產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素耐藥基因雙重熒光定量PCR檢測方法的建立

摘 要： 旨在開發(fā)一種快速、靈敏的針對產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素類耐藥基因tetA（P）和tetB（P）的雙重熒光定量PCR檢測方法，為快速檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素類抗生素耐藥性提供新策略。本研究針對tetA（P）和tetB（P）的保守序列設(shè)計引物和探針，構(gòu)建重組質(zhì)粒，對退火溫度和體系進行優(yōu)化，同時采用藥敏紙片瓊脂擴散法測定菌株對四環(huán)素類藥物的敏感性加以驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的反應程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，共 39個循環(huán)。使用該反應程序僅能擴增重組質(zhì)粒，對照菌株無擴增曲線；組內(nèi)變異系數(shù)小于1.3%，組間變異系數(shù)小于1.8%，重組質(zhì)粒最低檢測限度為102 copies·μL-1。使用本方法對33份產(chǎn)氣莢膜梭菌臨床分離株樣品進行耐藥基因檢測，同時進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)本研究建立的檢測方法對四環(huán)素耐藥基因的檢出率均為75.8%（25/33），且與藥敏試驗結(jié)果一致。綜上，本研究建立了一種特異、敏感、重復性好的產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素類耐藥基因tetA（P）和tetB（P）的雙重熒光定量PCR檢測方法。

關(guān)鍵詞： 產(chǎn)氣莢膜梭菌；四環(huán)素；tetA（P）；tetB（P）；雙重熒光定量PCR

中圖分類號：S852.616.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4630-08

收稿日期：2023-10-26

基金項目：廣東省基礎(chǔ)與應用基礎(chǔ)研究基金項目（2021B1515120006）；廣東省科技計劃項目（2021B1212050021）；豬禽種業(yè)全國重點實驗室開放課題（2023QZ-NK05；2022GZ07）；廣州市科技計劃項目（2023B04J0137；2023A04J0789）；科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項資金（高水平農(nóng)科院建設(shè)）（202110TD；202122TD；R2020PY-JC001；R2019YJ-YB3010；R2020PY-JG013；R2020QD-048；R2021PY-QY007；R2023PY-JG018）；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊建設(shè)專項（2022KJ119）；廣東省農(nóng)業(yè)科學院協(xié)同創(chuàng)新中心項目（XTXM202202）

作者簡介：歐蘭欣（2000-），女，湖南宜章人，碩士生，主要從事動物傳染病病因和致病機理研究，E-mail： 760903362@qq.com

*通信作者：廖申權(quán)，主要從事獸醫(yī)寄生蟲生化代謝與新藥創(chuàng)制研究，E-mail：lsq6969@163.com；張浩吉，主要從事動物傳染病病原學與流行病學研究，E-mail：zhanghaoji@aliyun.com

Establishment of a Duplex Real-time PCR Method for Tetracycline Resistance

Gene Detection in Clostridium perfringens

OU" Lanxin1，2， YE" Bijin1，2， SUN" Mingfei2， QI" Nanshan2， LI" Juan2， L Minna2， LIN" Xuhui2，

CAI "Haiming2， HU" Junjing2， SONG" Yongle2， CHEN" Xiangjie2， ZHU" Yibin2， YIN" Lijun2， ZHANG

Jianfei2， LIAO" Shenquan2*， ZHANG" Haoji1*

（1.College of Life Science and Engineering， Foshan University， Foshan 528225，" China;

2.Key Laboratory of Avian Influenza

and Other Major Poultry Diseases Prevention and Control， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province， Institute of Animal Health， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640，" China）

Abstract：" The purpose of this study was to establish a rapid and sensitive duplex real-time PCR method for" tetA（P） and tetB（P） tetracycline resistance genes detection in Clostridium perfringens， aiming at providing a new strategy for the expedited identification of tetracycline antibiotic resistance within C. perfringens. Primers and probes were designed to target the conserved sequences of tetA（P） and tetB（P）， construct recombinant plasmid， and optimize the annealing temperature and system. At the same time， validation of the method was substantiated through disc diffusion test for the determination of strain of tetracycline drugs sensitivity. The results showed that， the optimized reaction program was 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s; 56 ℃ 30 s， 39 cycles. And this method exclusively amplified the recombinant plasmid with no amplification curve observed for control strains. Intra-assay and inter-assay coefficients of variation were observed to be less than 1.3% and 1.8%， respectively. The plasmid standard had a minimum detection threshold of 102 copies·μL-1. Using this method， resistance gene detection was performed on 33 clinical isolates of C. perfringens， complemented by antimicrobial susceptibility testing. The detection method established by the current study yielded a detection rate of 75.8% （25/33） for tetracycline resistance genes， aligning significantly with the antimicrobial susceptibility testing results. In conclusion， this study successfully established a specific， sensitive， and highly reproducible duplex real-time PCR method for the detection of tetA（P） and tetB（P） tetracycline resistance genes in C. perfringens.

Key words： Clostridium perfringens; tetracycline; tetA（P）; tetB（P）; duplex real-time PCR

*Corresponding authors： LIAO Shenquan，E-mail：lsq6969@163.com；ZHANG Haoji，E-mail：zhanghaoji@aliyun.com

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，CP）是一種厭氧、產(chǎn)芽孢的革蘭陽性細菌，廣泛分布于土壤、污水、糞便和食物等環(huán)境中［1］。CP是最常見的食源性人畜共患病病原體之一，可引起人和動物的食物中毒、輕度腹瀉、致命性腸毒素血癥和氣性壞疽等多種疾?。?］，其毒力可歸因于其分泌的20多種毒素和降解酶［3］。在臨床上具有抗梭菌活性的抗生素，如青霉素、林可霉素、四環(huán)素和桿菌肽，通常用于防控新生仔豬腹瀉和雞壞死性腸炎等［4］。畜禽養(yǎng)殖業(yè)長期頻繁使用抗生素，導致耐藥菌的出現(xiàn)以及細菌多重耐藥現(xiàn)象的加劇［5］。巴西的產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株對阿莫西林和頭孢硫呋喃敏感，對四環(huán)素和林可霉素耐藥［6］，而來自泰國的分離株對青霉素和四環(huán)素敏感，對頭孢菌素和林可酰胺具有高耐藥性［7］。在國內(nèi)，青藏高原牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株對抗生素的耐藥率最高依次為鏈霉素（93.75%）和磺胺甲惡唑（86.81%）［8］。北京和山西的雞源和豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株，對慶大霉素和磺胺類藥的耐藥率高達91.0%［9］。許多產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株攜帶多種耐藥基因，已被證明是耐藥基因和決定簇的儲存庫，可以轉(zhuǎn)移到其他細菌物種，因此它可能在未來對動物和人類健康構(gòu)成潛在威脅［10-11］。同時，具有抗藥性的產(chǎn)氣莢膜梭菌會導致治療失敗和經(jīng)濟損失，危害人類健康，因此有必要優(yōu)化對耐藥產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測方法，以改進治療方案，并監(jiān)測細菌性病原體中耐藥性（antimicrobial resistance，AMR）的演變［12］。

四環(huán)素作為一種廉價易得，效果明顯且副作用小的廣譜抗菌藥，廣泛應用于防治多種畜禽疾?。?3］。四環(huán)素耐藥性是在產(chǎn)氣莢膜梭菌中觀察到的最常見的抗生素耐藥表型，四環(huán)素耐藥菌的控制迫在眉睫［14］。目前已報道細菌對四環(huán)素的耐藥機制包括外排泵、核糖體保護、藥物靶點的修飾和酶作用機制，其中外排泵和核糖體保護占了絕大多數(shù)比例［15］。在大多數(shù)情況下，對四環(huán)素類藥物的耐藥現(xiàn)象及耐藥機制與tet基因的存在和類型有關(guān)。目前，從動物分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種四環(huán)素耐藥基因，包擴teto（P）、tet（K）、tet（L）和tet（M）等［16］。四環(huán)素耐藥基因在產(chǎn)氣莢膜梭菌群中高度保守，研究人員將tet（P）類定義為有別于其他tet類，并限于產(chǎn)氣莢膜梭菌群［17］。tet（P）由2個四環(huán)素耐藥基因tetA（P）和tetB（P）組成，它們通過不同的機制調(diào)節(jié)四環(huán)素耐藥性，tetA（P）在四環(huán)素耐藥菌株中檢出率最高（100%），tetB（P）次之（93%）［16］。目前，對于CP抗生素的耐藥基因檢測主要依靠普通PCR方法，靈敏性和特異性不高，建立多重qPCR可增加檢測靈敏性并提高檢測效率［18］。因此，急需開發(fā)CP耐藥基因的快速篩查技術(shù)。鑒于此，本研究擬針對產(chǎn)氣莢膜梭菌tetA（P）和tetB（P）的保守區(qū)設(shè)計特異性引物和探針，以建立雙重熒光定量PCR檢測方法可同時檢測tetA（P）和tetB（P）基因，并通過臨床樣品驗證其效果。本研究建立的方法以期有助于產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素耐藥基因的快速檢測和調(diào)查，為后續(xù)的耐藥篩查研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

33株（2株G型，31株A型）雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌樣品于2022—2023年由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所寄生生物學研究室從糞便、腸道中分離鑒定并保存。大腸桿菌CVCC1527、沙門菌CVCC527、雞源乳桿菌ATCC33199、丁酸梭菌CGMCC 1.5205均由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所寄生生物學研究室培養(yǎng)保存。

1.2 主要試劑與儀器

TIANGEN? TIANamp Bacteria DNA Kit 細菌基因組提取試劑盒、TIANGEN? Lysozyme溶菌酶溶液，北京天根生化科技有限公司；TaKaRa? Premix Ex TaqTM （Probe qPCR）、TaKaRa? pMDTM 18-T Cloning Kit，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司; Trellef? DH5α Chemically Competent Cell DH5α感受態(tài)細胞，北京擎科生物科有限公司；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司。引物和探針，上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

CFX96 實時熒光定量PCR儀、普通PCR儀、電泳儀，Bio-rad 公司產(chǎn)品；醫(yī)用超凈工作臺，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；超微量分光光度計，上海寶予德科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物與探針

根據(jù)NCBI上提供的產(chǎn)氣莢膜梭菌tetA（P）和tetB（P）的參考序列，針對其保守區(qū)，使用PrimerExpress軟件設(shè)計兩對特異性引物和Taqman探針（表1），合成并純化。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以產(chǎn)氣莢膜梭菌D25G分離株核酸序列為模板，使用設(shè)計好的引物通過普通PCR分別擴增145和160 bp的目的片段。將tetA（P）和tetB（P）基因的擴增產(chǎn)物電泳，膠回收，連接pMD 18-T克隆載體后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，然后在氨芐固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，挑取單菌落驗證，送到廣州艾基生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序正確的菌液提取質(zhì)粒，并分別命名為pMD18T-tetA和pMD18T-tetB。使用超微量分光光度計測量質(zhì)粒濃度，計算拷貝數(shù)，用去離子水將質(zhì)粒進行稀釋，使其終濃度為 1×108～1×102 copies·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ嬎愎剑嘿|(zhì)?？截悢?shù)（copies·mL-1）=6.02×1023×質(zhì)粒濃度（g·mL-1）/質(zhì)粒長度×660。

1.5 多重qPCR反應條件的優(yōu)化及標準曲線的構(gòu)建

在Premix推薦體系下優(yōu)化退火溫度，設(shè)置退火溫度的梯度為54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃、64 ℃，反應條件中變性、退火、延伸溫度時間分別是95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，54 ℃～64 ℃ 30 s，共39個循環(huán)。確定最佳退火溫度后，采用方陣法優(yōu)化引物和探針的濃度。總體系為25 μL，2×的Premix Ex TaqTM （Probe qPCR） 12.5 μL，10 μmol·L-1的引物和探針分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，1×108 copies·μL-1 的重組質(zhì)粒pMD18T-tetA和pMD18T-tetB 2 μL最后用去離子水補足至25 μL。

將重組質(zhì)粒pMD18T-tetA和pMD18T-tetB稀釋至2×108 copies·μL-1，1∶1混勻后用去離子水將質(zhì)粒進行連續(xù)10倍稀釋，取終濃度為 1×108～1×102 copies·μL-1作為模板，每個濃度做3個重復，按照優(yōu)化好的退火溫度和體系進行雙重qPCR擴增。以質(zhì)粒濃度對數(shù)值為橫坐標，以循環(huán)閾值（cycle threshold， Ct）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.6 特異性試驗

使用重組質(zhì)粒pMD18T-tetA和pMD18T-tetB 作為陽性對照，去離子水作為陰性對照，大腸桿菌、丁酸梭菌、沙門菌、乳酸桿菌DNA作為模板，按已優(yōu)化好的雙重qPCR進行擴增，測試該方法的特異性。

1.7 靈敏性試驗

將重組質(zhì)粒pMD18T-tetA和pMD18T-tetB 混合液依次稀釋10倍，1×108～1×101 copies·μL-1共8個不同濃度的混合液作為模板。陰性對照為去離子水，進行雙重qPCR擴增。

1.8 重復性試驗

選取1×105、1×106、1×107 copies·μL-1 3個濃度重組質(zhì)粒pMD18T-tetA和pMD18T-tetB混合液作為模板，每種濃度進行3次重復，經(jīng)雙重qPCR擴增后，得到組內(nèi)變異系數(shù)。每個梯度在3個不同時間段分別做3個重復，得到組間的變異系數(shù)。根據(jù)公式：變異系數(shù)（CV%）=標準差（SD）/平均數(shù)（X ）×100%，計算出組內(nèi)和組間變異系數(shù)。

1.9 臨床樣品驗證

將由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所提供的33份產(chǎn)氣莢膜梭菌樣品復蘇，提取DNA作為模板，以本研究所建立的雙重qPCR方法進行耐藥基因的擴增，同時以普通qPCR作為對照組，以驗證該方法的特異性和敏感性。按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical amp; Laboratory Standards Institute， CLSI）抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準，對樣品菌株進行藥敏試驗，采用藥敏紙片瓊脂擴散法，測定菌株對四環(huán)素類藥物的敏感性，每種藥敏紙片3 個重復，探究耐藥基因和耐藥表型的匹配率。

1.10 數(shù)據(jù)處理

標準曲線中的Ct值以“均值±標準差（SD）”表示，通過GraphPad Prism 8.0.2軟件使用最小二乘法進行線性擬合獲得標準曲線方程，并繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pMD18T-tetA和pMD18T-tetB的構(gòu)建

以產(chǎn)氣莢膜梭菌D25G分離株的核酸序列為模板，使用 tetA-F/R 和 tetB-F/R 通過普通 PCR 擴增目的片段。結(jié)果如圖1所示，獲得與預期大小一致的目的片段，分別為tetA （145 bp）和tetB （160 bp）。將目的片段與pMD18-T克隆載體連接以構(gòu)建重組質(zhì)粒，送去廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序，驗證成功的分別命名為pMD18T-tetA和pMD18T-tetB。提取重組質(zhì)粒，測得重組質(zhì)粒的濃度分別為tetA（100.02 ng·μL-1）和tetB（104.62 ng·μL-1）。經(jīng)計算，tetA和tetB重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)均為3.2×1010 copies·μL-1。

2.2 雙重qPCR反應條件的優(yōu)化及標準曲線的建立

通過優(yōu)化反應體系和退火溫度，最終確認雙重qPCR總體系為25 μL，2×的Premix Ex TaqTM （Probe qPCR） 12.5 μL，tetA-F/R和tetB-F/R各0.2 μL，tetA-P 0.6 μL，tetB-P 0.4 μL，重組質(zhì)粒混合液模板2 μL，最后用去離子水補足至25 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，共 39個循環(huán)。

將重組質(zhì)粒pMD18T-tetA和pMD18T-tetB混合液連續(xù)10倍稀釋，取終濃度為 1×108～1×102 copies·μL-1作為模板，進行雙重qPCR擴增。結(jié)果顯示，pMD18T-tetA的標準曲線為y=-2.958x+38.08，R2=0.9908，pMD18T-tetA的標準曲線為y=-3.110x+41.17，R2=0.9972（圖2）。

2.3 特異性試驗

利用本研究已建立的雙重qPCR方法對pMD18T-tetA和pMD18T-tetB重組質(zhì)粒以及腸道菌（大腸桿菌、丁酸梭菌、沙門菌、乳酸桿菌）的DNA進行擴增。結(jié)果如圖3所示，該方法特異性良好，只對pMD18T-tetA和pMD18T-tetB重組質(zhì)?；旌弦簲U增結(jié)果顯示陽性，其他細菌核酸結(jié)果均顯示陰性。

2.4 敏感性試驗

本研究將pMD18T-tetA和pMD18T-tetB重組質(zhì)?；旌弦哼M行梯度稀釋后，取101～108 copies·μL-1 8個濃度進行雙重qPCR擴增。結(jié)果如圖4所示，該方法靈敏較高，最低能檢測到 102 copie·μL-1。

2.5 重復性試驗

本研究將 pMD18T-tetA和pMD18T-tetB 重組質(zhì)?；旌弦哼M行10倍梯度稀釋，取107、106、105這3個梯度進行重復性試驗，并計算變異系數(shù)。結(jié)果如表2所示，該方法的組內(nèi)平均變異系數(shù)在0.3%～1.3%之間；組間的變異系數(shù)在0.6%～1.8%之間。表明，本研究建立的方法具有良好的重復性。

2.6 臨床樣品驗證

對33份產(chǎn)氣莢膜梭菌臨床分離株復蘇提取DNA后，分別以本研究所建立雙重qPCR方法和普通qPCR 進行擴增。結(jié)果顯示，雙重qPCR和普通qPCR均檢出25份陽性樣品，細菌核酸檢出率為75.8%，所有陽性樣品同時含有tetB（P）和tetA（P）。對33份樣品進行四環(huán)素類藥物的藥敏試驗，藥敏試驗結(jié)果顯示與耐藥基因檢出率基本一致（表3）。耐藥菌株中有1株僅對四環(huán)素耐藥，耐藥基因結(jié)果顯示其不含有tetA和tetB基因。另有1株對四環(huán)素和多西環(huán)素耐藥，而耐藥基因顯示含有tetA和tetB基因。

3 討 論

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種能引起動物壞死性腸炎、食物中毒甚至死亡的條件致病菌。tet基因存在于產(chǎn)氣莢膜梭菌pCW3樣質(zhì)粒上，源于可移動原件的轉(zhuǎn)移（質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子）或通過暴露于四環(huán)素的亞抑制水平而誘導產(chǎn)生［19］。tetA（P）基因編碼一個46 ku的蛋白，參與四環(huán)素從細胞中的主動外流，而tetB（P）基因編碼一個大約72.6 ku的核糖體保護蛋白［19］。tetA（P）基因產(chǎn)物對四環(huán)素的外排可能是大多數(shù)菌株對四環(huán)素產(chǎn)生抗性的原因，tetB（P）基因可同時引起米諾環(huán)素和四環(huán)素耐藥，該基因可能參與了所有四環(huán)素類藥物的耐藥，尤其是米諾環(huán)素的耐藥［15］。且絕大多數(shù)的四環(huán)素耐藥菌攜帶對2個以上的四環(huán)素耐藥基因，tetA（P）和tetB（P）是產(chǎn)氣莢膜梭菌檢出率最高的2個四環(huán)素耐藥基因［16］。

2018年，白龍等［20］對雞源細菌的5種四環(huán)素耐藥基因tetA、tetX、tetG、tetD和tetS建立了多重PCR檢測方法，該方法的靈敏度為102 CFU·mL-1，未分析檢測方法的重復性。2013年，夏青青等［21］建立了豬源、雞源細菌的四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetC、tetM三重PCR檢測方法，研究人員并未分析檢測方法的特異性、重復性及敏感性。多重PCR檢測方法靈敏度低于多重qPCR方法，目前尚未研究建立四環(huán)素耐藥基因的多重qPCR檢測方法，且產(chǎn)氣莢膜梭菌的四環(huán)素耐藥基因與其他禽源細菌同源性低，上述方法不適用于產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素耐藥基因的大規(guī)模篩查研究。本研究針對產(chǎn)氣莢膜梭菌tetA（P）和tetB（P）的序列保守區(qū)設(shè)計引物和探針，優(yōu)化反應體系和反應程序，并對臨床分離樣品進行檢測。本方法特異性良好，組內(nèi)重復性試驗變異系數(shù)小于1.3%，組間變異系數(shù)小于1.8%，重組質(zhì)粒最低檢測限度為102 copies·μL-1。臨床檢測結(jié)果表明，雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株對四環(huán)素類藥物的耐藥率高達75.8%，建立的雙重熒光定量PCR檢測方法與普通PCR檢測結(jié)果相符合，對四環(huán)素耐藥基因的陽性樣品檢出率與藥敏結(jié)果基本一致，根據(jù)耐藥結(jié)果推測tetA（P）和tetB（P）的存在可能跟多西環(huán)素是否耐藥有關(guān)，該檢測結(jié)果對防控產(chǎn)氣莢膜梭菌和監(jiān)測四環(huán)素耐藥具有指導意義。

4 結(jié) 論

綜上，本研究建立了一種特異、靈敏、重復性好的產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素類耐藥基因的雙重熒光定量PCR檢測方法，利于臨床早期發(fā)現(xiàn)耐藥基因，便于快速制定及調(diào)整治療方案，為監(jiān)控產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素耐藥性提供新的策略。

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（編輯 范子娟）