應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)構(gòu)建牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒缺失TK基因毒株

摘 要： 利用同源重組技術(shù)及Cre-LoxP系統(tǒng)平臺(tái)，構(gòu)建牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus， LSDV）缺失TK基因毒株，為研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供備選毒株。以TK基因?yàn)榘谢?，利用Cre-LoxP系統(tǒng)平臺(tái)，紅色熒光蛋白（RFP）為篩選標(biāo)記，采用重疊PCR方法擴(kuò)增左、右同源臂以及RFP基因表達(dá)框并進(jìn)行融合，將其克隆至pUC19T載體，構(gòu)建基因缺失轉(zhuǎn)移載體pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。將轉(zhuǎn)移載體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株，構(gòu)建LSDV-ΔTK-RFP重組病毒。采取蝕斑法、有限稀釋法純化LSDV-ΔTK-RFP。然后，利用Cre-LoxP系統(tǒng)，在MDBK-Cre細(xì)胞中從病毒基因組中切除RFP標(biāo)簽，采取蝕斑法和有限稀釋法篩選并純化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及測(cè)序方法對(duì)重組毒株進(jìn)行鑒定，并測(cè)定其一步生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明成功構(gòu)建缺失TK基因的重組毒株（LSDV-ΔTK），重組毒株復(fù)制力略低于野生毒株。應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)構(gòu)建的缺失TK基因LSDV毒株，具有良好的遺傳穩(wěn)定性和復(fù)制生長(zhǎng)特性，為后續(xù)LSDV基因工程疫苗的研制提供了候選毒株，同時(shí)拓展了Cre-LoxP系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。

關(guān)鍵詞： 牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒；TK基因；Cre/LoxP系統(tǒng)；重組毒株

中圖分類號(hào)： S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4517-13

收稿日期：2023-11-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（32302850）；甘肅省科技計(jì)劃資助（22JR5RA035）；甘肅省科技重大專項(xiàng)（22ZD6NA001）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（1610312021008）

作者簡(jiǎn)介：張玉哲（1999-），男，甘肅寧縣人，碩士生，主要從事草食動(dòng)物病毒病感染致病機(jī)制研究，E-mail：1156928206@qq.com

*通信作者：萬(wàn)學(xué)瑞，主要從事病原微生物分子生物學(xué)研究，E-mail： wanxr@gsau.edu.cn

Application of the Cre-LoxP System to Construct the Deleted TK Gene of the Lumpy

Skin Disease Virus

ZHANG Yuzhe1， REN Shanhui2， YAO Wei3， GONG Zhenli2， ZHANG Hongqiang1， LIU Minyi

1， YOU Ting1， WANG Xiangwei2， LI Jiyun4， YIN Xiangping2， SUN Yuefeng2， CHEN Haotai2， WAN Xuerui1*

（1.Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.Lanzhou Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046，" China;

3.Animal Husbandry Industry

Development Center， Wanzhou District， Chongqing 400000，" China;

4.Institute of Science and Technical

Information of Qinghai Province， Xining 810003，" China）

Abstract：" A TK-deficient Lumpy skin disease virus （LSDV） strain was constructed by homologous recombination technology and the Cre-LoxP system platform to provide an alternative strain for developing a safe and efficient LSDV genetic engineering vaccine. Using the TK gene as the target gene， using the Cre-LoxP system platform and red fluorescent protein （RFP） as screening marker， the left and right homologous arms and RFP gene expression cassettes were amplified by overlapping PCR and fused， and then cloned into pUC19T vector to construct gene deletion transfer vector pUC19T-LSDVΔTK-RFP. The transfer vector recombinant plasmid was transfected into Vero cells and infected with LSDV/CHA/FJ/2021 strain to construct LSDV-ΔTK-RFP recombinant virus. LSDV-TK-RFP was screened and purified by the plaque method and limited dilution method. Then， using the Cre-LoxP system， RFP tags were cut off from the viral genome in MDBK-Cre cells， and LSDV-TK strains were screened and purified by the plaque method and limited dilution method. PCR and sequencing identified the recombinant strain， and its one-step growth curve was determined. The recombinant strain （LSDV-ΔTK） with deletion of the TK gene was successfully constructed， and the replication ability of the recombinant strain was slightly lower than that of the wild-type strain. The LSDV strain with deletion of the TK gene constructed by the Cre-LoxP system has good genetic stability and replication growth characteristics， so it can be used as an alternative strain for the development of the LSDV genetic engineering vaccine and expands the application range of the Cre-LoxP system.

Key words： lumpy skin disease virus; TK gene; Cre-LoxP system; recombinant virus

*Corresponding author：" WAN Xuerui， E-mail： wanxr@gsau.edu.cn

牛結(jié)節(jié)性皮膚病（lumpy skin disease，LSD）也叫牛結(jié)節(jié)性皮炎、牛疙瘩皮膚病、牛結(jié)節(jié)疹等，是由屬痘病毒科（Poxvirdae）脊椎動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）山羊痘病毒屬（Capripoxvirus， CPV）的牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）感染牛后所致的急性、亞急性或慢性傳染病［1-2］。LSD主要臨床癥狀為發(fā)熱、口咽部、乳房、生殖器、直腸黏膜等區(qū)域出現(xiàn)特征性結(jié)節(jié)［3］。LSD的發(fā)病率為5%～45%，病死率不定，最高可達(dá)20%［4］。1929年，非洲贊比亞最早報(bào)道了牛結(jié)節(jié)性皮膚病，隨后該病相繼在不同國(guó)家和地區(qū)發(fā)生。2019年8月，該病首次在我國(guó)新疆伊犁被報(bào)道，且陸續(xù)在福建、江西、安徽、云南、浙江及廣東等14個(gè)省、市、自治區(qū)均有暴發(fā)［5］。LSD疫情現(xiàn)已呈世界性流行，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health， WOAH）規(guī)定必須通報(bào)的傳染病。目前，我國(guó)將牛結(jié)節(jié)性皮膚病由一類動(dòng)物疫病調(diào)整為二類動(dòng)物疫病［6］。

LSDV是線性雙鏈有囊膜的DNA病毒，呈現(xiàn)典型的“磚型”或“大卵圓型”，病毒基因組大小約為151 kb，高AT含量約73%，由中央編碼區(qū)和兩端反向末端重復(fù)序列（2.4 kb）組成，編碼156個(gè)預(yù)測(cè)基因［7］。其只有1個(gè)血清型，代表毒株為南非Neethling株［8］。由于CaPVs之間的交叉保護(hù)，來(lái)自綿羊或山羊的分離株可以交叉保護(hù)牛免受LSD感染，且LSDV分離株可以不同程度地保護(hù)綿羊和山羊免受SPPV和GTPV的感染［9-10］。使用LSD減毒活疫苗接種是控制疾病的一種有效手段，目前，LSD流行國(guó)家主要使用GTPV或LSDV弱毒疫苗進(jìn)行預(yù)防，但GTPV、SPPV和LSDV之間的免疫交叉保護(hù)力需要進(jìn)一步評(píng)估［9］。

Cre-loxP系統(tǒng)由Cre重組酶和Loxp位點(diǎn)兩部分組成，Cre重組酶來(lái)源于P1噬菌體，是λInt酶超基因家族成員之一。其具有DNA內(nèi)切酶和重組酶活性，單個(gè)的重組酶蛋白能特異性識(shí)別幾種34 bp的反向重復(fù)的LoxP序列并與之結(jié)合，單個(gè)LoxP序列可與兩個(gè)Cre酶結(jié)合。當(dāng)lox序列成對(duì)出現(xiàn)時(shí)，分別結(jié)合在兩個(gè)LoxP序列上的兩對(duì)Cre蛋白會(huì)結(jié)合在一起，進(jìn)而發(fā)揮DNA重組功能。在Cre重組酶的作用下可以將設(shè)定的DNA片段刪除、倒位、以及定點(diǎn)整合［11］。由于該系統(tǒng)作用方式簡(jiǎn)單高效，被廣泛應(yīng)用在刪除特定基因、外源基因整合、動(dòng)植物體內(nèi)外DNA重組等領(lǐng)域，已成為體內(nèi)外遺傳操作新的有力工具［12］。利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)這些特點(diǎn)，在構(gòu)建載體時(shí)可以根據(jù)需要改造LoxP位點(diǎn)序列，以用于特定的基因突變或修復(fù)，增加該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍［13］。通過(guò)單基因或多基因缺失從而降低毒力是獲得減毒基因工程疫苗的一種有效方法。LSDV宿主范圍小，對(duì)外源基因的耐受性強(qiáng)，是一種更為理想的活病毒載體。LSDV的胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）是復(fù)制非必需基因，具有高度保守性，插入外源基因而不影響病毒復(fù)制，可以作為構(gòu)建LSDV基因工程疫苗的外源基因插入位點(diǎn)。本研究利用同源重組技術(shù)，將方向相同的兩個(gè)LoxP位點(diǎn)和紅色熒光報(bào)告基因RFP，定向插入至LSDV/FJ/CHA/2021病毒基因組TK基因處，構(gòu)建紅色熒光標(biāo)記毒株（LSDV-LoxP-RFP-LoxP-ΔTK）。然后采用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)，在表達(dá)Cre重組環(huán)化酶的MDBK-Cre細(xì)胞系中精準(zhǔn)切除重組病毒基因組中熒光標(biāo)簽基因，最終構(gòu)建缺失TK基因的LSDV重組病毒（LSDV-ΔTK毒株），為L(zhǎng)SDV基因工程減毒株的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞和病毒

Vero、MDBK和MDBK-Cre細(xì)胞均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物病毒創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室保存；LSDV/FJ/CHA/2021病毒株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所（LVRI）實(shí)驗(yàn)室分離保存（GenBank 登錄號(hào)：OP752701）。所有細(xì)胞和毒株均支原體檢測(cè)陰性。

1.2 主要試劑

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（貨號(hào)：P505-d1）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ均購(gòu)自New England Biolabs有限公司（貨號(hào)：R3142S和R0136V）；快速克隆試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司（貨號(hào)：C112）；質(zhì)粒小提試劑盒（貨號(hào)：DP105-3）、病毒DNA提取試劑盒（貨號(hào)：DP315）均購(gòu)自Tiangen公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME，購(gòu)自Poly plus公司（貨號(hào)：DP105-3）；胎牛血清（FBS）購(gòu)自上海諾萊生物有限公司（貨號(hào)CF602/C04001-500）產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自健順生物科技有限公司產(chǎn)品（貨號(hào)：C04001-500）；無(wú)鈣鎂PBS緩沖液購(gòu)自上海逍鵬生物科技有限公司（Viva cell）（貨號(hào)：C3593）；支原體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物有限公司（貨號(hào)：40601ES20）。

1.3 主要儀器

PCR儀購(gòu)于廣州威佳科技有限公司產(chǎn)品；生物安全柜、37 ℃恒溫二氧化碳（5%）培養(yǎng)箱和-80℃超低溫冰箱購(gòu)于Thermo有限公司；精密恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于上海一恒科學(xué)儀器公司；恒溫?fù)u床購(gòu)于上海知楚儀器公司；高速低溫離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇州安泰空氣技術(shù)公司；EVOS M5000 Leica倒置熒光顯微鏡購(gòu)于德國(guó)徠卡公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物，詳見(jiàn)表1。

1.5 病毒基因組DNA模板的制備

使用Tiangen病毒DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作提取 LSDV/FJ/CHA/2021毒株的DNA。

1.6 重疊PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以提取的LSDV/FJ/CHA/2021毒株的DNA為模板，擴(kuò)增ORF67L和ORF67R。以質(zhì)粒pcDNA3.1-RFP-LC3為模板，擴(kuò)增紅色熒光蛋白表達(dá)框（RFP）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)將大小正確的目的條帶進(jìn)行膠回收。之后將膠回收產(chǎn)物同源左臂（ORF67L）、同源右臂（ORF67R）分別同紅色熒光蛋白表達(dá)框（RFP）進(jìn)行第一次融合PCR反應(yīng)，將獲得的ORF67L+RFP和RFP+ORF67R PCR產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行第二次融合PCR反應(yīng)，膠回收后測(cè)定核酸濃度，置于-20冰箱保存。PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，2×phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，Phanta Max Super DNA Polymerase 1 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各2 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 000 bp·min-1，32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

1.7 轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建與鑒定

用KpnⅠ和BamHⅠ將pUC19T載體進(jìn)行雙酶切，質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收目的條帶。同重疊PCR產(chǎn)物連接（37℃，30 min）。隨后用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，加入無(wú)抗2YT培養(yǎng)基1 mL，37℃搖菌1h后離心，棄上清900 μL，吹打混勻沉淀并涂布于2YT固體平板（10 μg·mL-1氨芐霉素）中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取長(zhǎng)出的單個(gè)菌落，搖菌，經(jīng)PCR鑒定后通過(guò)質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pUC19T-LSDVΔTK-RFP。

1.8 同源重組拯救缺失TK基因紅色熒光重組病毒（LSDV-ΔTK-RFP）

待12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的Vero細(xì)胞密度為60%～80%時(shí)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pUC19T-LSDVΔTK-RFP，18～20 h后感染野生型LSDV/FJ/CHA/2021毒株（WT-LSDV），感染后8、12、24和36 h觀察細(xì)胞病變及紅色熒光情況。待LSDV誘導(dǎo)Vero細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病理變化（cytopathic effect， CPE）時(shí)，將培養(yǎng)上清和細(xì)胞吸取至1.5 mL離心管，凍存于-80 ℃冰箱。反復(fù)凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min。取10 μL接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為60%～80%時(shí)MDBK細(xì)胞，6 h后更換為DMEM培養(yǎng)基（含2%甲基纖維素10% FBS），挑取熒光顯微鏡下紅色熒光的基因缺失重組病毒（LSDV-ΔTK/ORF67-RFP），并用于病毒的后續(xù)傳代，純化LSDV-ΔTK-RFP。

1.9 缺失TK基因紅色熒光重組病毒（LSDV-ΔTK-RFP）的純化

將同源重組后收集到的病毒液于-80℃反復(fù)凍融3次，取100 μL接種于6孔板的MDBK細(xì)胞中，觀察細(xì)胞病變及熒光情況，3 d后選取病變明顯的孔，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入2 mL DMEM培養(yǎng)基（含2%甲基纖維素10% FBS）繼續(xù)培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察形成蝕斑后，挑取有熒光的蝕斑置于1.5 mL離心管中，保存于-80℃冰箱。將挑取的單個(gè)蝕斑病毒按10倍梯度稀釋接種于96孔板的MDBK細(xì)胞，觀察病變及熒光情況進(jìn)行病毒篩選和純化。將純化LSDV-ΔTK-RFP病毒進(jìn)行連續(xù)傳代，觀察病毒基因組中RFP遺傳穩(wěn)定性。

1.10 缺失TK基因紅色熒光重組病毒（LSDV-ΔTK-RFP）的鑒定

采取PCR法和測(cè)序?qū)χ亟M病毒進(jìn)行鑒定，利用病毒基因組DNA提取試劑盒提取LSDV-ΔTK重組病毒DNA，將其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以Primer1和Primer2為引物，進(jìn)行兩次PCR鑒定。若用引物Primer1擴(kuò)增不出單一條帶，而同時(shí)Primer2可以擴(kuò)增出單一條帶，則證明重組病毒純化成功，以LSDV-WT為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O為陰性對(duì)照。擴(kuò)增體系50 μL，體系中各成分含量：模板DNA 1 μL、2×Hieff PCR Master Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O補(bǔ)足至50 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。最后12 ℃保存。根據(jù)電泳結(jié)果送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，若序列比對(duì)正確且測(cè)序峰單一無(wú)雜峰，則證明重組病毒純化成功。將純化的LSDV-ΔTK進(jìn)行連續(xù)傳代，測(cè)定病毒基因組的遺傳穩(wěn)定性。

1.11 重組病毒LSDV-ΔTK-RFP的遺傳穩(wěn)定性分析

將重組病毒LSDV-ΔTK-RFP在MDBK細(xì)胞上連續(xù)傳代，觀察細(xì)胞狀態(tài)及紅色熒光表達(dá)情況，分別取F3、F6、F10代重組病毒測(cè)定TCID50。

1.12 利用Cre-Loxp系統(tǒng)刪除LSDV病毒基因組中紅色熒光蛋白標(biāo)簽

將不同稀釋度的（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10和10-11）LSDV-ΔTK-RFP感染80%～100%融合度的MDBK-Cre細(xì)胞（100 μL·孔-1），8個(gè)復(fù)孔。感染后24、36和48 h后觀察細(xì)胞病變及紅色熒光情況。將有典型LSDV感染病變，但紅色熒光較少的細(xì)胞培養(yǎng)板復(fù)孔，做以標(biāo)記。待96孔板的細(xì)胞病變較明顯時(shí)，將96孔板凍存于-80℃冰箱，反復(fù)凍融3次。最后，將培養(yǎng)上清和細(xì)胞吸取至1.5 mL離心管，3 000 r·min-1離心10 min。按照上述操作連續(xù)在MDBK-Cre細(xì)胞中重復(fù)傳代，用于去除病毒基因組中紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)簽。

1.13 重組病毒LSDV-ΔTK的遺傳穩(wěn)定性分析

將純化的LSDV-ΔTK病毒在MDBK細(xì)胞中連續(xù)培養(yǎng)觀察，待出現(xiàn)明顯病變時(shí)，將病毒液凍存一次，并接種于下一代MDBK細(xì)胞中，連續(xù)培養(yǎng)10代，觀察細(xì)胞與病變狀態(tài)。并提取每代病毒DNA利用引物Primer3進(jìn)行PCR鑒定。

1.14 重組病毒一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將病毒（WT-LSDV、LSDV-ΔTK-RFP、LSDV-ΔTK）10倍梯度稀釋從10-1稀釋到10-10，接種于長(zhǎng)滿單層MDBK細(xì)胞的96孔板中，分別于24、48、72和96 h后觀察細(xì)胞病變情況。按照Reed-Muench 法計(jì)算結(jié)果，并測(cè)定其TCID50繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

1.15 生物安全聲明

LSDV感染細(xì)胞的相關(guān)試驗(yàn)均在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所完成，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程，嚴(yán)格按照中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所的3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室的操作指南進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 左同源臂、右同源臂和紅色熒光蛋白表達(dá)框基因片段擴(kuò)增

依據(jù)缺失TK基因LSDV毒株構(gòu)建示意圖（圖1），以LSDV/FJ/CHA/2021毒株的病毒DNA及pcDNA3.1-RFP-LC3陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板，利用表1中引物，擴(kuò)增同源重組左、右臂片段及紅色熒光蛋白表達(dá)框。同源重組左臂和右臂基因片段的擴(kuò)增大小均與預(yù)期的1 000和1 100 bp相符，以及紅色熒光蛋白表達(dá)框的目的基因片段擴(kuò)增大小與預(yù)期的807 bp相符（圖2）。

2.2 重疊PCR方法構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體（transfer vector）

將左、右同源臂和紅色熒光蛋白表達(dá)框基因進(jìn)行膠回收，進(jìn)行兩次融合PCR反應(yīng)。如圖3A，分別融合ORF67L+RPF和RFP+ORF67R，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。隨后，進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)，片段大小2 907 bp與預(yù)期結(jié)果相符（圖3B）。將左、右同源臂和紅色熒光蛋白表達(dá)框三段重疊PCR產(chǎn)物同"" pUC19T雙酶切載體相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，涂布于2YT固體平板后，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定。如圖3C，將陽(yáng)性菌液（#3、#4和#5）提取質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。

2.3 缺失TK基因紅色熒光標(biāo)記的重組病毒（LSDV-ΔTK-RFP）拯救與純化

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，18-24 h后感染野生型LSDV毒株（WT-LSDV），感染18 h后，在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光情況，判定轉(zhuǎn)移載體是否與病毒基因組發(fā)生重組。隨后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察到紅色熒光是否于LSDV感染病變相互重合，在MDBK細(xì)胞中經(jīng)過(guò)蝕斑純化、細(xì)胞亞克隆和挑取單細(xì)胞后，純化紅色熒光重組LSDV病毒（LSDV-ΔTK-RFP）。提取重組病毒DNA作為模板，用Primer1和Primer2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖4A和4B所示，Primer1（如圖4A中1～8號(hào)，11～14號(hào)）不能擴(kuò)增出約316 bp的單一條帶，Primer2可以擴(kuò)增出約439 bp的單一條帶（如圖4B中1～15號(hào)），說(shuō)明重組毒株純化成功。同時(shí)，如圖4C，參照陽(yáng)性對(duì)照組（LSDV組），#9、#10和#15號(hào)克隆，出現(xiàn)兩條條帶，說(shuō)明非單一克隆。如圖4所示，可以初步證明選取的1～7號(hào)，11～14號(hào)病毒純化成功。為進(jìn)一步證明其是否純和，選取1號(hào)和2號(hào)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，無(wú)堿基缺失或突變，測(cè)序峰較單一（圖4D），表明已成功獲得LSDV-ΔTK-RFP重組毒株。隨后，如圖5所示，觀察到典型的LSDV感染產(chǎn)生的病變與紅色熒光100%重合，進(jìn)一步驗(yàn)證該紅色熒光標(biāo)記的缺失TK基因LSDV重組病毒構(gòu)建成功。

2.4 重組病毒LSDV-ΔTK-RFP的遺傳穩(wěn)定性分析

將純化鑒定成功的LSDV-ΔTK-RFP重組病毒在MDBK細(xì)胞中連續(xù)傳代，觀察細(xì)胞病變情況及紅色熒光表達(dá)情況，分別測(cè)定F3、F6和F10代重組病毒的TCID50，如圖6結(jié)果顯示：經(jīng)連續(xù)傳代紅色熒光仍能穩(wěn)定表達(dá)，F(xiàn)3、F6和F10代重組病毒的TCID50分別為104.7、105.2和105.38。

2.5 利用Cre-Loxp系統(tǒng)刪除LSDV病毒基因組中紅色熒光蛋白標(biāo)簽

基于重組病毒（LSDV-LoxP-RFP-LoxP-ΔTK）（圖1）基因組中含有同向LoxP位點(diǎn)的紅色熒光標(biāo)記，利用MDBK-Cre細(xì)胞中Cre重組酶對(duì)重組病毒基因組LoxP位點(diǎn)進(jìn)行切割。如圖6，發(fā)現(xiàn)LSDV-LoxP-RFP-LoxP-ΔTK感染MDBK-Cre細(xì)胞后，細(xì)胞周圍出現(xiàn)了無(wú)紅色熒光的典型細(xì)胞病變（CPE）。

隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)熒光CPE逐漸增多，紅色熒光標(biāo)記CPE逐漸減少，表明Cre重組酶呈現(xiàn)較高的催化重組活性，能夠有效地識(shí)別并切割LSDV-LoxP-RFP-LoxP位點(diǎn)中的RFP標(biāo)簽，使其熒光淬滅（圖7，白色箭頭所指）。

LSDV-LoxP-RFP-LoxP-ΔTK在MDBK-Cre細(xì)胞中連續(xù)傳3代，96孔板中亞克隆2次后，獲得了無(wú)熒光標(biāo)記的LSDV-ΔTK病毒（圖7，右列）。為了驗(yàn)證Cre環(huán)化重組酶的無(wú)痕切除RFP效果，將LSDV-ΔTK病毒接種至6孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，隨后提取病毒DNA，PCR進(jìn)行鑒定。如圖8A、B，用Primer1和Primer2為特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，Primer1不能擴(kuò)增（1～6號(hào)）出約316 bp的單一條帶，Primer2可以擴(kuò)增出約439 bp的單一條帶（LSDV-RFP），說(shuō)明紅色熒光蛋白標(biāo)簽刪除完全。同時(shí)，為進(jìn)一步證明RFP標(biāo)簽是否已被無(wú)痕從病毒基因組中切除，選取1號(hào)（#1）和2號(hào)（#2）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，無(wú)堿基缺失或突變，測(cè)序峰較單一（圖8D），表明已成功獲得LSDV-ΔTK重組毒株。上述結(jié)果表明：通過(guò)MDBK-Cre細(xì)胞系反向提供的Cre環(huán)化重組酶，已切除重組病毒基因組中紅色熒光標(biāo)簽，純化獲得TK基因缺失的LSDV重組病毒。

2.6 重組病毒LSDV-ΔTK的遺傳穩(wěn)定性分析

將上步純化鑒定成功的LSDV-ΔTK重組病毒在MDBK細(xì)胞中連續(xù)傳代，觀察細(xì)胞狀態(tài)及病變情況。分別提取F3、F6和F9代LSDV-ΔTK提取病毒DNA用引物Primer3進(jìn)行PCR鑒定。如圖9和10，結(jié)果顯示該重組病毒能夠穩(wěn)定遺傳。

2.7 重組病毒一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

根據(jù)細(xì)胞病變記錄結(jié)果，按照Reed-Muench法計(jì)算出重組病毒LSDV-WT、LSDV-ΔTK-RFP和LSDV-ΔTK的病毒滴度為106.31TCID50·0.1 mL-1、105.38TCID50·0.1 mL-1和105.25TCID50·0.1 mL-1。分別以相同病毒劑量感染MDBK細(xì)胞，在24、48、72和96 h時(shí)收取細(xì)胞培養(yǎng)上清測(cè)定TCID50，利用Graph pad Prism 6.01軟件繪制病毒的一步生長(zhǎng)曲線。如圖11，本研究中構(gòu)建的缺失TK基因的重組毒株（LSDVΔTK-RFP和LSDV-ΔTK）具有良好的生長(zhǎng)特性，其復(fù)制力略低于野生毒株（LSDV-WT）。三個(gè)毒株均在在72 hpi時(shí)達(dá)到復(fù)制最高峰。

3 討 論

LSD自2019年傳入我國(guó)后，對(duì)我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，針對(duì)這種疫病暫無(wú)特效藥，疫苗接種是控制此病傳播的唯一經(jīng)濟(jì)可行的方法。目前國(guó)際上大多數(shù)使用的是基于LSDV、SPPV或GTPV的減毒活疫苗，傳統(tǒng)減毒活疫苗通常會(huì)產(chǎn)生副作用，其安全性問(wèn)題至今仍未解決，這一點(diǎn)也限制了其在生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用［10］。有效的基因缺失標(biāo)記疫苗是區(qū)分疫苗免疫和野毒株感染的重要手段［14］。因此，有必要在其基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出一種特異性針對(duì)LSDV的安全、有效的基因工程缺失疫苗。

LSDV毒力受其基因及編碼蛋白共同影響，可以采用缺失病毒毒力相關(guān)基因、破壞與宿主范圍相關(guān)的基因、或在病毒基因組中插入可激發(fā)宿主自身免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)基因等手段，使該病毒的毒力減弱，但不會(huì)嚴(yán)重影響其自身的增殖。研究表明與痘病毒毒力相關(guān)的蛋白主要包括三類：囊膜蛋白、與核苷酸代謝相關(guān)的蛋白以及非必需衣殼蛋白。痘病毒TK基因編碼的胸苷激酶能催化脫氧胸苷或嘧啶的磷酸化反應(yīng)，參與核苷酸的補(bǔ)救合成途徑以維持并促進(jìn)病毒復(fù)制［15］。TK基因是痘病毒復(fù)制非必需基因和毒力相關(guān)基因，缺失或者缺陷TK基因不影響痘病毒的生長(zhǎng)性能和免疫原性，但可以使病毒毒力下降［16］。因此，缺失TK基因是目前構(gòu)建重組痘病毒基因缺失疫苗的首選對(duì)象。本研究中，LSDV/FJ/CHA/2021株作為親本病毒，以TK基因作為靶基因，將兩個(gè)同向的LoxP位點(diǎn)添加在病毒基因組中，構(gòu)建了RFP標(biāo)記TK基因缺失的轉(zhuǎn)移載體（pUC19T-LSDV-LoxP-ΔTK/ORF67-LoxP-RFP），將痘病毒早晚啟動(dòng)子（pmH5）控制下的增強(qiáng)型紅色熒光蛋白表達(dá)框，插入到LSDV/FJ/CHA/2021株基因組中，通過(guò)細(xì)胞亞克隆和挑取單細(xì)胞，成功構(gòu)建了表達(dá)RFP的LSDV毒株（LSDV-LoxP-ΔTK-LoxP-RFP），為后續(xù)LSD基因缺失疫苗的研制提供候選毒株，為研究新型基因工程弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

Cre-LoxP系統(tǒng)是一種位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，在重組痘病毒方面運(yùn)用廣泛，高月花等［17］首先構(gòu)建出了帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)和GFP的AIV H5/GFP株，之后通過(guò)Cre酶處理后，得到了不帶GFP的AIV H5 株重組病毒。鄭其升等［18］以大腸桿菌黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Eco gpt） 為篩選標(biāo)記，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pLRgpt-ORF5/ORF6。pLRgpt-ORF5/ORF6轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，感染MVA毒株，通過(guò)藥物選擇性培養(yǎng)基（MXHAT）在24孔板上進(jìn)行連續(xù)篩選純化，得到重組病毒 rMVAgpt-GP5/M。將rMVAgpt-GP5/M感染BHK-Cre，成功獲得了刪除篩選標(biāo)記的重組病毒rMVA-GP5/M。Cre蛋白是一種位點(diǎn)特異性DNA重組酶，可催化DNA分子中特定位點(diǎn)之間的DNA重組［19］。該系統(tǒng)的作用方式：i）如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列翻轉(zhuǎn)；ii）如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，并且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列；（Ⅲ）如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)兩條DNA鏈的交換或染色體易位。這個(gè)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是操作非常簡(jiǎn)單，不需要額外的因素進(jìn)行重組。應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)可在基因水平上通過(guò)Cre重組酶識(shí)別序列兩端的LoxP位點(diǎn)，介導(dǎo)2個(gè)LoxP位點(diǎn)間的DNA序列發(fā)生特異性敲除或重組，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除［11］。本研究中，為了后續(xù)LSDV基因工程疫苗的研制，基于基因組中含有同向LoxP位點(diǎn)的紅色熒光標(biāo)記，利用MDBK-Cre細(xì)胞系外源提供的Cre重組環(huán)化酶，將RFP標(biāo)簽蛋白從重組病毒基因組中進(jìn)行了無(wú)痕刪除，構(gòu)建了TK基因缺失無(wú)熒光標(biāo)記的LSDV-ΔTK毒株，拓展了Cre-LoxP系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，為后續(xù)LSDV基因缺失疫苗的研制提供候選毒株，為研究新型基因工程弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)構(gòu)建的牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒LSDV毒株的TK基因缺失株，具有良好的遺傳穩(wěn)定性和復(fù)制生長(zhǎng)特性，為后續(xù)LSDV基因工程疫苗的研制提供了候選毒株。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ 程肖曄， 王曉亮， 常廣軍， 等. 牛結(jié)節(jié)性皮膚病研究進(jìn)展［J］. 畜牧與獸醫(yī)， 2023， 55（9）：144-150.

CHENG X Y， WANG X L， CHANG G J， et al. Progress in researches on lumpy skin diseases in cattle［J］. Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2023， 55（9）：144-150. （in Chinese）

［2］ BEARD P M. Lumpy skin disease：a direct threat to Europe［J］. Vet Rec， 2016， 178（22）：557-558.

［3］ HUNTER P， WALLACE D. Lumpy skin disease in southern Africa：a review of the disease and aspects of control［J］. J S Afr Vet Assoc， 2001， 72（2）：68-71.

［4］ BABIUK S， BOWDEN T R， BOYLE D B， et al. Capripoxviruses： an emerging worldwide threat to sheep， goats and cattle［J］. Transbound Emerg Dis， 2008， 55（7）：263-272.

［5］ REN S H， CHEN H T， YUAN L F， et al. Phylogenetic and pathogenic characterization of lumpy skin disease virus circulating in China［J］. Virology， 2023， 585：127-138.

［6］ 陳曉軍， 李曄虎. 牛結(jié)節(jié)性皮膚病的診斷及防控［J］. 畜牧獸醫(yī)雜志， 2023， 42（4）：122-124.

CHEN X J， LI Y H. Diagnosis and prevention of bovine nodular skin disease［J］. Journal of Animal Science and Veterinary Medicine， 2023， 42（4）：122-124. （in Chinese）

［7］ 翟 頎， 黃敏霞， 呂殿紅， 等. 牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒基因組學(xué)研究進(jìn)展［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2022， 49（7）：97-104.

ZHAI Q， HUANG M X， LYU D H， et al. Research progress in genomics of lumpy skin disease virus［J］. Guangdong Agricultural Sciences， 2022， 49（7）：97-104. （in Chinese）

［8］ 周雪梅. 牛疙瘩皮膚病毒ORF132的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析［D］. 重慶：西南大學(xué)， 2012.

ZHOU X M. The cloning， expression and bioinformatic analysis of ORF132 gene of Lumpy skin disease virus［D］. Chongqing： Southwest University， 2012. （in Chinese）

［9］ KARA P D， MATHER A S， PRETORIUS A， et al. Characterisation of putative immunomodulatory gene knockouts of lumpy skin disease virus in cattle towards an improved vaccine［J］. Vaccine， 2018， 36（31）：4708-4715.

［10］ BRENNER J， BELLAICHE M， GROSS E， et al. Appearance of skin lesions in cattle populations vaccinated against lumpy skin disease：statutory challenge［J］. Vaccine， 2009， 27（10）：1500-1503.

［11］ COX B C， LIU Z Y， LAGARDE M M M， et al. Conditional gene expression in the mouse inner ear using Cre-loxP［J］. J Assoc Res Otolaryngol， 2012， 13（3）：295-322.

［12］ 王立霞， 王 勇， 胡鳶雷， 等. Cre重組酶結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2002， 18（5）：531-535.

WANG L X， WANG Y， HU Y L， et al. Progress in the study of the structure and function of Cre recombinase［J］. Chinese Journal of Biotechnology， 2002， 18（5）：531-535. （in Chinese）

［13］ 吳 慧. Cre/loxp重組系統(tǒng)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因絨山羊標(biāo)記基因刪除的研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)， 2014.

WU H. Cre/loxp mediated deletion of marker gene in transgenic cashmere goat［D］. Hohhot：Inner Mongolia University， 2014. （in Chinese）

［14］ 劉昌錦， 鄧舜洲， 羅 鋒， 等. 豬痘病毒TK、ORF121、ORF143基因缺失毒株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的測(cè)定［J］. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2020， 47（3）：828-836.

LIU C J， DENG S Z， LUO F， et al. Construction of swinepox virus TK， ORF121 and ORF143 genes deletion strains and determination of their biological characteristics［J］. China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2020， 47（3）：828-836. （in Chinese）

［15］ 馮 杰， 崔 燕， 余四九， 等. 羊痘病毒及其載體研究進(jìn)展［J］. 貴州畜牧獸醫(yī)， 2018， 42（1）：13-19.

FENG J， CUI Y， YU S J， et al. Progress in the study of sheep pox virus and its vector［J］. Guizhou Journal of Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2018， 42（1）：13-19. （in Chinese）

［16］ BULLER R M L， SMITH G L， CREMER K， et al. Decreased virulence of recombinant vaccinia virus expression vectors is associated with a thymidine kinase-negative phenotype［J］. Nature， 1985， 317（6040）：813-815.

［17］ 高月花， 王莉莉， 黃 兵， 等. 利用Cre-loxP自動(dòng)敲除H5亞型禽流感病毒血凝素重組雞痘病毒中的報(bào)告基因［J］. 微生物學(xué)報(bào)， 2007， 47（3）：537-539.

GAO Y H， WANG L L， HUANG B， et al. Self-excising reporter gene in recombinant Fowlpox virus expressing H5 hemagglutinin gene of influenza A virus using Cre-loxp systerm［J］. Acta Microbiologica Sinica， 2007， 47（3）：537-539. （in Chinese）

［18］ 鄭其升， 畢志香， 李梅清， 等. 改良型痘苗病毒安卡拉株表達(dá)系統(tǒng)可刪除篩選標(biāo)記的雙表達(dá)穿梭載體［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2011， 27（6）：926-934.

ZHENG Q S， BI Z X， LI M Q， et al. A novel double expression shuttle vector to get marker-free recombinant modified vaccinia virus Ankara［J］. Chinese Journal of Biotechnology， 2011， 27（6）：926-934. （in Chinese）

［19］ 吳孟瑤， 張雪婷， 程倩倩， 等. 基于Cre-LoxP系統(tǒng)的B細(xì)胞特異性熒光報(bào)告基因小鼠模型的構(gòu)建及鑒定［J］. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志， 2023， 37（5）：361-367.

WU M Y， ZHANG X T， CHENG Q Q， et al. Construction and characterization of B cell-specific fluorescent reporter mouse model based on Cre-LoxP system［J］. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology， 2023， 37（5）：361-367. （in Chinese）

（編輯 白永平）