牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ORF123基因缺失重組病毒的構(gòu)建及增殖能力分析

摘 要： 旨在通過缺失牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（LSDV）ORF123基因，分析其增殖能力，為LSDV ORF123功能研究奠定基礎(chǔ)。本研究利用同源重組，以O(shè)RF123基因作為靶標，增強型綠色熒光蛋白（EGFP）為篩選標記，采用融合PCR方法，擴增同源左右臂序列以及EGFP基因表達框，克隆至pUC-19T載體，構(gòu)建基因缺失轉(zhuǎn)移載體pH5-LSDVΔORF123-EGFP質(zhì)粒。然后將pH5-LSDVΔORF123-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細胞，并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株，利用蝕斑、梯度稀釋和挑取綠色熒光單克隆細胞篩選純化重組毒株，并鑒定其遺傳穩(wěn)定性和增殖能力。結(jié)果顯示，利用EGFP篩選標記，通過多次挑斑篩選純化獲得ORF123基因缺失的重組病毒株LSDVΔORF123-EGFP。該重組病毒至少在8代細胞傳代中能穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，接種MDBK細胞后繪制一步增殖曲線表明該重組病毒滴度略低于親本毒株。本研究成功獲得ORF123基因缺失的重組病毒株LSDVΔORF123-EGFP，為LSDV ORF123蛋白生物學(xué)功能研究以及減毒活疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒；ORF123基因；增殖能力；同源重組；重組病毒

中圖分類號：S852.654

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4530-12

收稿日期：2023-10-18

基金項目：國家自然科學(xué)基金（32302850）；甘肅省科技計劃資助（22JR5RA035）；甘肅省科技重大專項（22ZD6NA001）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所基本科研業(yè)務(wù)費（1610312021008）

作者簡介：王芳萍（1998-），女，甘肅天水人，碩士生，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究，E-mail：344884873@qq.com

*通信作者：萬學(xué)瑞，主要從事病原微生物分子生物學(xué)研究，E-mail：wanxr@gsau.edu.cn；任善會，主要從事草食動物病毒致病機制相關(guān)研究，E-mail： renshanhui@caas.cn

Construction and Growth Characteristics of ORF123 Deleted Lumpy Skin Disease Virus

Strain

WANG" Fangping1， REN" Shanhui2*， GAO" Xiaohong2， YANG" Xue1， LI" Jiyun3， WANG" Xiangwei2， YIN

Xiangping2， SUN" Yuefeng2， CHEN" Haotai2， WAN" Xuerui1*

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.

Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046，

China;

3.Qinghai Academy of Science and Technology， Xining 810003，" China）

Abstract：" The aim of this study was to analyze the growth characteristics of the Lumpy skin disease virus （LSDV） strain with the ORF123 gene deleted， which laid a foundation for the functional research of LSDV ORF123. ORF123 was used as the target gene and enhanced green fluorescent protein （EGFP）was used as the screening marker， the homologous left and right arm sequences and the EGFP gene expression frame were amplified and fused by overlapping PCR and cloned into pUC-19T vector to construct pH5-LSDVΔORF123-EGFP. The plasmid pH5-LSDVΔORF123-EGFP was then transfected into Vero cells and after that the cells were infected with the LSDV/CHA/FJ/2021 strain. The recombinant virus strain LSDVΔORF123-EGFP was purified through multiple plaque screening using EGFP as a screening markers， and its viral genetic stability and growth characteristics were characterized. The results revealed that the recombinant virus was able to stably express green fluorescent protein across at least 8 cell passages and the one-step growth curve following MDBK cell inoculation indicated that the titer of the recombinant virus was slightly lower than that of the parental strain. In conclusion， the recombinant virus strain LSDVΔORF123-EGFP was successfully obtained， which laid a foundation for the study of the biological function of LSDV ORF123 protein and the development of a live attenuated LSDV vaccine.

Key words： lumpy skin disease virus; ORF123 gene; growth characteristic; homologous recombination; recombinant virus

*Corresponding authors： WAN Xuerui，E-mail：wanxr@gsau.edu.cn；REN Shanhui，E-mail： renshanhui@caas.cn

牛結(jié)節(jié)性皮膚?。╨umpy skin disease，LSD）又稱牛疙瘩皮膚病，牛結(jié)節(jié)性皮炎、偽蕁麻疹或塊狀皮膚病，是牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）感染引起牛的一種急性、亞急性或慢性傳染?。?］。能夠引起牛發(fā)熱、淺表淋巴結(jié)腫大和皮膚、黏膜出現(xiàn)疙瘩樣結(jié)節(jié)或潰瘍，感染牛消瘦［2］。此外，感染LSD的牛群會出現(xiàn)短暫性或永久的不孕不育，妊娠母牛流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降，生產(chǎn)性能受到影響，常伴有繼發(fā)性細菌感染，嚴重時導(dǎo)致牛死亡［3］。LSD的暴發(fā)對全球養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展造成嚴重威脅，影響動物及動物產(chǎn)品的國際貿(mào)易［4］。因此，該病被世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）規(guī)定為必須通報的動物疫?。?］?！吨腥A人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》將其列為I類傳染病，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部暫時將其列為II類動物疫病進行防控［6-7］。

LSDV屬于痘病毒科（Poxviridae），羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV），同屬的病毒還有山羊痘病毒（Goatpox virus， GTPV）和綿羊痘病毒（Sheeppox virus， SPPV）［8］。LSDV基因組是含有156個開放閱讀框（open reading frame， ORF）的雙股囊膜DNA，大小約151 kb，由核心編碼區(qū)和反向末端重復(fù)序列組成［9］。其中編碼26個保守基因，參與病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄；編碼7種ChPV基因同源物，是DNA復(fù)制所必需的；編碼30種痘病毒蛋白的同源物，參與病毒體形態(tài)發(fā)生和組裝；編碼5種含有錨蛋白重復(fù)序列的蛋白質(zhì)；有9個與毒力和宿主范圍功能相關(guān)的基因；還有參與宿主免疫逃逸有關(guān)的基因［10-11］。目前，國內(nèi)外對LSDV的研究相對較少，目前對LSDV生物學(xué)特性的了解大多來源于痘苗病毒（VACV）及其它痘病毒科成員。LSDV ORF123基因全長558 bp，編碼196個氨基酸。前期本實驗室通過構(gòu)建LSDV各基因的真核表達質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報告基因篩選出能明顯抑制宿主天然免疫的蛋白，即LSDV ORF123為目的蛋白進行研究［12］。有文獻報道，推測LSDV ORF123是細胞外包膜病毒（extracellular enveloped virus，EEV），主要為結(jié)構(gòu)或參與病毒體形態(tài)發(fā)生和組裝的痘病毒蛋白的同源物。預(yù)測LSDV ORF123與黏液瘤病毒（Myxoma Virus，MYXV）的M121R和VACV A33R基因相似［10-11］。M121R的功能未知，A33R是一種高度保守的II型整合胞外囊膜糖蛋白，存在于高爾基復(fù)合體、細胞表面和病毒外膜中，在肌動蛋白微絨毛的形成及痘苗病毒在細胞間的傳播中起關(guān)鍵作用［13-16］。參考文獻［17］方法，通過生物信息學(xué)方法對LSDV ORF123基因進行初步了解。發(fā)現(xiàn)ORF123是一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有跨膜結(jié)構(gòu)、無信號肽的親水性蛋白，理論等電點為4.76且有10個絲氨酸（Ser）、8個蘇氨酸（Thr）和4個酪氨酸（Tyr）的磷酸化位點大于閾值，可能是該蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點。因此，本研究嘗試將LSDV/FJ/CHA/2021毒株的ORF123基因作為研究靶標，構(gòu)建含有增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的轉(zhuǎn)移載體，通過同源重組純化獲得重組病毒，分析其增殖能力，為研究LSDV ORF123生物學(xué)功能及減毒活疫苗的研制提供候選毒株。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細胞系、載體及菌株

LSDV/FJ/CHA/2021病毒株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所（LVRI）實驗室分離保存（GenBank 登錄號：OP752701）；非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）、牛腎細胞（MDBK細胞）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所本實驗室保存；pUC-19T載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所本實驗室保存；DH5α感受態(tài)細胞購自深圳康體生命有限公司。上述所有病毒和細胞均經(jīng)過支原體檢測，結(jié)果呈現(xiàn)陰性。

1.2 主要試劑與設(shè)備

胎牛血清（FBS），諾萊和上海逍鵬生物有限公司（貨號CF602/C04001-500）；DMEM培養(yǎng)基，健碩生物科技有限公司（貨號66001-20012）；無鈣鎂PBS緩沖液購自上海逍鵬生物科技有限公司（Vivacell）（貨號C3593）；支原體檢測試劑盒，上海翊圣生物有限公司（貨號40601ES20）；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，南京諾唯贊生物科技有限公司（貨號P505d1）；快速克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司（貨號C112）；限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH Ⅰ 購自NEW ENGLAND Biolabs有限公司（貨號#R3142S和#R0136S）；TIANamp Virus DNA/RNA Kit病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，TIANGEN公司（貨號DP315）；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司（貨號D2500-02）；質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN公司（貨號DP1053）；細胞轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME購自Poly plus公司（貨號DP105-3）；Leica激顯微鏡（型號EVOS M5000）；ORF123、ORF29單克隆抗體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所本實驗室制備；GFP抗體購自ProteinTech公司（貨號50430-2-AP）；HRP標記的山羊抗小鼠IgG（CW0102S）和山羊抗兔IgG（CW0103S）購自康為世紀有限公司。

1.3 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)LSDV/FJ/CHA/2021病毒株的ORF123基因序列，使用SnapGene軟件設(shè)計ORF123同源重組左臂（719 bp）和右臂（763 bp）的上、下游引物，結(jié)合LSDV特異性啟動子及ORF123基因序列，設(shè)計轉(zhuǎn)移載體pUC19T-EGFP-ΔORF123（1 159 bp）引物對。引物由南京金唯智生物有限公司合成（表1）。

1.3.2 分段PCR的擴增

以提取LSDV/FJ/CHA/2021病毒株的DNA為模板，使用高保真酶和上述引物進行PCR擴增左、右同源臂。以質(zhì)粒pUC-19T為模板，引物EGFP-F、EGFP-R擴增轉(zhuǎn)移載體EGFP。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×phanta Max Buffer 25 μL、dNTP Mix 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、模板DNA 1 μL、上/下游引物各2 μL、ddH2O 18 μL。PCR條件反應(yīng)：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸60 s，共34個循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，將目的片段用膠回收試劑盒回收并測定核酸濃度。

1.3.3 融合PCR擴增

將鑒定正確的左、右同源臂和EGFP目的片段進行二段式融合PCR。第一輪預(yù)融合PCR，40 μL擴增體系：模板各1.5 μL（左同源臂+EGFP和EGFP +右同源臂）、2×phanta Max Buffer 20 μL、dNTP Mix 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、上/下游引物ORF123L-F、EGFP-R和EGFP-F、ORF123R-R各2 μL、ddH2O 各12.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸2 min，共34個循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，將目的片段膠回收后并測定核酸濃度。第二輪正式融合，以預(yù)融合產(chǎn)物為模板，40 μL擴增體系：模板1.5 μL、2×phanta Max Buffer 20 μL、dNTP Mix 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、上/下游引物ORF123L-F、ORF123R-R各2 μL、ddH2O 12.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸3 min，共34個循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，將目的片段膠回收后并測定核酸濃度。

1.3.4 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與鑒定

用Kpn I和BamH Ⅰ 將pUC-19T載體進行雙酶切，利用同源重組試劑盒將左同源臂、EGFP表達框及右同源臂片段克隆至pUC-19T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)后，涂布于含有氨芐2YT固體平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落搖菌，經(jīng)PCR鑒定后，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后，送至上海生工生物工程有限公司進行測序，將陽性質(zhì)粒命名為pH5-LSDVΔORF123-EGFP。

1.4 LSDV ORF123缺失重組病毒的構(gòu)建

當6孔板中的Vero細胞密度為70%～80%時，利用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑，將pH5-LSDVΔORF123-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細胞，18 h后用2 μL LSDV/FJ/CHA/2021（TCID50為106.25·mL-1）感染細胞，同時以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒但未感染LSDV的細胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒未感染W(wǎng)T-LSDV的細胞作為對照。感染12、24以及48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞病變及綠色熒光情況，60 h左右收取細胞和病毒混合液，將其命名為LSDVΔORF123-EGFP，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒的篩選與純化

將收集到的病毒LSDVΔORF123-EGFP于-80℃反復(fù)凍融3次，接種于6孔板的MDBK細胞中，觀察細胞病變及熒光情況，3 d后選取病變不明顯、熒光灶多且亮的孔進行蝕斑，棄去6孔板的培養(yǎng)基，加入2 mL 2%甲基纖維素和10% FBS DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，形成病毒蝕斑后，挑取有熒光的蝕斑置于1.5 mL離心管中，保存于-80℃冰箱；將單個蝕斑病毒按10倍梯度稀釋接種于96孔板的MDBK細胞，觀察病變及熒光情況，3 d后用封口膜封住細胞培養(yǎng)板，凍存于-80℃冰箱備用；選取稀釋倍數(shù)最高的熒光孔挑取單克隆細胞，棄去熒光孔的細胞培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化1 min，加入1 mL DMEM培養(yǎng)基稀釋于3.5 cm的細胞培養(yǎng)皿，置于熒光顯微鏡下，在視野中找到單個熒光細胞用2 μL移液搶吸取，置于含有600 μL DMEM培養(yǎng)基的離心管中，接種于96孔板的MDBK細胞或-80℃冰箱保存，繼續(xù)進行下一輪病毒篩選和純化。

1.6 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒的鑒定

1.6.1 重組病毒PCR鑒定

將單個純化的病毒在MDBK細胞上增殖后提取重組病毒DNA，用目的基因ORF123引物對F1： 5′-CCAAAGAGTGGAACTGAAACAGATTATG-3′和R1： 5′-CACA-GTAATAGCTTCTCATCTCATCG-3′以及引物對F2： 5′-GTTTTTCCTTAAACCTATTCATC-3′和R2：5′-GGTTTGTCTATTTAATGACTTCATTT-ATAG-3′ 進行PCR鑒定，鑒定后將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，測序上下游引物為F2/R2，將完全純化的重組病毒命名為LSDVΔORF123-EGFP。

1.6.2 重組病毒W(wǎng)estern blot驗證

將純化的重組病毒感染MDBK細胞，以感染親本毒株WT-LSDV的MDBK細胞和未感染的MDBK細胞作為對照，用ORF123（1∶2 000）、ORF29（1∶2 000）單克隆抗體和GFP（1∶2 000）分別作為一抗，以HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）作為二抗。通過ECL發(fā)光顯示后，進行Western blot分析。

1.7 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒滴度測定

96孔細胞培養(yǎng)板中MDBK細胞長至90%時，以10-1～10-10梯度稀釋重組病毒LSDVΔORF123-EGFP，每孔加入稀釋病毒液100 μL，一個梯度做8孔重復(fù)，將96孔培養(yǎng)板置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察和記錄出現(xiàn)細胞病變的細胞孔數(shù)，連續(xù)觀察5 d并計算TCID50。

1.8 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒一步增殖曲線測定

將重組病毒LSDVΔORF123-EGFP與親本毒株WT-LSDV接種MDBK細胞，分別在培養(yǎng)24、48、72和96 h收取培養(yǎng)基上清液測定其TCID50并繪制病毒增殖曲線。

1.9 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒的遺傳穩(wěn)定性

將純化的重組病毒LSDVΔORF123-EGFP在MDBK細胞上連續(xù)培養(yǎng)8代，定期觀察細胞狀態(tài)與熒光情況。

1.10 生物安全聲明

LSDV細胞感染的相關(guān)實驗均在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所完成，整個試驗過程，嚴格按照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所的3級生物安全實驗室的操作指南進行。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1.1 分段PCR擴增結(jié)果

利用3對特異性引物（表1）擴增同源重組左右臂和EGFP基因表達框（圖1）。同源重組左、右臂基因片段的擴增大小與預(yù)期的719 bp和763 bp相符，以及EGFP基因表達框的擴增大小與預(yù)期的1 159 bp相符（圖2）。

2.1.2 融合PCR擴增

將左、右同源臂和EGFP表達框膠回收產(chǎn)物按照1∶1比例進行融合PCR擴增，ORF123L和EGFP大小與預(yù)期的1 878 bp相符（圖3A）。同時，EGFP和ORF123R大小與預(yù)期的1 928 bp相符，最后三段融合后擴增大小與預(yù)期的2 641 bp相符（圖3B）。

2.1.3 菌液PCR鑒定

利用同源重組技術(shù)，將融合PCR擴增產(chǎn)物克隆至pUC-19T雙酶切載體（圖4A）。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后，涂布于2YT固體平板，于37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落搖菌，6 h后進行菌落PCR鑒定（圖4B）。將陽性單克隆菌落提取質(zhì)粒，并送上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序正確的單克隆菌株命名為pH5-LSDVΔORF123-EGFP。

2.2 LSDV ORF123缺失重組病毒的構(gòu)建

將pH5-LSDVΔORF123-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細胞，18 h后用2 μL LSDV/FJ/CHA/2021（TCID50為106.25·mL-1）感染細胞，使LSDV與轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA之間發(fā)生同源重組，感染12 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞病變及綠色熒光情況（圖5）。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒且感染W(wǎng)T-LSDV病毒的Vero細胞出現(xiàn)綠色熒光，熒光灶隨著感染LSDV時間延長而逐漸變亮、增多，將其命名為LSDVΔORF123-EGFP，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒但未感染W(wǎng)T-LSDV和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒未感染W(wǎng)T-LSDV的Vero細胞均未出現(xiàn)熒光。

2.3 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒的篩選與純化

將收集的病毒LSDVΔORF123-EGFP于-80℃反復(fù)凍融后，接種于MDBK細胞，72 h使用熒光顯微鏡觀察并標記，利用蝕斑、梯度稀釋和挑取綠色熒光單克隆細胞對LSDVΔORF123-EGFP基因缺失重組病毒進行純化。通過熒光顯微鏡進行觀察，每輪挑取單個帶熒光的病毒進行下一輪篩選與純化（圖6）。

2.4 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒的鑒定

2.4.1 PCR鑒定LSDVΔORF123-EGFP重組毒株的純化程度

對最后一輪純化的重組病毒提取總DNA進行PCR擴增，擴增所用的上、下游引物為ORF123引物對F1/R1和F2/R2進行PCR鑒定（圖7A），用引物對F1/R1鑒定時，LSDVΔORF123-EGFP中不能擴增出558 bp左右的目的條帶，表明篩選的重組病毒中沒有親本毒株（WT-LSDV），則重組病毒純化成功。用引物對F2/R2鑒定時，同時出現(xiàn)1 118 bp和800 bp左右的目的條帶，表明重組病毒沒有純化成功，出現(xiàn)單一的1 118 bp左右的目的條帶，則重組病毒純化成功（圖7B）。純化成功的重組病毒DNA送至上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序成功的重組病毒命名為LSDVΔORF123-EGFP。

2.4.2 Western blot驗證

將純化的重組病毒感染MDBK細胞，以感染W(wǎng)T-LSDV的MDBK細胞和未感染的MDBK細胞作為對照，經(jīng)Western blot檢測可見ORF123單克隆抗體檢測不到重組病毒而ORF29單克隆抗體與重組病毒在39 ku出現(xiàn)特異性蛋白條帶，GFP抗體在重組病毒25 ku左右檢測到特異性蛋白條帶。進一步表明WT-LSDV中ORF123基因已成功被缺失且在重組病毒中穩(wěn)定遺傳并正確表達（圖8）。

2.5 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒滴度測定

根據(jù)細胞病變記錄結(jié)果，計算出LSDVΔORF123-EGFP重組病毒株的TCID50為104.5·mL-1。

2.6 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒增殖曲線

在不同時間點收集細胞上清進行病毒滴度測定（圖9）。LSDVΔORF123-EGFP重組病毒TCID50在48 h達到103.5·mL-1，72 h 的TCID50為104.5·mL-1，96 h 的TCID50為104·mL-1，由增殖曲線可知傳代收毒的復(fù)制平臺期為接毒后的72 h左右。

2.7 LSDVΔORF123-EGFP重組病毒的遺傳穩(wěn)定性

將純化的重組病毒LSDVΔORF123-EGFP在MDBK細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)8代，觀察熒光顯示該重組病毒能穩(wěn)定遺傳并正確表達綠色熒光蛋白（圖10）。

3 討 論

LSD已在多個國家和地區(qū)傳播，根據(jù)LSDV病原學(xué)特點和流行現(xiàn)狀分析，其流行趨勢仍在繼續(xù)，疫病暴發(fā)國家不斷增加。目前尚無治療LSDV的特效藥，定期接種安全、有效的疫苗，建立足夠的群體免疫力是防控LSD最有效的途徑［18-19］。許多國家接種弱毒疫苗進行預(yù)防和控制，弱毒活疫苗大多是將自然分離的毒株通過細胞培養(yǎng)或動物傳代使其毒力致弱而形成［20］。LSDV與羊痘病毒具有97%的序列同源性，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部使用山羊痘或綿羊痘減毒活疫苗緊急免疫接種［21］?？紤]到痘病毒觸發(fā)宿主免疫主要依賴于細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，盡快在LSD減毒活疫苗研制方面取得突破，研制出安全有效的LSDV減毒活疫苗是防控該病的重要手段。

在LSD疫苗研究中，減毒活疫苗是目前研究的熱點。有效的基因缺失標記疫苗是區(qū)分疫苗免疫和野毒株感染的重要手段，LSDV含有許多潛在與宿主免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的非必需基因，很有可能通過缺失單個或多個非必需基因來降低毒力，增強機體對病毒的免疫應(yīng)答；也可通過靶向分子修飾來提高疫苗的免疫原性，減少疫苗引起的不良反應(yīng)［22］。有文獻報道，研究人員已通過同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了幾種基因缺失重組病毒。Kara等［23］和Boshra等［24］依次缺失LSDV ORF005和ORF008基因，臨床試驗表明，缺失株能有效刺激接種牛的中和抗體水平；Chervyakova等［25］以LSDV-Dermatitis nodulares/2016/Atyrau/KZ分離株為親本，敲除LSDV005、LSDV008、LSDV066和LSDV142基因，該重組病毒在LT、MDBK和SK細胞中能有效復(fù)制且在10代后保持遺傳穩(wěn)定?；蛉笔мD(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的構(gòu)建是篩選同源重組病毒的先決條件。由于LSDV病毒基因組全長約為151 kb，核苷酸組成中G+C含量很低。因此本試驗采用同源重組技術(shù)和融合PCR方法構(gòu)建基因缺失重組病毒，從而提高重組病毒構(gòu)建效率。融合PCR是一種高效的將不同基因片段通過PCR方法連接起來的特殊PCR［26］。同源重組是利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入到細胞，并感染W(wǎng)T-LSDV，使外源基因插入到缺失基因的位置上。

LSDV ORF123基因編碼196個氨基酸，是EEV外膜中的蛋白質(zhì)，在病毒組裝和形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用［27］。因此，本研究選取ORF123基因作為目的基因，以增強型綠色熒光蛋白EGFP基因為篩選標記，構(gòu)建ORF123基因缺失重組病毒。由于LSDV基因組中G＋C含量約為27％，導(dǎo)致PCR擴增融合過程中效率較低。因此，本試驗采用分段克隆的方式構(gòu)建同源重組載體，首先利用PCR方法從LSDV病毒基因組DNA中擴增ORF123基因同源重組左臂ORF123L和右臂ORF123R，以質(zhì)粒pmH5ΔTK為模板，擴增EGFP基因，然后通過融合PCR擴增ORF123L＋EGFP基因和EGFP＋ORF123R基因。考慮到多片段重組效率較低，因此采用Overlap PCR方法先將ORF123L＋EGFP基因及EGFP＋ORF123R基因進行融合后克隆至pUC-19T載體中，成功構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pH5-LSDVΔORF123-EGFP重組質(zhì)粒。為提高轉(zhuǎn)染效率，使用Vero細胞用于LSDV的培養(yǎng)。利用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑將pH5-LSDVΔORF123-EGFP質(zhì)粒至Vero細胞，18 h后接種LSDV/FJ/CHA/2021病毒液感染細胞，感染12 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞病變及綠色熒光情況，60 h左右收取細胞和病毒混合液。利用宿主細胞MDBK對重組病毒進行篩選純化。在重組病毒篩選純化過程中，將帶熒光的重組病毒從沒有帶熒光的親本病毒中怎樣才能更快、更有效地分離純化出來并非易事。本研究采用了蝕斑法、梯度稀釋和挑取綠色熒光單克隆細胞3種方法相互結(jié)合來提高篩選和純化病毒效率。經(jīng)PCR及Western blot鑒定已成功構(gòu)建LSDVΔORF123-EGFP基因缺失重組毒株。增殖能力分析表明，重組病毒在MDBK細胞中有效復(fù)制且至少在8代內(nèi)保持其遺傳穩(wěn)定性；在MDBK細胞上測定該重組病毒的TCID50為104.5·mL-1；在不同時間點收集細胞上清測定重組病毒滴度繪制增殖曲線，獲得重組病毒滴度略低于親本毒株且該重組病毒傳代收毒的復(fù)制平臺期為接毒后的72 h左右。因此，基于重組病毒LSDVΔORF123-EGFP增殖能力分析，后期本課題組計劃進行動物試驗明確其毒力與安全性和免疫效力的深入研究。

4 結(jié) 論

本研究以LSDV ORF123基因為靶標，利用同源重組技術(shù)，用增強型綠色熒光蛋白基因替換ORF123基因成功構(gòu)建了LSDVΔORF123-EGFP重組病毒，通過多次挑斑篩選純化獲得了ORF123基因缺失的重組病毒LSDVΔORF123-EGFP，病毒增殖曲線表明，病毒最佳收集時間是在感染后72 h左右且重組病毒株至少在8代細胞傳代中能穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，為LSDV ORF123蛋白生物學(xué)功能研究以及減毒活疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)，進一步為后續(xù)LSDV研究奠定良好的試驗平臺和技術(shù)。

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（編輯 范子娟）