組蛋白去乙酰化酶抑制劑MGCD0103對小反芻獸疫病毒體外復(fù)制的影響

摘 要： 旨在探究組蛋白去乙?；福℉DACs）選擇性抑制劑MGCD0103（Mocetinostat）對小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）在山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（EEC細(xì)胞）復(fù)制的影響。本研究通過RT-qPCR法測定PPRV感染后宿主細(xì)胞HDACs和抑制劑處理細(xì)胞中PPRV N基因的轉(zhuǎn)錄水平，通過Time of Addition Assay確定MGCD0103在PPRV復(fù)制過程的作用階段，用Western blot檢測PPRV N蛋白的相對表達(dá)量，并采用TCID50方法測定了病毒滴度。結(jié)果表明，PPRV感染引起EEC細(xì)胞HDAC1（Plt;0.001）和HDAC2（Plt;0.002）轉(zhuǎn)錄水平明顯上升；MGCD0103在病毒入侵和復(fù)制階段均發(fā)揮了抑制作用，且在復(fù)制階段抑制作用更明顯；MGCD0103顯著降低PPRV N基因轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平及病毒滴度（Plt;0.002），且其抑制PPRV在EEC中的半數(shù)有效濃度（EC50）和藥物選擇指數(shù)（SI）分別是0.43 μmol·L-1和4.35。本研究確定MGCD0103顯著抑制PPRV的復(fù)制，這對研發(fā)有效抗PPRV藥物具有重要意義，為高效率產(chǎn)毒細(xì)胞株的構(gòu)建提供新思路。

關(guān)鍵詞： 組蛋白去乙酰化酶抑制劑；MGCD0103；抑制；小反芻獸疫病毒；病毒復(fù)制

中圖分類號：R978.7；S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4542-11

收稿日期：2023-12-11

基金項目：2022年甘肅省動物用生物制品創(chuàng)新聯(lián)合體項目（22ZD6NA012-1）；蘭州國家高新區(qū)“百園”行動專項

作者簡介：鄧瑞雪（1990-），男，甘肅臨洮人，博士，主要從事病毒與分子免疫學(xué)研究作，Email：drxd1@163.com

*通信作者：曾巧英，主要從事畜禽重大疫病病原微生物的分子致病機(jī)理及其免疫學(xué)研究，E-mail： zengqy@gsau.edu.cn；蒙學(xué)蓮，主要從事動物病毒分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail： mengxuelian@caas.cn

Suppressive Effect of Histone Deacetylase Inhibitor MGCD0103 on Peste Des Petits Rumants

Virus Replication in vitro

DENG "Ruixue1，2，3， PAN" Chunrong1，2，3， ZHU" Xueliang2， HU" Linjie2， SUN" Yuefeng

2， ZENG" Qiaoying1*， MENG" Xuelian2*

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.

State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Lanzhou Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046，" China;

3.China Agricultural Vet Biology

and Technology Co.， Ltd， Lanzhou 730046，" China）

Abstract：" In this study， the effect of MGCD0103 （Mocetinostat）， a selective HDACi， on the replication of peste des petits ruminants virus （PPRV） in goat endometrial epithelial cells （EEC cells） was investigated， aiming to clarify the role and activity of MGCD0103 in PPRV multiplication. The transcription levels of HDACs and PPRV N gene in different treated cells were determined by RT-qPCR， and the action stage of MGCD0103 in the viral proliferation cycle of PPRV was determined by the time of addition assay. The effect of MGCD0103 on the expression level of PPRV N protein and viral titer were further analyzed by Western blot and TCID50， respectively. The results showed that the mRNA expression levels of HDAC1 （Plt;0.001） and HDAC2 （Plt;0.002） were increased significantly in PPRV-infected EEC cells. Although MGCD0103 has an excellent inhibitory effect on PPRV multiplication， its inhibitory effect in the virus entry is limited. MGCD0103 significantly reduced the transcription and expression levels of PPRV N gene， as well as the viral titer （Plt;0.002）. The half-maximal effective concentration （EC50） and selectivity index （SI） of MGCD0103 against PPRV were 0.43 μmol·L-1 and 4.35， respectively. These results indicated that MGCD0103 significantly inhibited PPRV replication， which is of great significance for the development of anti-PPRV drugs and provides a new idea for constructing sensitive cell lines for PPRV proliferation.

Key words： histone deacetylase inhibitor; MGCD0103; inhibit; peste des petits ruminants virus; replication

*Corresponding authors：" ZENG Qiaoying， E-mail： zengqy@gsau.edu.cn; MENG Xuelian， E-mail： mengxuelian@caas.cn

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）感染山羊、綿羊等家養(yǎng)和野生小反芻動物引起的一種急性、接觸性、烈性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）認(rèn)定為必須申報的疫病，在我國被列為一類動物傳染病。PPR主要流行于以農(nóng)牧業(yè)為主的區(qū)域，這些區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展較為落后、單一，抗風(fēng)險能力較差，PPR的流行嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)穩(wěn)定 （DIALLO， 2006）。此外，PPR的感染物種和流行范圍仍在擴(kuò)大，野生反芻動物感染事件也時有發(fā)生。目前PPR的防控主要依靠減毒活疫苗免疫接種，疫苗接種對PPRV的暴發(fā)或大流行起很好的控制作用，但仍無可用的特效藥。有研究表明，一些植物提取物或者小分子化合物具有抗PPRV作用，如：金合歡或長葉蓼提取物和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（ECGG）［1-3］、銀納米顆粒（silver nanoparticles）［4］、化合物 4，4′-（arylmethylene）bis（1H-pyrazol-5-ols）［5］；霉酚酸（MPA）［6］、布喹那（brequinar，BQR）、來氟米特（leflunomide，LFM）、6-氮雜脲嘧啶（6-azauracil，6-AU）［7］等。因此，在PPR疫情防控態(tài)勢仍然嚴(yán)峻的情況下，開發(fā)一些可有效預(yù)防或/和治療PPR的藥物具有重要意義。

組蛋白乙?；福℉ATs）與組蛋白去乙?；福℉DACs）是調(diào)控蛋白質(zhì)乙酰化修飾水平的兩種拮抗作用的酶，通過添加或去除蛋白質(zhì)側(cè)鏈賴氨酸殘基上的乙酰基團(tuán)，改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。乙酰化修飾不僅參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等很多細(xì)胞過程，還影響免疫信號通路傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)［8］，這使得蛋白質(zhì)乙酰化位點成了眾多疾病新藥設(shè)計的有利靶標(biāo)。HDACs共分為四類，其中Ⅰ類（HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8）、Ⅱ類（HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10）、IV類（HDAC11）都屬于Zn2+依賴酶，而Ⅲ類（SirT1-7）屬于NAD+依賴酶。HDACs在控制病毒感染中扮演著關(guān)鍵角色，其抑制劑（HDACi）在調(diào)節(jié)病原體感染方面的研究也屢見不鮮。HDACi可抑制新冠病毒（SARS-CoV-2）RNA轉(zhuǎn)錄［9-10］、減少皰疹病毒（HSV）基因組的表達(dá)［11-13］、可抑制日本腦炎病毒（JEV）［14］和呼吸道合胞體病毒（RSV）［15］的復(fù)制，應(yīng)用HDACi激活潛伏期病毒，聯(lián)合其他藥物，以達(dá)到治愈持續(xù)性病毒感染疾病的目的［16-18］。MGCD0103是一種化學(xué)合成的選擇性小分子HDACi，對Ⅰ類和Ⅳ類HDAC具有高度特異性，對HDAC1抑制作用最強(qiáng)。研究表明，MGCD0103可通過線粒體途徑、自噬作用、與蛋白酶抑制劑協(xié)同作用或破壞微管的穩(wěn)定誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［19-22］。此外，MGCD0103可通過下調(diào)SARS-CoV-2的主要受體ACE2以及宿主蛋白-病原體蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的其他重要蛋白抑制病毒復(fù)制［23］。盡管越來越多的證據(jù)表明HDACi可影響多種病原的侵染過程，但關(guān)于MGCD0103能否影響PPRV在易感宿主細(xì)胞增殖的研究還未見報道。本研究將以山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（EEC細(xì)胞）作為靶細(xì)胞，從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平以及病毒效價來評價MGCD0103對PPRV復(fù)制的作用及抗病毒活性，為明確HDAC在PPRV感染中的作用和研發(fā)抗PPRV藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和細(xì)胞系

山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（EEC細(xì)胞）由本實驗室根據(jù)文獻(xiàn)［24］制備，小反芻獸疫病毒疫苗株Nigeria 75/1由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所支海兵研究員饋贈。

1.1.2 主要試劑

小鼠抗PPRV核衣殼蛋白（N蛋白）單克隆抗體由本實驗室制備；小鼠抗β-Actin單克隆抗體、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均購自Abcam公司（香港）；總RNA提取試劑Trizol購自生工生物工程（上海）股份有限公司；StarScript Ⅲ去基因組DNA反轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑和2×RealStar Fast染料法qPCR預(yù)混液購自康潤誠業(yè)生物科技有限公司（北京）；CCK-8 試劑盒購自白鯊生命科學(xué)（安徽）；Western及IP細(xì)胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)（上海）；BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（上海）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）購自博士德生物（武漢）；SuperKineTM增強(qiáng)型ECL發(fā)光液（皮克級）購自Abbkine Scientific Co.， Ltd（武漢）。

1.1.3 引物合成

利用oligo 6.31引物設(shè)計軟件，分別根據(jù)PPRV N基因序列和山羊的相關(guān)基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物，所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增殖

從液氮中取出凍存的細(xì)胞，置于37 ℃水浴鍋中快速解凍，離心棄掉上清，加入5 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2恒溫箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞豐度達(dá)90%時進(jìn)行傳代。

細(xì)胞豐度達(dá)到80%接種PPRV（MOI=0.01），置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h，而后棄掉含PPRV的培養(yǎng)液，用PBS洗滌，重新加入含2% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。每隔12 h觀察細(xì)胞病變（CPE）情況，當(dāng)CPE達(dá)80%左右，收集病毒培養(yǎng)液，分裝后于-80 ℃保存待用。

1.2.2 Time-of-addition （TOA） assay

利用time-of-addition （TOA） assay確定MGCD0103對PPRV復(fù)制周期的作用階段。在PPRV感染宿主細(xì)胞的不同時間段加入MGCD0103，具體分組如下。

A.“Full-time”處理組：用MGCD0103預(yù)處理細(xì)胞4 h，接種PPRV（MOI=0.01），換用新的含MGCD0103和2% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d。

B.“Entry”處理組：用MGCD0103預(yù)處理細(xì)胞4 h，接種PPRV（MOI=0.01），換用含2% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d。

C.“Post-entry”處理組：PPRV（MOI=0.01）接種細(xì)胞，換用含MGCD0103和2% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d。收集病毒培養(yǎng)物，分別檢測N基因轉(zhuǎn)錄水平、N蛋白表達(dá)量和病毒滴度。

1.2.3 熒光定量PCR檢測

收集病毒感染或者藥物處理的細(xì)胞樣品，提取總RNA，參照StarScript Ⅲ去基因組 DNA反轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑操作說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以cDNA為模板，利用2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix分別擴(kuò)增目的基因，以ACTB作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt計算目的基因相對表達(dá)量。

1.2.4 免疫印記（Western blot）分析

利用細(xì)胞裂解液處理病毒感染或者藥物處理的細(xì)胞樣品，測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，3% BSA室溫封閉2 h，TBST清洗后置于抗PPRV-N蛋白抗體（1∶1 000）或者抗ACTB（1∶5 000）抗體中4℃孵育過夜；同上洗滌后將PVDF膜置于山羊抗小鼠抗體（1∶5 000）中室溫孵育1 h；洗滌，ECL發(fā)光液顯色，Gel Doc XR+蛋白凝膠成像分析儀分析。

1.2.5 病毒滴度檢測

收集病毒培養(yǎng)物，凍融處理，10倍梯度稀釋后待檢。將Vero細(xì)胞鋪至96孔板，每孔3 000個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后棄掉上清，每孔加入50 μL稀釋好的病毒液和150 μL含2% FBS的DMEM/F12，逐日觀察并記錄細(xì)胞病變情況，至連續(xù)3 d無新培養(yǎng)孔細(xì)胞出現(xiàn)CPE，終止試驗，使用Reed-Muench法統(tǒng)計病毒滴度（TCID50·mL-1）。

1.2.6 抗病毒活性評價

1.2.6.1 細(xì)胞半數(shù)毒性濃度（CC50）測定：用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞后鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL（含1×104個細(xì)胞），37 ℃、5%濃度CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞豐度達(dá)70%時，試驗組每孔加入1 μL DMSO稀釋的不同濃度MGCD0103，對照組每孔加入1 μL DMSO，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。3 d后每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育1 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度，計算出各試驗組細(xì)胞活力。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活力為縱坐標(biāo)，利用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算細(xì)胞半數(shù)毒性濃度（CC50）。

1.2.6.2 半數(shù)有效濃度（EC50）測定：

利巴韋林（ribavirin）作為一種廣譜性抗病毒藥物，能夠抑制PPRV的感染［6，25］，選擇其為陽性對照藥物。當(dāng)細(xì)胞豐度達(dá)70%，分別用0.125、0.25、0.5、1和2 μmol·L-1 MGCD0103處理，4 h后試驗組換用含PPRV的培養(yǎng)液孵育，2 h后換為含不同濃度MGCD0103的新培養(yǎng)液，同時設(shè)置細(xì)胞對照組、未用藥物處理的PPRV對照組和濃度分別為64、128、256、512、1 024和2 048 μmol·L-1的陽性藥物利巴韋林對照組，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，收集病毒培養(yǎng)物，提取RNA，用RT-qPCR檢測PPRV N基因轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)PPRV N基因相對轉(zhuǎn)錄水平計算藥物對PPRV抑制率，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞病變抑制率為縱坐標(biāo)，利用Graphpad 8.0軟件繪制細(xì)胞病變抑制率的劑量依賴曲線，進(jìn)行回歸分析，計算藥物半數(shù)有效濃度（EC50）。

根據(jù)細(xì)胞半數(shù)毒性濃度（CC50）和抑制細(xì)胞產(chǎn)毒半數(shù)有效濃度（EC50）計算藥物選擇指數(shù)（SI）。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均進(jìn)行三次獨立重復(fù)，利用Graphpad Prism 8.0進(jìn)行單因素方差分析，組間差異用t檢驗分析，試驗結(jié)果用“x-±s”表示，Alpha 為 0.05，Plt;0.033 （*）、Plt;0.002 （**） 和Plt;0.001 （***）被認(rèn)為統(tǒng)計具有不同的顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 PPRV感染對宿主細(xì)胞組蛋白去乙?；皋D(zhuǎn)錄的影響

為了明確宿主細(xì)胞組蛋白去乙酰化酶（HDACs）是否影響PPRV感染過程，作者收集了PPRV感染3 d后的宿主細(xì)胞，提取總RNA，通過SYBR Green實時熒光定量RT-PCR檢測HDACs的相對轉(zhuǎn)錄水平，其中以未感染PPRV的宿主細(xì)胞組作為對照。分析qPCR數(shù)據(jù)可知，PPRV明顯提高了宿主細(xì)胞HDAC1（Plt;0.001）和HDAC2的轉(zhuǎn)錄水平（Plt;0.002）（圖1）。

2.2 MGCD0103對EEC細(xì)胞毒性作用檢測

為了確定MGCD0103在EEC細(xì)胞的最高工作濃度，使用CCK-8試劑盒對不同濃度MGCD0103對EEC細(xì)胞的毒性作用進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明：MGCD0103濃度等于2 μmol·L-1時，細(xì)胞活力為44.5%；MGCD0103濃度等于1 μmol·L-1時，細(xì)胞活力為65.9%；MGCD0103濃度小于0.5 μmol·L-1時，EEC細(xì)胞活力大于95%（圖2）。因此，選擇0.5 μmol·L-1作為MGCD0103在EEC細(xì)胞中的最高工作濃度。

2.3 MGCD0103對PPRV感染過程的影響

使用0.5 μmol·L-1 MGCD0103進(jìn)行TOA試驗，以確定MGCD0103影響PPRV侵染過程的具體階段。TOA結(jié)果表明，MGCD0103對PPRV復(fù)制具有明顯的抑制作用，其中對病毒吸附和入侵環(huán)節(jié)的抑制作用較弱，對進(jìn)入細(xì)胞后病毒復(fù)制的抑制作用較強(qiáng)（圖3）。

2.4 MGCD0103對PPRV N基因轉(zhuǎn)錄具有抑制作用

用0.125、0.25、0.5 μmol·L-1MGCD0103處理細(xì)胞并感染PPRV，培養(yǎng)3 d后收集樣品，提取RNA，使用SYBR Green實時定量PCR檢測PPRV N基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平。通過分析可知，當(dāng)MGCD0103濃度大于0.5 μmol·L-1，MGCD0103處理組PPRV N基因相對轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對照組（DMSO），差異顯著（0.25 μmol·L-1，Plt;0.002; 0.5μmol·L-1，Plt;0.001）（圖4A）。同時，用0.5 μmol·L-1 MGCD0103處理細(xì)胞并感染PPRV培養(yǎng)不同時間（1、2、3、4和5 d）的結(jié)果表明，感染3 d后藥物處理組PPRV N基因相對轉(zhuǎn)錄水平與對照組差異顯著（3 d，Plt;0.001；4 d和5 d，Plt;0.002）（圖4B）。

2.5 MGCD0103對PPRV N蛋白表達(dá)具有抑制作用

為了進(jìn)一步確認(rèn)MGCD0103對PPRV在EEC細(xì)胞中復(fù)制的作用，用0.125、0.25、0.5 μmol·L-1 MGCD0103處理細(xì)胞并感染PPRV，培養(yǎng)3 d后收集樣品，進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果表明，藥物處理組PPRV N蛋白表達(dá)量低于對照組，其中 0.50 μmol·L-1 MGCD0103作用引起的差異最大（圖5）。同時，用0.5 μmol·L-1 MGCD0103處理細(xì)胞并感染PPRV培養(yǎng)不同時間（1、2、3、4和5 d）的結(jié)果表明，藥物處理組PPRV N蛋白表達(dá)量低于對照組，感染病毒3 d時的差異最大（圖6）。

2.6 MGCD0103降低了PPRV的病毒滴度

病毒滴度是藥物抗病毒作用最重要的評判指標(biāo)。本試驗用0.125、0.25、0.5 μmol·L-1 MGCD0103處理細(xì)胞并感染PPRV，培養(yǎng)5 d后收集樣品，測算TCID50。結(jié)果表明，MGCD0103濃度大于0.25 μmol·L-1組的病毒滴度明顯低于對照組，差異顯著（0.25 μmol·L-1，Plt;0.002; 0.5 μmol·L-1，Plt;0.001）（圖7）。

2.7 MGCD0103抗PPRV活性

利巴韋林可以抑制DNA或RNA的合成，從而抑制病毒復(fù)制。因此，以利巴韋林作為抑制PPRV復(fù)制的陽性對照藥，通過添加不同劑量的MGCD0103，確定MGCD0103對50%宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性的濃度（CC50）和抑制50% PPRV復(fù)制的藥物半數(shù)有效濃度（EC50）。結(jié)果表明，MGCD0103對EEC細(xì)胞的CC50為1.87 μmol·L-1，而利巴韋林對EEC細(xì)胞的CC50大于2047.4 μmol·L-1；MGCD0103抑制PPRV復(fù)制的EC50為0.43 μmol·L-1，而利巴韋林對PPRV的EC50為450.4 μmol·L-1；計算得到MGCD0103在EEC細(xì)胞中抑制PPRV復(fù)制的藥物選擇常數(shù)為4.35，而利巴韋林在EEC細(xì)胞中抑制PPRV復(fù)制的藥物選擇常數(shù)為gt;4.55（圖8）。

3 討 論

HDACi主要被作為抗腫瘤藥物進(jìn)行廣泛使用。隨著對HDACi作用研究的不斷深入和擴(kuò)展，發(fā)現(xiàn)其在病毒復(fù)制方面也表現(xiàn)出重要作用。一些HDACi可抑制病毒復(fù)制，如：Vorinostat（SAHA）抑制人巨細(xì)胞病毒（HCMV）［26］，SAHA、CI994I、 RGFP966可抑制HCV病毒復(fù)制［27-28］，Tubacin可減弱JEV的復(fù)制［14］，Trichostatin A（TSA）/SAHA可顯著抑制RSV復(fù)制［15］。但值得關(guān)注的是，這些小分子化合物也可通過抑制HDAC的表達(dá)而促進(jìn)病毒復(fù)制，如：SAHA、TSA、MGCD0103和PCI34051顯著增加口蹄疫病毒（FMDV）復(fù)制［29］。此外，HDACi還表現(xiàn)出清除病毒感染的作用［30-31］。作為一種選擇性抑制劑，MGCD0103主要抑制HDAC1、2、3和11，其中對HDAC1抑制作用最強(qiáng)。Xu等［32］研究證明HDAC1顯著抑制豬流行性腹瀉病毒（PEDV）復(fù)制，同時影響ISG15和OAS等多種抗病毒基因的表達(dá)。本研究表明，PPRV感染可引起宿主細(xì)胞HDAC1和HDAC2轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，而用MGCD0103處理宿主細(xì)胞可以抑制PPRV N基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)且降低了病毒滴度，這提示MGCD0103對PPRV復(fù)制的抑制效果可能是其對HDAC1、2的抑制作用所致。PPRV和RSV同屬于副黏病毒科，F(xiàn)eng等［15］研究表明，RSV感染可促進(jìn)呼吸道上皮細(xì)胞（ACEs）中HDAC2的表達(dá)，降低了組蛋白乙?；挥肨SA和SAHA處理ACEs，可通過上調(diào)IFN-α相關(guān)通路顯著抑制RSV復(fù)制；用TSA和SAHA處理RSV感染的ACEs能明顯抑制RSV誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子（IL-6和IL-8）和氧化應(yīng)激相關(guān)分子（MDA和NO）的釋放，并且顯著抑制調(diào)控促炎基因表達(dá)和氧化應(yīng)激損傷的NF-κB、COX-2、MAPK和Stat3的活化，從而減少RSV誘導(dǎo)的呼吸道炎癥和氧化應(yīng)激。這與本研究的結(jié)果一致。Icardi等［33］研究表明HDAC1和HDAC2對Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的STAT3和ISGF3轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控存在相反作用，這表明HDAC1和HDAC2參與調(diào)控宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答。本研究表明，MGCD0103對PPRV的抑制作用貫穿病毒的整個生命周期，但對病毒進(jìn)入細(xì)胞后復(fù)制過程的作用最強(qiáng)。作者猜測：PPRV感染宿主細(xì)胞后，激活天然免疫從而抑制病毒復(fù)制，而MGCD0103可能對病毒激活宿主細(xì)胞天然免疫起到協(xié)同作用，這需要進(jìn)一步深入研究HDACs對PPRV復(fù)制機(jī)制的調(diào)控機(jī)制。

目前研究者主要利用Vero細(xì)胞或一些表達(dá)PPRV受體的細(xì)胞系研究PPRV的致病機(jī)制，借助易感宿主源細(xì)胞的研究較少［34-36］。PPRV的自然宿主主要是山羊、綿羊等小型反芻動物，EEC細(xì)胞是山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，它能支持PPRV的增殖，并具有明顯的細(xì)胞病理作用。此外，Tang等［24］研究發(fā)現(xiàn)，PPRV能有效誘導(dǎo)EEC細(xì)胞天然免疫反應(yīng)，EEC細(xì)胞是研究PPRV的一個合適的細(xì)胞模型，可用于病毒感染和先天免疫機(jī)制的研究。因此，本研究選擇山羊EEC細(xì)胞系比較MGCD0103處理后PPRV增殖變化，這更能反映MGCD0103對PPRV的實際作用。

雖然PPRV的防控主要依賴于疫苗接種，但也有研究表明一些藥物可以抑制PPRV的增殖［1-7，37-39］，這些藥物主要通過抑制病毒進(jìn)入［2-4］、影響病毒RNA合成［6-7，37，39］或者調(diào)控天然免疫通路［37］抑制PPRV復(fù)制。隨著對HDACi研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)HDACi通過競爭性抑制HDAC活性，從而提高組蛋白乙?；?、改變特定基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)、調(diào)控免疫通路，可作為一類新的防治病毒的藥物［14-15，26-28］。本試驗研究表明HDACs抑制劑MGCD0103對PPRV的復(fù)制具有抑制作用；在EEC細(xì)胞中，MGCD0103抑制PPRV復(fù)制的EC50為0.43 μmol·L-1，僅約為陽性對照藥物利巴韋林EC50（450.4 μmol·L-1）的千分之一，且MGCD0103的SI值（4.35）近似于利巴韋林的SI值（gt;4.55）。因此，以上結(jié)果提示MGCD0103是一種潛在的PPRV抑制劑，HDAC1和HDAC2可以作為新的藥物靶點用于抗PPRV藥物研發(fā)和育種。

4 結(jié) 論

PPRV感染可引起宿主HDAC1和HDAC2轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，抑制HDAC1、HDAC2的選擇性抑制劑MGCD0103可抑制小反芻獸疫病毒N基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和病毒復(fù)制，其EC50僅約為陽性對照藥物利巴韋林的千分之一，SI值近似于利巴韋林；作為一種抗腫瘤藥物，MGCD0103已用于臨床Phase 2研究階段；綜上所述，MGCD0103可顯著抑制PPRV的復(fù)制，可作為一種抗PPRV的候選藥物。

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（編輯 白永平）