瘟的潛在藥物靶標(biāo)的價(jià)值。此外，鑒于 ASFV 對全球豬業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)構(gòu)成的嚴(yán)重威脅，該細(xì)胞系的建立為未來研究 ASFV 的感染機(jī)制及疫苗候選株的開發(fā)提供了生物材料，而且為探索新的防控策略提供了科學(xué)依據(jù)，為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了新的見解。通過深入分析 BRD4-BD1/2 在 ASFV 生命周期中的角色，未來的研究應(yīng)進(jìn)一步探索其具體的分子機(jī)制及其它潛在的生物標(biāo)記物，以促進(jìn)對疫苗和藥物開發(fā)的全面理解。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ 王 濤， 孫 元， 羅玉子， 等. 非洲豬瘟防控及疫苗研發(fā)：挑戰(zhàn)與對策［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2018， 34（12）：1931-1942.

WANG T， SUN Y， LUO Y Z， et al. Prevention， control and vaccine development of African swine fever：challenges and countermeasures［J］. Chinese Journal of Biotechnology， 2018， 34（12）：1931-1942. （in Chinese）

［2］ 王 華， 王君瑋， 徐天剛， 等. 非洲豬瘟流行病學(xué)和診斷方法的研究進(jìn)展［J］. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2008， 38（6）：544-548.

WANG H， WANG J W， XU T G， et al. Advances in studies of epidemiology and diagnostic technologies for African swine fever［J］. Chinese Veterinary Science， 2008， 38（6）：544-548. （in Chinese）

［3］ 扈榮良， 于婉琪， 陳 騰. 非洲豬瘟及防控技術(shù)研究現(xiàn)狀［J］. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2019， 39（2）：357-369.

HU R L， YU W Q， CHEN T. African swine fever and its current research status of prevention and control［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2019， 39（2）：357-369. （in Chinese）

［4］ 陳 騰， 張守峰， 周鑫韜， 等. 我國首次非洲豬瘟疫情的發(fā)現(xiàn)和流行分析［J］. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2018， 38（9）：1831-1832.

CHEN T， ZHANG S F， ZHOU X T， et al. The discovery and epidemic analysis of the first African swine fever epidemic in China［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2018， 38（9）：1831-1832. （in Chinese）

［5］ 王清華， 任煒杰， 包靜月， 等. 我國首例非洲豬瘟的確診［J］. 中國動物檢疫， 2018， 35（9）：1-4.

WANG Q H， REN W J， BAO J Y， et al. The first outbreak of African swine fever was confirmed in China［J］. China Animal Health Inspection， 2018， 35（9）：1-4. （in Chinese）

［6］ 歐云文， 馬小元， 王 俊， 等. 非洲豬瘟分子病原學(xué)及分子流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2018， 38（2）：416-420.

OU Y W， MA X Y， WANG J， et al. Advances in studies of molecular etiology and molecular epidemiology for African swine fever［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2018， 38（2）：416-420. （in Chinese）

［7］ DIXON L K， CHAPMAN D A G， NETHERTON C L， et al. African swine fever virus replication and genomics［J］. Virus Res， 2013， 173（1）：3-14.

［8］ BORCA M V， RAI A， RAMIREZ-MEDINA E， et al. A cell culture-adapted vaccine virus against the current African swine fever virus pandemic strain［J］. J Virol， 2021， 95（14）：e0012321.

［9］ TAKAMATSU H H， DENYER M S， LACASTA A， et al. Cellular immunity in ASFV responses［J］. Virus Res， 2013， 173（1）：110-121.

［10］ SNCHEZ E G， RIERA E， NOGAL M， et al. Phenotyping and susceptibility of established porcine cells lines to African swine fever virus infection and viral production［J］. Sci Rep， 2017， 7（1）：10369.

［11］ ALI H A， LI Y L， BILAL A H M， et al. A comprehensive review of BET protein biochemistry， physiology， and pathological roles［J］. Front Pharmacol， 2022， 13：818891.

［12］ LIANG Y， TIAN J Y， WU T. BRD4 in physiology and pathology：“BET” on its partners［J］. BioEssays， 2021， 43（12）：2100180.

［13］ FRANCISCO J C， DAI Q， LUO Z J， et al. Transcriptional elongation control of hepatitis B virus covalently closed circular DNA transcription by super elongation complex and BRD4［J］. Mol Cell Biol， 2017， 37（19）：e00040-17.

［14］ MCBRIDE A A， WARBURTON A， KHURANA S. Multiple roles of Brd4 in the infectious cycle of human papillomaviruses［J］. Front MolBiosci， 2021， 8：725794.

［15］ ZANDIAN M， CHEN I P， BYRAREDDY S N， et al. Catching BETs by viruses［J］. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech， 2022， 1865（7）：194859.

［16］ WANG J， LI G L， MING S L， et al. BRD4 inhibition exerts anti-viral activity through DNA damage-dependent innate immune responses［J］. PLoS Pathog， 2020， 16（3）：e1008429.

［17］ GILAN O， RIOJA I， KNEZEVIC K， et al. Selective targeting of BD1 and BD2 of the BET proteins in cancer and immunoinflammation［J］. Science， 2020， 368（6489）：387-394.

［18］ 劉文豪， 朱彥策， 張冬萱， 等. 穩(wěn)定表達(dá)非洲豬瘟病毒E165R蛋白PK 15細(xì)胞系的構(gòu)建［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2023， 54（6）：2662-2666.

LIU W H， ZHU Y C， ZHANG D X， et al. Construction of PK 15 cell line stably expressing African swine fever virus E165R protein［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2023， 54（6）：2662-2666. （in Chinese）

［19］ 張 婷， 楊 博， 崔卉梅， 等. 過表達(dá)非洲豬瘟病毒D1133L蛋白的MA-104細(xì)胞系建立及其初步應(yīng)用［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2022， 53（6）：1877-1885.

ZHANG T， YANG B， CUI H M， et al. Establishment and preliminary application of MA-104 cell line overexpressing African swine fever virus D1133L protein［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2022， 53（6）：1877-1885. （in Chinese）

［20］ 殷娟斌， 張志雄， 王莎莎， 等. 過表達(dá)HDAC6基因的Vero細(xì)胞系建立及其對狂犬病病毒增殖效率評價(jià)［J］. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2023， 53（2）：150-155.

YIN J B， ZHANG Z X， WANG S S， et al. Establishment of Vero cell lines overexpressing HDAC6 gene and evaluation of its proliferative efficiency of rabies virus［J］. Chinese Veterinary Science， 2023， 53（2）：150-155. （in Chinese）

［21］ RAI A， PRUITT S， RAMIREZ-MEDINA E， et al. Identification of a continuously stable and commercially available cell line for the identification of infectious African swine fever virus in clinical samples［J］. Viruses， 2020， 12（8）：820.

［22］ GAO Y N， XIA T T， BAI J， et al. African swine fever virus exhibits distinct replication defects in different cell types［J］. Viruses， 2022， 14（12）：2642.

［23］ REN K， ZHANG W， CHEN X Q， et al. An epigenetic compound library screen identifies BET inhibitors that promote HSV-1 and -2 replication by bridging P-TEFb to viral gene promoters through BRD4［J］. PLoS Pathog， 2016， 12（10）：e1005950.

［24］ TIAN B， LIU Z Q， YANG J， et al. Selective antagonists of the bronchiolar epithelial NF-κB-bromodomain-containing protein 4 pathway in viral-induced airway inflammation［J］. Cell Rep， 2018， 23（4）：1138-1151.

［25］ HAN X Y， YU D， GU R R， et al. Roles of the BRD4 short isoform in phase separation and active gene transcription［J］. Nat Struct Mol Biol， 2020， 27（4）：333-341.

［26］ ZHAO Y R， NIU Q L， YANG S X， et al. Inhibition of BET family proteins suppresses African swine fever virus infection［J］. Microbiol Spectr， 2022， 10（4）：e0241921.

［27］ JIA N， OU Y W， PEJSAK Z， et al. Roles of African swine fever virus structural proteins in viral infection［J］. J Vet Res， 2017， 61（2）：135-143.

［28］ TIAN B， YANG J， ZHAO Y X， et al. BRD4 couples NF-κB/RelA with airway inflammation and the IRF-RIG-I amplification loop in respiratory syncytial virus infection［J］. J Virol， 2017， 91（6）：e00007-17.

［29］ RANI A Q， BONAM S R， ZHOU J， et al. BRD4 as a potential target for human papillomaviruses associated cancer［J］. J Med Virol， 2023， 95（12）：e29294.

（編輯 白永平）