豬瘟病毒中和抗體與E2蛋白抗體相關(guān)性分析

摘 要： 旨在探索豬瘟病毒中和抗體與E2蛋白抗體的關(guān)系，本研究對289份豬血清進行中和抗體效價和E2抗體測定，比較分析二者的相關(guān)性；同時從中選取15份血清，測定血清對不同豬瘟病毒流行野毒株的中和效價。結(jié)果表明，從整體上說E2抗體水平與中和效價呈正相關(guān)。當群體中所有個體E2抗體阻斷率均大于60%時，才能保證群體70%以上免疫豬的中和抗體達到保護標準。本研究的結(jié)果有助于基層獸醫(yī)工作者更好地評估臨床中豬瘟疫苗的免疫保護狀況，降低豬瘟疫情發(fā)生風險。

關(guān)鍵詞： 豬瘟病毒；中和抗體；E2抗體；相關(guān)性

中圖分類號：S852.651；S852.43

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4590-07

收稿日期：2023-12-04

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2022YFD1800601；2022YFD1800605）

作者簡介：夏應(yīng)菊（1982-），女，四川成都人，博士，主要從事豬瘟及非洲豬瘟病毒檢測及免疫機制研究，E-mail：vet_xiayj@163.com；李 琰（1989-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士，主要從事動物疫苗檢驗及檢測方法研究，E-mail：liyannongda@foxmail.com。夏應(yīng)菊和李琰為同等貢獻作者

*通信作者：徐 璐，主要從事豬瘟診斷技術(shù)研究，E-mail：xulu777_ivdc@163.com; 劉業(yè)兵，主要從事動物病毒相關(guān)研究，E-mail：zjsliuyebing@163.com

Correlation Analysis of Neutralizing Antibody and E2 Antibody against Classical Swine

Fever Virus

XIA" Yingju1， LI" Yan1， LIU" Jun2， XU" Yuan1， LI" Fangtao1， ZOU" Xingqi1， LI" Qi1， LI" Jiaxin

1， ZHAO" Junjie1， ZHANG" Qianyi1， LIU" Yebing1*， XU" Lu1*

（1.National Reference Laboratory for Classical Swine Fever， China Institute of Veterinary Drug

Control， Beijing 100081，" China;

2.Liaoning Animal Disease Prevention and Control Center，Shenyang 110015， China）

Abstract： In order to explore the correlation between neutralizing antibody and E2 antibody against classical swine fever virus （CSFV）， 289 swine sera were detected using both neutralization assay and ELISA among which neutralizing antibody titers of 15 sera were further tested by neutralization assay using different CSFV strains. The results showed that E2 antibody level against CSFV was positive correlated with neutralizing antibody titer. When the individual percentage inhibition of E2 antibody was over 60%， the neutralizing antibody titer of more than 70% vaccinated pigs in the herd meet the protection standard. These results could help the local veterinaries to evaluate the efficacy of CSFV vaccine better in the field and reduce the risk of CSF outbreak.

Key words： classical swine fever virus; neutralizing antibody; E2 antibody; correlation

*Corresponding authors：" XU Lu， E-mail： xulu777_ivdc@163.com; LIU Yebing， E-mail： zjsliuyebing@163.com

豬瘟在我國屬重大動物疫病，為二類動物傳染病，也是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定必須通報的動物疫病。歷史上豬瘟曾給我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。自20世紀50年代，我國豬瘟兔化弱毒疫苗（又稱C株）的問世，為全球豬瘟的防控作出巨大貢獻，一些歐美國家利用該疫苗有效地控制了豬瘟，并最終實現(xiàn)了豬瘟的凈化。目前我國已多年未出現(xiàn)豬瘟大范圍暴發(fā)的情況，僅為點狀散發(fā)，且發(fā)病率逐年降低。但是，豬瘟依然是危害養(yǎng)豬業(yè)的潛在巨大風險。2018年9月3日，在日本岐阜暴發(fā)豬瘟疫情，結(jié)束了該國26年的豬瘟無疫狀態(tài)［1］。截至2022年11月，日本向世界動物衛(wèi)生組織報告豬瘟疫情3 425次，感染超過36.6萬頭，撲殺超過34.6萬頭，造成了巨大的經(jīng)濟損失，日本于2019年3月和10月重啟了豬瘟疫苗免疫，分別對野豬投放口服疫苗［2］和在豬場進行豬瘟活疫苗免疫［3］。豬瘟疫苗免疫是防控豬瘟最有效的方法，也是我國豬瘟防控的主要手段［4］。豬瘟疫苗免疫后，抗體水平監(jiān)測是評價免疫效果的唯一方法。豬瘟抗體檢測主要采用ELISA和病毒中和試驗兩種方法［5］。中和抗體水平更能夠反映抗體對免疫動物的保護效果。但中和抗體檢測方法較為復雜，耗時長，對實驗室條件和操作人員的技能水平要求較高，因此不適宜大規(guī)模推廣，目前，仍以ELISA方法檢測E2抗體為主。但E2抗體水平與中和抗體是否具有平行關(guān)系，E2抗體水平達到何種水平才能對免疫動物提供有效的保護，一直是困擾基層獸醫(yī)工作者的難點。本研究收集臨床豬血清，對E2抗體與中和抗體進行檢測，分析二者之間的關(guān)系，以期幫助基層獸醫(yī)工作者對豬瘟疫苗免疫效果進行評估，提高豬瘟防控水平。

1 材料與方法

1.1 材料

臨床豬血清樣本（289份），分別采自北京、河北等地7家養(yǎng)豬場按免疫程序開展豬瘟疫苗免疫的商品豬；豬瘟病毒C株（病毒含量106.5TCID50·mL-1）、豬瘟病毒HuB株（2.1亞型，病毒含量107.0TCID50·mL-1）、豬瘟病毒HeB株（2.2亞型，病毒含量105.2TCID50·mL-1）、豬瘟病毒SM株（1.1亞型，病毒含量104.0TCID50·mL-1）、豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體，均由國家豬瘟參考實驗室提供。

FITC標記羊抗小鼠IgG二抗購自Sigma公司；豬瘟病毒抗體檢測試劑盒（用于檢測豬瘟病毒E2抗體）購自IDEXX公司，貨號：99-432220。

1.2 方法

1.2.1 血清中和抗體效價測定

對289份臨床血清測定中和抗體效價。血清中和抗體效價采用半數(shù)中和稀釋度（neutralization dilution 50%，ND50）表示，以能夠抑制50%孔中的病毒感染細胞的血清最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示［6］。測定中和效價用毒株為豬瘟病毒C株。當中和抗體效價≥10ND50時，為豬瘟中和抗體陽性［5，7］。

1.2.2 E2抗體檢測

采用豬瘟病毒抗體檢測試劑盒進行檢測，計算抗體的阻斷率（percentage inhibition，PI）。當PI≤30%時，為E2抗體陰性；PI在30%～40%，為可疑；PI≥40%時，為E2抗體陽性。

1.2.3 血清對不同野毒株的中和效價測定

從臨床血清中選取15份抗體水平不同的血清，測定血清對不同野毒株的中和效價。該試驗操作在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所ABSL-3實驗室進行。

1.2.4 相關(guān)性分析

采用SPSS16.0軟件對臨床血清抗體阻斷率和中和抗體效價的對數(shù)進行Pearson相關(guān)系數(shù)分析及線性相關(guān)性分析［8-11］。將臨床血清E2抗體根據(jù)PI范圍分為5組（0～30%，30～40%，40～60%，60～80%，80～100%），計算各組內(nèi)血清的中和效價對數(shù)的平均值，繪制線性關(guān)系圖。

2 結(jié) 果

2.1 臨床血清中和效價

測定了289份臨床血清的中和效價，陰性66份，陽性223份，中和效價低于100 ND50的弱陽性血清75份，效價介于100～1 000 ND50的陽性血清96份，高于1 000 ND50的強陽性血清52份。

2.2 臨床血清ELISA結(jié)果

檢測臨床血清的豬瘟病毒E2抗體，陰性59份，可疑17份，陽性213份。E2抗體結(jié)果與中和試驗的符合率為86%，Kappa值為0.64，具有高度一致性。結(jié)果見表1。

2.3 相關(guān)性分析

將每份血清E2抗體阻斷率與中和效價的對數(shù)采用SPSS16.0軟件進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.759，為強相關(guān)（見表2），但二者的線性相關(guān)性較差，R2值僅為0.576，見圖1。

根據(jù)E2抗體阻斷率將289份臨床血清分為5組（阻斷率0%～30%，30%～40%，40%～60%，60%～80%，80%～100%），計算各組內(nèi)血清中和效價對數(shù)的平均值，結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，E2抗體檢測結(jié)果為陰性時（PI≤30%），中和效價對數(shù)均值僅為0.4，為中和抗體陰性（中和抗體陽性臨界值對應(yīng)的中和抗體效價對數(shù)為1）；隨著E2抗體水平的升高，中和效價對數(shù)值也逐漸升高。通過對各組抗體水平與中和效價對數(shù)平均值的線性分析可以看出，二者呈很好的線性相關(guān)，R2為0.9615，線性方程為y=0.535x+0.075（圖2）。

從上述結(jié)果可以看出，就單份血清來說，E2抗體水平與中和效價并無明顯的線性關(guān)系（圖1）；但若對所有血清進行整體分析，二者為強相關(guān)（表2）；對血清進行分組分析，不同范圍的E2抗體水平與中和效價的對數(shù)呈很好的正相關(guān)線性關(guān)系（圖2）。

有研究表明，豬瘟中和效價達到32ND50（效價對數(shù)為1.5）時，可作為中和保護的臨界值［12］。在E2抗體為陰性的76份血清中，有15份（近20%）的血清的中和效價高于32ND50；隨著阻斷率的逐漸升高，這一比例也逐漸升高。根據(jù)國家動物疾病強制免疫計劃中要求，豬瘟全年免疫抗體合格率應(yīng)在70%以上，如果以中和抗體效價達到32ND50作為免疫抗體合格標準，那么只有群體中所有個體E2抗體阻斷率均大于60%時，才能保證群體70%以上的動物中和抗體達到保護標準，結(jié)果見表3。

2.4 血清對不同野毒株的中和效價測定

為了進一步驗證E2抗體水平與中和效價之間的關(guān)系，選取15份抗體水平不同的血清測定對不同野毒株的中和效價，分析E2抗體與不同毒株中和效價之間的相關(guān)性。從表4中可以看出，1#～4#血清的E2抗體阻斷率均大于60%，對各個毒株的中和效價都高于32ND50，均達到免疫保護標準，且對SM毒株（1.1亞型）的中和效價高于HuB毒株（2.1亞型）和HeB毒株（2.2亞型）；5#～7#血清的抗體阻斷率為40%～60%，均為陽性，對各個毒株的中和抗體也均為陽性，但對各毒株的中和效價存在差異，且多數(shù)未達到32ND50的免疫保護標準；8#～15#血清的E2抗體阻斷率均小于40%，為可疑或陰性，對各個毒株的中和抗體存在很大差異，且未達到32ND50的免疫保護標準（除4#血清對HuB毒株外）。上述結(jié)果也說明，當阻斷率達到60%以上時，陽性血清對各個毒株的中和效價均高于32ND50，且對SM株（基因1.1型）的中和效價明顯高于基因2型毒株。

3 討 論

豬瘟C株疫苗免疫后72h即可產(chǎn)生堅強的免疫力，在免疫后7 d即可對動物產(chǎn)生完全的攻毒保護［13］，但中和抗體需在免疫后2周產(chǎn)生［14］。免疫前期，IL-6、IL-8和IFN-γ等細胞因子的短暫上調(diào)使免疫細胞得到了充分的刺激和活化，隨后誘導抗體大量分泌，說明C株疫苗在免疫前期對動物的保護主要是細胞免疫發(fā)揮作用［15］。隨著免疫時間的延長，動物體內(nèi)的抗體水平逐漸升高，抗體逐漸轉(zhuǎn)陽，體液免疫開始發(fā)揮主要作用。因此，在對豬瘟疫苗進行免疫效力評價時，抗體檢測是最主要的評價手段。

在進行豬瘟抗體檢測時，可采用ELISA方法和中和抗體檢測方法。用ELISA方法檢測的抗體和中和試驗檢測的抗體有所不同，前者檢測對象為與包被蛋白結(jié)合的特異性抗體；后者檢測的是所有具有中和活性的抗體，這種抗體可能由多種蛋白刺激機體產(chǎn)生。中和抗體不僅能與病毒粒子結(jié)合，同時還具有阻止病毒感染細胞的能力，因此中和抗體比ELISA方法檢測的抗體更能反映抗體對機體的免疫保護能力。在本研究中所采用的ELISA抗體檢測試劑盒的檢測目標為E2抗體，而中和試驗檢測的抗體不僅包含E2抗體，還包含其他蛋白（如Erns蛋白）產(chǎn)生的具有中和活性的抗體。從本研究的結(jié)果可以看出，E2抗體水平和中和抗體效價雖然呈正相關(guān)，但卻不呈精確的線性相關(guān)。通過對群體分析，二者在整體趨勢上保持一致。Seo等［16］測定了168份樣本的中和抗體和E2抗體，同樣證明從群體水平來說，隨著E2抗體水平的升高，中和抗體效價也相應(yīng)升高。目前，很多豬場都將E2抗體陽性作為判定豬群是否達到保護的標準，但從本研究結(jié)果可以看出，E2抗體陽性不代表能夠提供完全保護。通過對大量臨床血清的檢測結(jié)果進行分析，當豬群中所有免疫豬的E2抗體阻斷率都高于60%時，能夠保證70%以上豬的中和抗體效價達到32ND50的免疫保護標準。因此在生豬養(yǎng)殖的過程中，企業(yè)不能僅以試劑盒的臨界值作為判定抗體是否合格的標準，應(yīng)適當提高E2抗體檢測的內(nèi)控標準，從而保證疫苗誘導的抗體能對動物起到免疫保護作用。

豬瘟病毒只有一個血清型，囊膜糖蛋白E2蛋白作為主要免疫原性蛋白，可刺激宿主產(chǎn)生中和抗體［17］。根據(jù)不同毒株E2基因序列的差異，豬瘟被分為3個基因型，11個基因亞型［18］。我國所用豬瘟C株疫苗為1.1亞型，而流行毒株主要為基因2型，與疫苗存在一定的遺傳距離。試驗已經(jīng)證明C株疫苗免疫的陽性血清能夠與各種亞型豬瘟毒株E2蛋白發(fā)生反應(yīng)［19］，可對所有亞型毒株產(chǎn)生完全保護［20-21］，并且疫苗免疫陽性血清對不同毒株的中和能力有一定差別［22］，對SM株（1.1亞型）的中和效價高于流行野毒毒株（2.1亞型）［23］；不同毒株的E2抗體對同源毒株的中和效價高于異源毒株的中和效價［19］。另外，除了毒株差異外，其他因素也可能造成中和抗體效價差異，如動物的免疫時間，免疫后是否接觸野毒，免疫時仔豬母源抗體水平等多種因素都會導致中和抗體效價差異；即使采用相同劑量、相同毒株感染動物，也會由于個體差異導致臨床癥狀、病毒載量和中和抗體水平出現(xiàn)差異，臨床上呈現(xiàn)康復轉(zhuǎn)歸動物的中和抗體在感染后14 d均達到32ND50以上，但急性或慢性感染動物的中和抗體在感染后14 d為陰性［24］。

豬瘟疫苗C株安全、有效，為世界養(yǎng)豬業(yè)作出巨大貢獻。雖然豬瘟疫情已得到了有效控制，但對豬瘟的防控仍不可掉以輕心，一旦防控不到位，疫情仍有可能卷土重來，造成巨大的損失。因此，對于生豬養(yǎng)殖企業(yè)來說，對豬瘟抗體水平的持續(xù)監(jiān)測并設(shè)定合理的抗體免疫合格標準，能夠有效地防控豬瘟，提高豬群的整體健康水平。

4 結(jié) 論

4.1 通過對豬瘟病毒中和抗體效價和E2抗體水平測定，證明二者總體趨勢呈正相關(guān)。

4.2 當群體中所有個體E2抗體阻斷率均大于60%時，才能保證群體70%以上免疫豬的中和抗體達到保護標準。

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（編輯 白永平）