利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備BLG基因敲除牛乳腺上皮細(xì)胞系

摘 要： 旨在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建BLG基因敲除牛乳腺上皮細(xì)胞系（bovine mammary epithelial cells， bMECs），同時檢測BLG基因敲除后對細(xì)胞的影響。本研究利用體外切割試驗篩選獲得靶向牛的BLG基因的第一外顯子序列的3條sgRNA，與CRISPR/Cas9表達(dá)載體電轉(zhuǎn)染入 bMECs，利用濃度為1.8 μg·mL-1嘌呤霉素和6 μg·mL-1稻瘟菌素雙藥篩和PCR分析鑒定獲得BLG基因編輯的單克隆細(xì)胞株；利用Western blot（WB）驗證細(xì)胞BLG表達(dá)；繪制生長曲線和CCK-8試驗檢測BLG基因敲除對bMECs細(xì)胞增殖的影響；同時根據(jù)sgRNA序列，對基因組上潛在脫靶位點進(jìn)行PCR測序分析。經(jīng)篩選和PCR序列分析，共篩選獲得了9株BLG基因編輯細(xì)胞株，其編輯效率為90%（9/10），其中4株細(xì)胞株BLG基因大片段刪除。序列分析結(jié)果顯示，單克隆細(xì)胞株編輯位點呈現(xiàn)片段插入缺失和堿基替換等多種編輯類型，WB結(jié)果顯示敲除細(xì)胞株BLG蛋白表達(dá)顯著降低，且細(xì)胞生長曲線和CCK-8檢測結(jié)果表明BLG基因敲除的細(xì)胞生長速度加快。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成果構(gòu)建了牛乳腺上皮細(xì)胞BLG基因高效敲除方法，BLG基因敲除后可顯著影響牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，為探究BLG敲除牛在乳腺上皮細(xì)胞水平探究其功能機(jī)制提供細(xì)胞模型。

關(guān)鍵詞： BLG基因；牛乳腺上皮細(xì)胞系；CRISPR/Cas9；基因編輯

中圖分類號：S823.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4475-14

收稿日期：2024-04-01

基金項目：江蘇省重點研發(fā)項目“基于新型單堿基編輯器的奶牛高效精準(zhǔn)育種技術(shù)研究”（BE2021372）；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院探索性顛覆性創(chuàng)新計劃項目（ZX（21）1214）

作者簡介：丁修虎（1998-），男，安徽滁州人，碩士，主要從事牛的分子育種研究，E-mail：dxh1825047521@163@.com

*通信作者：丁 強(qiáng)，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：dingqiang198907@163.com；張建麗，主要從事動物育種工作，E-mail：zhangjianli79@163.com

Highly Efficient BLG Knockout in Bovine Mammary Epithelial Cells by Using CRISPR/

Cas9

DING" Xiuhu1.2， LIN" Zhiping3， ZHAO" Fang1， CHEN" Kunlin1， ZHONG" Jifeng1， ZHANG" Yan4， GAO

Yundong4， LI" Huixia2， WANG" Huili1， ZHANG" Jianli1*， DING" Qiang1*

（1.Key Laboratory of Crop and Animal Integrated Farming of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Jiangsu Province Engineering Research Center for Precision Animal Breeding， Institute of Animal Science，

Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014，" China;

2.College of Animal Science

amp; Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，" China;

3.Jiangsu Youyuan Dairy

Research Institute Co.， Ltd.， Nanjing 211100，" China;

4.Shandong OX Livestock Breeding Co.， Ltd.， Jinan 250100，" China）

Abstract：" This study aimed to establish CRISPR/Cas9 mediated BLG-knockout （BLG-KO） system in bovine mammary epithelial cells （bMECs）， and to explore the function effect of BLG-KO on bMECs. Three sgRNAs were designed from the first exon of the bovine BLG gene sequence and screened by using in vitro cleavage test. The Cas9 expression vector and sgRNAs vectors were cotransfected into bMECs by electroporation. Monoclonal cell lines were screened with 1.8 μg·mL-1 puromycin and 6 μg·mL-1 blasticidin. BLG-KO gene editing type were verified by using PCR amplification and sequencing analysis. The potential off-target sites were selected according to the sgRNA sequence and detected by PCR sequencing. The BLG expressing level of knockout cell was detected by Western blot （WB）. Cell viability was tested by cell counting kit-8 （CCK-8） assay， further the growth curve was drawn to analyze the proliferation effect of bMECs cells after BLG-KO. Two sgRNAs were screened and used for further gene edit. 10 monoclonal cell lines were obtained after screening and 9 BLG-edit lines verified by PCR sequencing， 4 clones with large fragment deleted at BLG sequence. Sequence analysis showed that the editing sites contained multiple gene-editing types， including insertion， deletion and base substitution. WB result showed that BLG-KO cell lines with low BLG protein expressing level compare to none edit cell. Furthermore， the BLG-KO promote cell growth and proliferation according to the results of cell growth curve and CCK-8 assay. In this study， we constructed an efficient BLG-KO method in bMECs by using CRISPR/Cas9 system， and the results demonstrated that BLG-KO significantly affected the cell proliferation in bMECs， the results provided a cellular model for exploring the functional mechanism for BLG-KO cattle.

Key words：" BLG gene; bMECs; CRISPR/Cas9; gene editing

*Corresponding authors： DING Qiang， E-mail：dingqiang198907@163.com; ZHANG Jianli， E-mail：zhangjianli79@163.com

牛奶及其乳制品是日常生活中重要的營養(yǎng)物質(zhì)來源，尤其對嬰幼兒來說，牛奶是不可或缺的母乳替代品，對嬰幼兒的成長健康至關(guān)重要。然而，牛奶是食物過敏中最常見的過敏原之一，牛奶過敏多見于嬰幼兒時期，且發(fā)病率呈上升趨勢，大約2%～7%的嬰幼兒及兒童存在牛奶過敏現(xiàn)象，嚴(yán)重影響奶制品營養(yǎng)的吸收和利用［1］。β-乳球蛋白是牛β-Lactoglobulin（BLG）基因編碼的蛋白質(zhì)，由牛乳腺上皮細(xì)胞分泌，是牛奶乳清蛋白的主要成分之一，也是引起過敏的主要過敏原［2］，約有 82%牛乳過敏患者對 BLG 過敏［3-5］。因此，從牛奶中去除β-乳球蛋白可以有效降低牛奶的過敏性。而傳統(tǒng)的加工技術(shù)，如酶水解［6-7］、熱處理［8］、糖基化法［9］等方法去除牛奶中的乳球蛋白，成本較高，還有可能出現(xiàn)新的抗原表位，不能完全消除其過敏性。

CRISPR/Cas9是第三代基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其高效率和準(zhǔn)確性著稱［10-11］，該系統(tǒng)通過gRNA識別并引導(dǎo)Cas9核酸酶精確地在基因組特定位點進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂，誘導(dǎo)DNA同源重組或非同源末端修復(fù)機(jī)制［12］，從而實現(xiàn)靶基因位點的刪除、替換或插入［13］。CRISPR/Cas9可以靶向幾乎任何基因，這為基因功能研究和遺傳改良提供了極大的便利。該技術(shù)在家畜育種中被廣泛的使用，用于靶向綿羊繁育性狀的FecB基因［14］、通過敲除肌肉抑制素MSTN基因促進(jìn)肌肉發(fā)育生長［15-17］ 、敲除FGF5基因改善絨山羊毛纖維品質(zhì)等［18］。因此，利用基因編輯的方法破壞奶牛的BLG基因，使其乳腺細(xì)胞不能正常表達(dá)和分泌β-乳球蛋白，生產(chǎn)的牛奶中不含乳球蛋白，以期從根本上解決牛奶β-乳球蛋白過敏問題。

牛乳腺上皮細(xì)胞是合成和分泌乳汁的分泌細(xì)胞，作為一種重要的細(xì)胞模型用于研究泌乳調(diào)控機(jī)制。已有研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除奶山羊BLG基因，獲得不含β-乳球蛋白的羊乳［19］，然而目前尚未有研究證明BLG基因敲除后對牛乳腺上皮細(xì)胞具有何種影響，因此，本研究以期探索CRISPR/Cas9技術(shù)在牛乳腺上皮細(xì)胞系中敲除BLG基因的應(yīng)用效果，同時探究BLG基因敲除后牛乳腺上皮細(xì)胞的功能變化。BLG是牛奶中的主要蛋白質(zhì)之一，其基因敲除可能影響乳汁其他成分變化及乳腺細(xì)胞的增殖和分化。研究BLG基因敲除對乳腺上皮細(xì)胞的影響，有助于深入理解乳腺發(fā)育和乳汁合成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛乳腺上皮細(xì)胞系（bMECs）和pGL3-hU6-sgRNA-mCherry-puromycin由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牛羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖創(chuàng)新團(tuán)隊實驗室保存，pST1374-Cas9-ZFNLS AmpBst載體由西北農(nóng)林科技大學(xué)王小龍教授團(tuán)隊饋贈。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒、DNA marker、2×Rapid Taq Master Mix購自南京諾唯贊，10×蛋白酶抑制劑、RIPA蛋白裂解液、嘌呤霉素、稻瘟菌素購自上海碧云天，限制性內(nèi)切酶Bas Ⅰ購自美國NEB公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生物，DMEM/F12購自上海培源，ATP-Na2、NaHCO3、NaCl、KH2PO4、MgCl2·6H2O、胎牛血清、氫化可的松和雙抗購自Sigma，1×PBS和0.25%胰酶購自Gbico，T4 DNA Ligase購自TaKaRa，SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒購自雅酶，蛋白marker、PVDF膜購自ThermoFisher，DH5α感受態(tài)大腸桿菌購自南京擎科，催乳素購自Proteintech。

1.3 sgRNA設(shè)計與載體構(gòu)建

BLG基因含有6個外顯子。BLG蛋白的主要抗原表位在成熟肽40 aa后，40 aa位于第二外顯子的前部，因此根據(jù)牛BLG基因（NM_173929.3）的序列設(shè)計了3條位于第一外顯子上的sgRNA，分別位于第一外顯子的前、中、后段，sgRNA位點如圖1所示。根據(jù)sgRNA表達(dá)載體的插入位點信息，在sgRNA的正向引物前加入ACCG，在反向引物前加入AAAC，形成黏性末端，引物由上海生工生物有限公司合成。sgRNA序列信息見表1。

使用Bsa Ⅰ核酸內(nèi)切酶將pGL3-hU6-sgRNA-mCherry-puromycin質(zhì)粒酶切線性化。將sgRNA上下游引物用無酶水稀釋至100 μmol·L-1，上、下游各取5 μL混勻后，98 ℃變性10 min后冷卻到室溫進(jìn)行退火。將線性化產(chǎn)物與退火后的sgRNA片段用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，氨芐抗性培養(yǎng)菌落。挑取菌落單克隆PCR驗證，上游引物為PGL3-F：5′-CGATTAGTGAACGGATCTCGACG-3′，下游引物為sgRNA的反義鏈，陽性克隆測序驗證。

1.4 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄與切割

以sgRNA表達(dá)載體為模板，PCR擴(kuò)增sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板，將T7啟動子序列加在sgRNA上游序列5′端，引物序列見表2。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，回收的sgRNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄純化，并電泳驗證。以牛的總DNA為模板，擴(kuò)增BLG基因序列，該段序列含有所有的sgRNA位點。上游引物為BLG-F：5′-AGGCCTCCTATTGTCCTCGT-3′，下游引物為BLG-R：5′-GGGAATCCCAGACG-TCACAG-3′。以BLG基因為底物，加入Cas9蛋白和sgRNA進(jìn)行體外切割。切割體系為：Cas9蛋白200 ng、sgRNA 50 ng、DNA片段 200 ng、10×Reaction Buffer 2 μL，補(bǔ)水至20 μL，37 ℃孵育3 h，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測切割效果。

1.5 bMECs細(xì)胞系培養(yǎng)及藥篩

將bMECs細(xì)胞均勻接種在24孔培養(yǎng)皿中，完全培養(yǎng)基（DMEM/F12添加10%FBS、終濃度為100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1 鏈霉素），37 ℃、5%" CO2、100%濕度培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞匯合度為80%分別加入嘌呤霉素和稻瘟菌素，進(jìn)行藥篩，藥篩濃度見表3，每48 h更換一次藥篩培養(yǎng)液，藥篩7 d后觀察細(xì)胞存活情況，以細(xì)胞存活率低于5%的濃度為最佳藥篩濃度。

1.6 電轉(zhuǎn)染bMECs細(xì)胞

電轉(zhuǎn)液配置體系參照李煒杰等［20］方法。Solution Ⅰ：MgCl2·6H2O 0.6 g、ATP-Na2 1 g，用無菌超純水定容至5 mL，用0.22 μm過濾器除菌后-20 ℃保存；10×Solution Ⅱ：葡萄糖 0.2 g、NaHCO3 0.6 g、KH2PO4 6.0 g，溶于無菌超純水，調(diào)節(jié)pH為7.4，定容到50 mL，用0.22 μm過濾器除菌后-20 ℃保存。在細(xì)胞匯合度為80%左右時，消化細(xì)胞后加入到15 mL離心管1 500 r·min-1離心5 min。1 mL PBS重懸后細(xì)胞計數(shù)，取2×105個細(xì)胞到1.5 mL離心管中，1 500 r·min-1離心5 min。離心后棄去PBS，加入100 μL的電轉(zhuǎn)工作液，電轉(zhuǎn)工作液體系為：Solution Ⅰ 2 μL，10×Solution Ⅱ 10 μL，sgRNA質(zhì)粒6.7 μg（sgRNA1∶sgRNA3=1∶1），pST1374-Cas9-ZFNLS AmpBs表達(dá)質(zhì)粒 13.3 μg，無菌超純水補(bǔ)至100 μL。將細(xì)胞用電轉(zhuǎn)液重懸后加入2 mm電擊杯，電擊條件：電壓300 V，脈沖時間1 ms，脈沖次數(shù)2次。靜置10" min后用1. 5 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種在6孔板中，24～48 h后觀察熒光表達(dá)。

1.7 單克隆細(xì)胞株篩選

細(xì)胞電轉(zhuǎn)24h后加入嘌呤霉素和稻瘟菌素藥篩，每隔2d換新鮮藥篩培養(yǎng)基，用無藥普通培養(yǎng)基恢復(fù)2 d。熒光顯微鏡下，標(biāo)記發(fā)紅色熒光的細(xì)胞，利用克隆環(huán)挑選單克隆細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化3 min至細(xì)胞成圓形，將細(xì)胞吸出轉(zhuǎn)移至96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待96孔板中細(xì)胞匯合度為80%左右時消化轉(zhuǎn)移到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待24孔板中細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，消化并收集細(xì)胞。消化后的細(xì)胞部分用于提取總DNA，部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 單克隆細(xì)胞株編輯類型檢測

提取單克隆細(xì)胞DNA。PCR擴(kuò)增BLG基因打靶位點序列。PCR擴(kuò)增上游引物為：5′-AGGCCTCCTATTGTCCTCGT-3′，下游引物為：5′-GGGAATCCCAGACGTCACAG-3′。PCR擴(kuò)增體系方法如“1.3”。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京擎科公司進(jìn)行Sanger測序。

1.9 BLG編輯乳腺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)驗證

參考董海龍等［21］報道的牛乳腺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)體系，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM/F12、添加ITS 1%、氫化可的松10 μg·L-1、催乳素10 μg·L-1、10%胎牛血清、1%雙抗。誘導(dǎo)細(xì)胞2 d后，用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，比較bMECs的誘導(dǎo)效果。對編輯細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后，收集編輯細(xì)胞株的蛋白，WB檢測BLG蛋白的表達(dá)。

1.10 脫靶位點檢測

使用Cas-OFFinder［22］（http：∥www.rgenome.net/cas-offinder/）在線網(wǎng)站對BLG-sgRNA1/3的靶序列進(jìn)行脫靶預(yù)測。兩條sgRNA靶位點選擇5個錯配數(shù)最少的潛在脫靶位點（表4），根據(jù)位點信息設(shè)計OFF-Target 檢測引物（表5）。每種脫靶位點選取3個已編輯的細(xì)胞株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送至南京擎科公司進(jìn)行Sanger測序分析。

1.11 細(xì)胞編輯類型T載測序

基因編輯克隆細(xì)胞株可能出現(xiàn)多種類型的編輯方式，利用T-A克隆測序檢測細(xì)胞編輯類型，每個樣本選取12個陽性菌落送至測序公司檢測。

1.12 細(xì)胞增殖檢測及生長曲線繪制

將BLG編輯單克隆細(xì)胞和未編輯的細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞匯合度50%時，進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行細(xì)胞CCK-8增殖驗證；同時，將BLG敲除細(xì)胞和對照細(xì)胞按起始細(xì)胞量2 000個·孔-1接種于12孔板中，每天對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計，直至細(xì)胞長滿整個細(xì)胞培養(yǎng)孔，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量繪制細(xì)胞的生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 牛BLG基因sgRNA載體構(gòu)建

根據(jù)菌液PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果顯示序列正確，成功構(gòu)建3個sgRNA的表達(dá)載體，如圖2所示。

2.2 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄和體外切割驗證

利用體外切割試驗驗證3個sgRNA切割效率，體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA，電泳結(jié)果顯示sgRNA片段清晰（圖3A），再利用Cas9蛋白結(jié)合sgRNA對靶向片段進(jìn)行體外切割試驗，BLG基因擴(kuò)增片段長度為374 bp，3個sgRNA切割BLG基因片段的大小不同，sgRNA1產(chǎn)物大小為258 bp+116 bp，sgRNA2產(chǎn)物大小為192 bp+182 bp，sgRNA3產(chǎn)物大小為227 bp+97 bp，體外切割效果見圖3B。sgRNA1和sgRNA3對目標(biāo)片段具有明顯的切割作用。

2.3 bMECs細(xì)胞系嘌呤霉素和藥篩最佳濃度篩選

對照組細(xì)胞在7 d后生長狀態(tài)良好，試驗組細(xì)胞在1.8 μg·mL-1的嘌呤霉素和6 μg·mL-1的稻瘟菌素濃度下細(xì)胞存活率低于5%（圖4），可作為最佳藥篩濃度用于單克隆細(xì)胞株的篩選。

2.4 電轉(zhuǎn)染bMECs細(xì)胞系

電轉(zhuǎn)染將pST1374-Cas9-ZFNLS AmpBst質(zhì)粒和2個sgRNA表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染bMECs細(xì)胞系。sgRNA載體進(jìn)入細(xì)胞后表達(dá)產(chǎn)生紅色熒光，在電轉(zhuǎn)染48 h后利用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，見圖5，統(tǒng)計得出sgRNA的轉(zhuǎn)染效率為41.5%（表6）。

2.5 單克隆細(xì)胞株篩選與鑒定

在1.8 μg·mL-1嘌呤霉素和6 μg·mL-1稻瘟菌素的工作濃度下對電轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行雙重藥篩，7 d后更換普通培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)形成單克隆細(xì)胞株，單克隆細(xì)胞攜帶紅色熒光，挑選紅色熒光細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)（圖6）。共篩選到符合條件的10株單克隆細(xì)胞株，進(jìn)行擴(kuò)繁傳代，用于后續(xù)的基因編輯鑒定試驗。

2.6 BLG基因編輯bMECs細(xì)胞編輯類型檢測

將篩選獲得的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行DNA提取，同時進(jìn)行靶位點PCR擴(kuò)增，測序后通過序列分析靶基因的編輯類型，電泳結(jié)果顯示，2、4、8、10號細(xì)胞株有大片段的缺失（圖7），測序結(jié)果表明，10株單克隆細(xì)胞株均發(fā)生了不同類型的基因編輯（表7），表明利用該策略可獲得多種類型BLG基因編輯細(xì)胞。為了解具體的編輯類型，利用T-A克隆測序檢測2、8、10號3株細(xì)胞的具體編輯類型，見表8。

2.7 BLG敲除細(xì)胞株蛋白表達(dá)驗證

用誘導(dǎo)培養(yǎng)基對bMECs細(xì)胞系進(jìn)行體外誘導(dǎo)試驗，與未誘導(dǎo)相比，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞BLG的表達(dá)顯著增加，表明誘導(dǎo)效果明顯（圖8A）；選取2、8、10三種大片段缺失的BLG編輯bMECs細(xì)胞株進(jìn)行BLG蛋白表達(dá)檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，3株敲除細(xì)胞的BLG蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)顯著降低（圖8B），表明bMECs細(xì)胞的BLG基因被成功敲除。

2.8 敲除細(xì)胞脫靶檢測

根據(jù)Cas-OFFinder在線網(wǎng)站預(yù)測BLG-sgRNA的脫靶位點。挑選3株單克隆細(xì)胞株進(jìn)行脫靶位點檢測。測序結(jié)果顯示，sgRNA1和sgRNA3兩個位點的一共10個預(yù)測脫靶位點，3株敲除細(xì)胞株均未檢測到脫靶（圖9）。

2.9 "BLG基因敲除對bMECs細(xì)胞增殖的影響

對BLG基因敲除后的bMECs細(xì)胞進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖試驗和繪制細(xì)胞生長曲線，在添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基持續(xù)誘導(dǎo)情況下，CCK8結(jié)果顯示BLG基因敲除的細(xì)胞OD450 mm吸光度顯著高于對照組（圖10A），表明BLG基因敲除細(xì)胞數(shù)量增加。生長曲線顯示，相同誘導(dǎo)時間下，BLG基因敲除細(xì)胞生長顯著快于對照組（圖10B）。

3 討 論

β-乳球蛋白是牛乳中的主要過敏原之一，現(xiàn)在主流的消除過敏的方法是利用熱加工、超聲、輻照等加工工藝手段去除牛奶中的過敏原。然而這些加工方法只能在一定程度上減弱β-乳球蛋白的致敏性，并不能完全消除過敏物質(zhì)的影響，要完全消除β-乳球蛋白的影響，還需要從源頭下手。Yu［23］ 等利用鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)創(chuàng)制出無β-乳球蛋白奶牛，培育出的奶牛生產(chǎn)的牛奶中不含有β-乳球蛋白。崔趁趁［24］利用TALEN技術(shù)成功創(chuàng)制出β-乳球蛋白雜合敲除和純合敲除的奶山羊。相較于ZFN和TALENs技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)不僅成本低，且操作簡便，也更加的高效。目前已有利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究山羊的BLG敲除的研究報道［25-26］。本課題組前期利用胞嘧啶堿基編輯器高效制備了奶牛BLG基因編輯胚胎，通過堿基突變將BLG基因第21位密碼子CAG突變?yōu)門AG實現(xiàn)c*.61Cgt;T（p.Q21*）的轉(zhuǎn)變，獲得終止密碼子，使蛋白質(zhì)翻譯提前終止，以期達(dá)到BLG基因敲除的目的，但未在乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行單堿基敲除效果驗證［27］。本試驗中，利用CRISPR/Cas9與兩條sgRNA共同靶向牛乳腺上皮細(xì)胞BLG基因序列，獲得了高效的編輯效果，成功實現(xiàn)BLG基因的敲除。在篩選的10個單細(xì)胞克隆株中有9株是編輯細(xì)胞，編輯效率達(dá)到了90%。張家翔等［28］利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除豬小腸上皮細(xì)胞的試驗中，用單個sgRNA敲除目的基因，敲除效率只有12.5%（6/48）。最新的研究表明，利用多重sgRNA共同作用在一個靶基因上，可以提高DNA雙鏈斷裂率（DSB），并且可以彌補(bǔ)單個sgRNA低效率的不足［29］。在楊花［30］的研究中，利用CRISPR/Cas9構(gòu)建綿羊VASA基因敲入載體時，單獨使用一條sgRNA的效率較低，轉(zhuǎn)染兩條sgRNA時，可有效的提高外源VASA基因的插入效率。多重sgRNA的基因編輯策略已廣泛用于構(gòu)建細(xì)胞水平的基因敲除體系。

在細(xì)胞水平使用多重sgRNA有利于獲得編輯細(xì)胞，但在胚胎的編輯中利用顯微注射單個sgRNA可以獲得高效的編輯效率［31］。張晨儉等［32］的研究利用2條sgRNA分別單獨靶向綿羊胚胎SOCS2基因，獲得了不錯的敲除效果，分別有90%和80%的胚胎編輯效率。本研究使用的sgRNA在牛胚胎水平的編輯效率需進(jìn)一步驗證。

雖然CRISPR/Cas9技術(shù)可以高效制備基因編輯動物及細(xì)胞，但是其非靶向性編輯仍是限制其使用的一個不容忽視的重要問題［33］，特別是使用多重sgRNA介導(dǎo)的靶基因敲除的脫靶概率也大大增加［34-35］。本研究對軟件預(yù)測的脫靶位點進(jìn)行檢測，篩選的10個脫靶位點未發(fā)現(xiàn)編輯，軟件預(yù)測往往容易造成部分脫靶位點的遺漏，其廣泛的脫靶效應(yīng)并未進(jìn)一步檢測，可利用深度測序或全基因組測序脫靶分析CRISPR/Cas9技術(shù)引起的廣泛脫靶效應(yīng)［36-38］。另外，通過優(yōu)化sgRNA的設(shè)計及對sgRNA不同的化學(xué)修飾［39］，可提高靶向精準(zhǔn)性，降低脫靶效應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，BLG基因敲除后的細(xì)胞生長速度升高，表明β-乳球蛋白參與調(diào)控細(xì)胞的增殖功能。目前，對BLG的研究主要集中于β-乳球蛋白的致敏性分析，雖然已經(jīng)成功創(chuàng)制BLG基因敲除的牛和羊等家畜，生產(chǎn)的乳汁中不含有β-乳球蛋白［23，25］，但是BLG基因敲除對乳腺上皮細(xì)胞的功能是否有影響尚未見報道。β-乳球蛋白常作為藥物載體被廣泛研究，且具有一定的細(xì)胞抗氧化作用，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加β-乳球蛋白能夠抑制細(xì)胞的凋亡［40］。而BLG基因作為乳腺上皮細(xì)胞的主要功能基因，敲除后對細(xì)胞的功能影響仍需進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了牛乳腺上皮細(xì)胞BLG基因高效敲除方法，篩選獲得9株BLG基因敲除牛乳腺上皮細(xì)胞單克隆細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)BLG基因敲除后會影響乳腺上皮細(xì)胞的增殖生長，為探索BLG敲除對牛乳腺上皮的功能影響提供細(xì)胞模型。

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（編輯 郭云雁）