牛支原體體外肺精準(zhǔn)切片感染模型的建立

摘 要： 本研究旨在建立一種牛支原體體外感染模型-牛肺組織精準(zhǔn)切片（precision-cut lung tissue slices， PCLS）感染模型。采集2月齡犢牛新鮮肺臟，經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖灌注、固定后，使用振動(dòng)切片機(jī)制成厚度為250 μm的牛PCLS，利用牛支原體野毒株HB0801（P1）及其傳代致弱株P(guān)150 以108 CFU·孔-1的劑量進(jìn)行體外感染，分別經(jīng)qRT-PCR、乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性試驗(yàn)、3D熒光顯微鏡全景掃描、免疫組化等技術(shù)評(píng)估牛支原體在PCLS中的感染效果。結(jié)果顯示正常 PCLS在體外培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞活力可維持在60%以上，組織形態(tài)學(xué)觀察PCLS邊緣清晰，肺泡結(jié)構(gòu)正常；qRT-PCR檢測(cè)牛支原體強(qiáng)、弱菌株在PCLS中的基因拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)二者均可存活和增殖，免疫組化觀察牛支原體主要定位于PCLS的肺泡腔周圍以及支氣管間隙，LDH試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牛支原體強(qiáng)、弱菌株感染18 h出現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)，二者均可誘導(dǎo)PCLS產(chǎn)生促炎因子IL-1β和IL-8，且強(qiáng)毒株誘導(dǎo)水平顯著高于弱毒株（Plt;0.05）。本研究初步建立了牛支原體PCLS體外感染模型，提供了一種可模擬牛支原體體內(nèi)感染試驗(yàn)的離體模型，為今后研究牛支原體與宿主相互作用提供借鑒和參考。

關(guān)鍵詞： 牛支原體；肺組織精準(zhǔn)切片模型；體外感染；炎性反應(yīng)

中圖分類號(hào)：S852.62

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4638-08

收稿日期：2023-12-13

基金項(xiàng)目：西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（ZYN2023045）; 西南民族大學(xué)引進(jìn)高層次人才科研資助金資助（RQD2023031）; 寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021BEF02028; 2023BCF01038）

作者簡(jiǎn)介：張 慧（1986-），女，山西定襄人，助理研究員，博士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：dkyzhanghui@163.com

*通信作者：郭愛珍，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail： aizhen@mail.hzau.edu.cn

Establishment of Cattle Precision-Cut Lung Tissue Slices （PCLS） Models Infected

with Mycoplasma bovis in vitro

ZHANG" Hui1， LU" Doukun2， ZHANG" Yiqiu2， ZHAO" Gang3， CHEN" Yingyu2， CHEN" Xi2， HU" Changmin2， GUO" Aizhen2*

（1.College of Animal and Veterinary Sciences， Southwest Minzu University， Chengdu 610041，" China;

2.College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，" China;

3.

School of Life Sciences， Ningxia University， Yinchuan 750021，" China）

Abstract： Mycoplasma bovis （M. bovis） is an important pathogen of bovine respiratory disease complex （BRDC）， mainly causing pneumonia， mastitis， arthritis， keratoconjunctivitis， otitis， and genital disorders， leading to high economic losses in dairy and beef cattle production. Lack of small animals’ models have greatly hindered the progress of effective vaccines and drugs for prevention and control in Mycoplasma bovis. In this study， we have established an in vitro infection model of M. bovis in Precision-cut lung tissue slices （PCLS）. We collected bovine lungs from apparently healthy two-months cattle after slaughter， filled the lung airway with low melting point agarose， transferred it to the vibratome tissue slicer and then made the 250 μm-thickness precision cut lung slices. After M. bovis wildtype strain HB0801（P1） and its attenuated strain P150 at a MOI of 108 CFU infected， quantitative real-time PCR， lactate dehydrogenase cytotoxicity assay， 3D fluorescence microscope panoramic scanning， immunohistochemistry analysis were performed. The results showed that cultured PCLS remained 60% cell viability for at least 72 h and maintained normal structural integrity including edge sharpness and alveolar structure well in uninfected PCLS." After infected with wildtype and attenuated M. bovis strains respectively， we found that both M. bovis could survive and proliferate in PCLS， tropism to alveolar and bronchial space， and showed cytotoxic reactions until 18 h post-infection. We also observed that after 36 h incubation with M. bovis wildtype strain P1 and its attenuated strain P150， cultured PCLS produced pro-inflammatory factors IL-1β and IL-8 in PCLS， and M. bovis wildtype strain HB0801 could induce significantly higher level than P150 （Plt;0.05）. In conclusion， this study provides a model and method to investigate M. bovis infection in vitro which can mimic M. bovis infection in vivo. It is expected to provide reference for subsequent research on host-pathogen interaction in M. bovis.

Key words： Mycoplasma bovis; precision-cut lung tissue slices; infected in vitro; inflammatory response

*Corresponding author： GUO Aizhen， E-mail： aizhen@mail.hzau.edu.cn

牛支原體（Mycoplasma bovis， M. bovis）作為牛呼吸疾病綜合征的首要病原和基礎(chǔ)病原，主要引起牛肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎等疾病，能顯著增加其他病原體所致呼吸疾病的嚴(yán)重程度和防治難度。牛支原體在呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（bovine respiratory disease， BRD）發(fā)生早期影響呼吸環(huán)境，增加常見細(xì)菌如溶血性曼氏桿菌的表達(dá)豐度，對(duì)BRD的發(fā)生具有重要影響［1］。一項(xiàng)研究表明，牛支原體在肺組織的檢出率達(dá)61%，鼻拭子檢出率35%，氣管組織檢出率28%，氣管拭子為27%，而且耐藥型牛支原體發(fā)生愈來愈普遍，成為制約牛呼吸疾病綜合征的重要原因［2］。我國(guó)于1983年首次報(bào)道牛支原體乳腺炎，于2008年首次報(bào)道牛支原體肺炎，該病在牛群中的發(fā)病率為50%～100%，病死率達(dá)10%～60%［3］，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也是制約我國(guó)和世界養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的重要威脅之一，然而臨床上牛支原體病仍缺乏有效疫苗和特效藥物用于防治。由于牛支原體具有高度的宿主特異性，致使牛支原體缺乏小動(dòng)物感染模型，嚴(yán)重阻礙了牛支原體致病機(jī)理研究、毒力因子挖掘和疫苗及藥物評(píng)價(jià)等研究，因此建立新型牛支原體感染性細(xì)胞模型對(duì)牛支原體基礎(chǔ)及應(yīng)用研究具有重要意義。

在研究呼吸系統(tǒng)疾病的體外模型中，以肺臟構(gòu)建的三維（3D）細(xì)胞感染模型能夠更好地模擬肺臟的自然環(huán)境，維持細(xì)胞間自然的相互作用和更逼真的生理生化反應(yīng)，對(duì)內(nèi)源性和外源性刺激應(yīng)答更接近體內(nèi)反應(yīng)，構(gòu)建的原理主要基于兩種方式，一種是組織塊浸沒培養(yǎng)（STC），另一種是氣液交界面（ALI）培養(yǎng)系統(tǒng)［4］，如精準(zhǔn)肺切片模型（precision-cut lung slices， PCLS）、類器官模型（organoids）以及肺芯片（lung-on-chip， LOC）等［5］。然而，目前關(guān)于牛支原體體外3D感染模型的報(bào)道仍較少。其中，PCLS目前研究人員廣泛使用的器官體外模型，也是一種可進(jìn)行體外培養(yǎng)的活組織模型，利用振動(dòng)切片機(jī)在保持組織活力的條件下精準(zhǔn)切割肺組織，用于制備具有特定厚度、易重復(fù)的體外培養(yǎng)的組織活性外植體，具有保存完好的肺組織結(jié)構(gòu)和肺組織內(nèi)多種類型的呼吸道細(xì)胞，包括DC、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞等［6］，在體外可以模擬病原體感染過程中多細(xì)胞相互作用的過程。因此，建立PCLS感染模型，能更大程度上模擬體內(nèi)肺環(huán)境，彌補(bǔ)了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)和減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用。目前國(guó)際上已建立了多種動(dòng)物PCLS體外培養(yǎng)體系，如小鼠［7］、人［8］、豬［9］、牛［10］等，廣泛應(yīng)用于病原體的體外研究以及相關(guān)藥物的毒理學(xué)和代謝等研究，對(duì)于牛支原體這種具有嚴(yán)格器官和組織嗜性的病原具有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

牛支原體菌株（HB0801株、HB0801-P150株）由本實(shí)驗(yàn)室保存；2月齡犢牛購(gòu)自本地牛場(chǎng)；低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自索萊寶公司，DMEM F-12細(xì)胞培養(yǎng)基和EBSS平衡鹽溶液以及抗生素Antibiotic-Antimycotic購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清和卡那霉素購(gòu)自Sigma公司，蘇木精伊紅（HE）染色試劑盒和乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物公司，TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶（HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）和熒光定量酶（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix）均購(gòu)自南京諾唯贊公司。

1.2 牛PCLS的制備

取2月齡犢牛的新鮮肺臟組織，確認(rèn)各個(gè)肺葉未損傷，水平放置，肺葉展開以確定主支氣管和細(xì)支氣管的最佳視角，支氣管插入硅膠管并用止血鉗固定，保證灌注時(shí)不漏液，然后用50mL注射器小心注入37℃保存的3%低熔點(diǎn)瓊脂糖至肺臟，直至肺葉充盈，小心觸碰肺臟表面，觀察是否平整堅(jiān)硬，將每個(gè)支氣管進(jìn)行同樣操作，直至整個(gè)肺灌注完成，將灌注好的肺臟置于冰箱內(nèi)凝固，肺臟變堅(jiān)硬后，在靠近氣管端一側(cè)，使用尖刀將肺切割成3～5 cm厚度的牛排狀，操作過程中保證低溫。取出肺組織進(jìn)行大小修整，將其切成直徑為1～2 cm的圓柱形組織芯， 置入圓柱形切片膜具，滴入3%低熔點(diǎn)瓊脂糖后固定，然后凝固后置于切片機(jī)進(jìn)行切片，在振動(dòng)切片機(jī)（VF200/300 amp;600 CompresstomeTM microtome，Precisionary Instruments）水槽中倒入遇冷的EBSS培養(yǎng)基，將切成柱體形狀的組織固定在切片機(jī)底座，設(shè)置切片機(jī)參數(shù)，調(diào)整PCLS切片厚度為250 μm。將制備好的牛PCLS置于24孔板中，每孔加入含有青霉素、鏈霉素、卡那霉素和兩性霉素B等抗生素的新鮮DMEM-F12培養(yǎng)基 1 mL，于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每小時(shí)換液1次，換液3～4次，以去除肺臟組織中殘留的低熔點(diǎn)瓊脂糖，最終得到大小一致、厚度均勻的牛PCLS，將切好的PCLS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔500 μL培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 HE染色和LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)評(píng)估PCLS細(xì)胞活力

取制備好的牛PCLS，經(jīng)洗滌、固定后，按照HE染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，染色后在顯微鏡下觀察PCLS組織學(xué)形態(tài)。將制備好的PCLS接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔加入2片PCLS培養(yǎng)），各孔設(shè)置為以下幾組：無細(xì)胞的培養(yǎng)液孔（背景空白對(duì)照孔），未經(jīng)牛支原體感染的對(duì)照細(xì)胞孔（樣品對(duì)照孔），未經(jīng)牛支原體感染的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔（樣品最大酶活性對(duì)照孔），以及牛支原體感染的細(xì)胞孔（每孔接種牛支原體108 CFU，感染樣品孔），設(shè)置不同處理時(shí)間（4、6、12、18、36、 60、72 h），在預(yù)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1 h，在樣品最大酶活性對(duì)照孔中加入LDH釋放試劑，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，取各孔的上清液120 μL， 加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，各孔分別加入60 μL LDH檢測(cè)工作液，室溫避光孵育30 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD490 nm，細(xì)胞活力（%）=1-（處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度）/（細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度）×100。每組兩個(gè)重復(fù)。

1.4 免疫組化以及間接免疫熒光觀察牛支原體在PCLS中的黏附和定位

為了直觀地觀察牛支原體在PCLS中的黏附和定位，對(duì)感染后的PCLS分別進(jìn)行免疫組化和間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)，將制備好的PCLS置于鋪有爬片的24孔板，每孔加入108 CFU·mL-1的牛支原體，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，感染12 h后，經(jīng)4%多聚甲醛固定2 h，根據(jù)參考文獻(xiàn)［11］的方法，加入5% BSA封閉，使用牛支原體單克隆抗體1C11（1∶500稀釋）作為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（H+L）為二抗，DAB顯色，顯微鏡下觀察切片免疫組化情況。對(duì)于IFA，步驟同上，二抗使用羊抗鼠IgG-FITC（1∶500稀釋），再孵育羅丹明鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架，加入含DAPI的封片劑封片，經(jīng)3D熒光顯微鏡（基恩士，BZ-X800）進(jìn)行全景掃描拍片。

1.5 熒光定量檢測(cè)牛支原體感染牛PCLS的拷貝數(shù)

將制備好的PCLS置于鋪有爬片的24孔板，每孔加入108 CFU·mL-1的牛支原體，感染4 h后，無菌PBS洗滌三次，換入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，選擇不同時(shí)間點(diǎn)（18、36、48、60 h）收集感染后PCLS，使用細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒提取DNA。根據(jù)文獻(xiàn)方法［10］，以牛CEACAM18為宿主參考基因（CEACAM18-F：AGCCAAATCTACATCACCCC；CEACAM18-R：ACCTCTAATGGACACACTTT），牛支原體uvrc基因?yàn)椴≡瓍⒖蓟颍╱vrc-F：TAATTTAGAAGCTTTAAATGAGCG-C；uvrc-R： CATATCTAGGTCAATTAAGGCTT-TG），采用SYBR Green方法檢測(cè)感染PCLS的牛支原體基因表達(dá)，然后根據(jù)ThermoFisher scientific DNA copy number calculator計(jì)算基因拷貝數(shù)。

1.6 牛支原體感染PCLS后炎性因子mRNA檢測(cè)

將制備好的PCLS置于鋪有爬片的24孔板，每孔加入108 CFU·mL-1的牛支原體，分別感染18、24、36 h，設(shè)置未感染組為陰性對(duì)照，TRIzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)文獻(xiàn)［11］中熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞炎性因子IL-8和IL-1β的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 PCLS活性和組織形態(tài)評(píng)估

細(xì)胞毒性檢測(cè)以及切片的組織形態(tài)是用于檢測(cè)PCLS活性變化的指標(biāo)。將切割好的牛PCLS置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取出樣品進(jìn)行LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)，結(jié)果顯示制備后的切片從4到72 h 細(xì)胞活力基本維持在60%以上（圖1A）。另外，本試驗(yàn)選擇PCLS進(jìn)行HE染色來評(píng)估切片的完整性，經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察組織形態(tài)顯示PCLS邊緣清晰，具有完整的肺組織結(jié)構(gòu)，其中肺泡結(jié)構(gòu)完整，涵蓋肺泡腔和肺支氣管（圖1B）。

2.2 免疫組化檢測(cè)牛支原體在PCLS中的定殖

肺臟免疫組化切片可見肺泡隔、肺泡細(xì)胞以及支氣管結(jié)構(gòu)等，利用牛支原體單克隆抗體1C11［12］對(duì)牛支原體進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果顯示，肺組織中均顯示牛支原體存在，感染后可黏附到細(xì)胞表面，定位于細(xì)支氣管以及支氣管間隙，如圖2所示。

2.3 牛支原體感染牛PCLS的3D共聚焦成像

使用牛支原體單抗1C11以及FITC標(biāo)記的熒光二抗顯示牛支原體在PCLS的定位（標(biāo)記為綠色），同時(shí)使用細(xì)胞染料羅丹明鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架（標(biāo)記為紅色），細(xì)胞核染料DAPI標(biāo)記細(xì)胞核（標(biāo)記為藍(lán)色），對(duì)牛支原體感染PCLS后的切片進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，由于PCLS屬于厚度為250 μm的組織，使用3D共聚焦成像系統(tǒng)，對(duì)間接免疫熒光標(biāo)記的 PCLS進(jìn)行掃描后拼圖觀察，結(jié)果顯示，綠色標(biāo)記的牛支原體主要分布于支氣管間隙、肺泡腔等（圖3A、B），而且兩種菌株對(duì)PCLS具有較強(qiáng)的黏附作用，陰性對(duì)照未見綠色標(biāo)記的牛支原體（圖3C）。

2.4 牛支原體強(qiáng)弱菌株在PCLS中的復(fù)制和細(xì)胞毒性檢測(cè)

分別將牛支原體強(qiáng)毒株HB0801（P1）及其體外傳代致弱菌株P(guān)150以每孔108 CFU的比例感染PCLS，感染4 h后洗滌去除未黏附的牛支原體，然后繼續(xù)培養(yǎng)至60 h，提取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)感染樣品的DNA，以宿主基因CEACAM18為內(nèi)參，牛支原體uvrc基因作為目的基因，采用SYBR Green檢測(cè)牛支原體基因的表達(dá)并計(jì)算其拷貝數(shù)，結(jié)果顯示，牛支原體強(qiáng)弱菌株從感染后18 h 到48 h，均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，在48 h拷貝數(shù)達(dá)到最高（圖4A）。乳酸脫氫酶是一種穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酶，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷后能夠從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，為了進(jìn)一步研究牛支原體感染是否誘導(dǎo)PCLS損傷，在不同時(shí)間點(diǎn)收集上清，利用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PCLS中乳酸脫氫酶釋放量，結(jié)果顯示隨感染時(shí)間延長(zhǎng)，牛支原體強(qiáng)毒株P(guān)1感染組細(xì)胞活力有降低，但與弱毒株P(guān)150和空白組相比，均未有顯著性差異（圖4B）。

2.5 牛支原體感染后誘導(dǎo)PCLS促炎因子表達(dá)

炎性反應(yīng)是支原體感染后刺激宿主細(xì)胞的重要表型，PCLS也作為體外細(xì)胞模型用于多種病原的炎性反應(yīng)評(píng)估［14］。因此，收集牛支原體感染后不同時(shí)間點(diǎn)的PCLS，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qRT-PCR檢測(cè)促炎因子IL-1β和IL-8的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，牛支原體強(qiáng)弱菌株均可刺激PCLS產(chǎn)生較強(qiáng)的炎性反應(yīng)，且強(qiáng)毒株誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β和IL-8 mRNA水平顯著高于弱毒株P(guān)150和空白組（Plt;0.05，圖5A、B）。

3 討 論

肺精準(zhǔn)切片PCLS是一種制備方法簡(jiǎn)便、能夠在體外條件下連續(xù)培養(yǎng)、可凍存后重復(fù)使用的新型3D細(xì)胞模型［7］。PCLS涵蓋肺部的40多種細(xì)胞類型，保留了不同細(xì)胞類型與胞外基質(zhì)之間的相互作用，分化狀態(tài)和定位與體內(nèi)肺組織的生理狀況一致［6］，已被應(yīng)用于多種哺乳動(dòng)物和人的科學(xué)研究中［14］。本研究通過建立牛肺切片的牛支原體體外感染模型，通過檢測(cè)牛支原體感染后細(xì)胞活性、肺組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、炎性反應(yīng)等，證實(shí)牛支原體可以在PCLS中定殖和復(fù)制，主要分布于支氣管壁和肺泡腔周圍，可以誘導(dǎo)PCLS產(chǎn)生較高水平的IL-1β和IL-8，從細(xì)胞活力、病原定位、病原的復(fù)制增殖以及細(xì)胞毒性和炎性反應(yīng)等方面探討了牛支原體在該培養(yǎng)模型中的感染特性，為牛支原體體外新型感染模型提供了借鑒和參考。

國(guó)外有學(xué)者報(bào)道，牛PCLS可作為牛支原體和流感病毒的混合感染模型，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)制備的牛PCLS在體外可以存活7 d，其凋亡的細(xì)胞在24 h內(nèi)少于12%，120 h后可達(dá)11%～30%，LDH細(xì)胞毒性為10%～30%［15］，這與本研究制備的牛PCLS細(xì)胞活力在60%以上相接近。將試驗(yàn)制備的PCLS作為感染模型，使用牛支原體強(qiáng)弱菌株進(jìn)行感染，結(jié)合免疫組化和3D熒光共聚焦檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)牛支原體主要定位于支氣管壁和肺泡腔周圍，這與臨床上牛支原體體內(nèi)感染在肺部的定位一致［16］。

肺組織切片也是一種炎性反應(yīng)評(píng)估模型，Angela等［8］利用LPS刺激人PCLS 后可以產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子。化膿隱秘桿菌在感染豬PCLS后，發(fā)現(xiàn)可以顯著損傷肺上皮細(xì)胞，激活NLR/Caspase-1信號(hào)通路以及NF-κB、MAPK以及AKT等炎性信號(hào)通路，促進(jìn)肺部炎性反應(yīng)發(fā)生［17］。本研究制備的牛PCLS感染牛支原體后，PCLS中促炎因子IL-1β和IL-8 的mRNA水平明顯升高，這可能與肺切片中涵蓋大量的免疫細(xì)胞（如DC、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞等）相關(guān)。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，使用不同DC亞群免疫標(biāo)記PCLS，共聚焦顯微鏡觀察可以明顯看到不同類型的免疫細(xì)胞，如CD11c+CD88+標(biāo)記的巨噬細(xì)胞、CD11c-CD88+標(biāo)記的中性粒細(xì)胞、CD324+標(biāo)記的氣道上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞均為重要的免疫細(xì)胞，可以產(chǎn)生高水平的炎性反應(yīng)［6］。通過本試驗(yàn)確定，制備的牛PCLS可作為模擬牛支原體體內(nèi)感染試驗(yàn)的炎性刺激模型，可為反芻動(dòng)物BRD相關(guān)疾病的研究帶來便利和較為敏感的評(píng)估體系。

目前PCLS模型仍存在一些局限，包括PCLS缺乏標(biāo)準(zhǔn)且均一的細(xì)胞培養(yǎng)基導(dǎo)致細(xì)胞活力不足，制備的PCLS細(xì)胞活力差異較大，在制備過程中細(xì)胞活力降低明顯，肺臟離體后，細(xì)胞損傷較大，加上缺少適合的培養(yǎng)基維持細(xì)胞穩(wěn)定；牛體遺傳學(xué)多樣性導(dǎo)致的個(gè)體差異顯著，從而導(dǎo)致切片不同；PCLS從體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中剝離出來，無法評(píng)估肺、血、淋巴結(jié)之間的遷移變化等；但與細(xì)胞模型比較，PCLS具有比較完整的組織結(jié)構(gòu)、多樣化的細(xì)胞類型以及細(xì)胞極性，能最大限度地模擬在體狀態(tài)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和條件的不斷優(yōu)化，PCLS在牛支原體及BRD相關(guān)疾病的研究中仍蘊(yùn)藏著巨大的潛力。

4 結(jié) 論

本研究初步建立了牛支原體PCLS體外感染模型，該細(xì)胞可用于檢測(cè)牛支原體的存活、增殖、定位，感染牛支原體后可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性和炎性反應(yīng)，為臨床提供了一種可模擬牛支原體體內(nèi)感染試驗(yàn)的離體模型，也為今后研究牛支原體與宿主相互作用提供參考。

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（編輯 白永平）