基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘蛋雞產(chǎn)蛋前后骨代謝差異的關(guān)鍵候選基因

摘 要： 旨在挖掘影響蛋雞產(chǎn)蛋前后骨代謝差異的調(diào)控通路和關(guān)鍵候選基因，為進(jìn)一步研究維持蛋雞骨骼健康的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究選擇15只15周齡和12只22周齡體重相近飼養(yǎng)條件相同的海蘭灰蛋雞，采集血液和脛骨，測(cè)定血漿鈣、磷、雌激素、骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)，根據(jù)雌激素水平選擇每組各6只的脛骨組織構(gòu)建12個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)并篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析。隨機(jī)選擇6個(gè)差異表達(dá)基因，利用qRT-PCR驗(yàn)證其相對(duì)表達(dá)量。15周齡與22周齡相比，蛋雞血漿骨代謝標(biāo)記物和雌激素水平均呈現(xiàn)顯著變化（P＜0.05）。構(gòu)建的12個(gè)脛骨cDNA文庫(kù)中得到40 082 240～186 154 554條有效堿基序列數(shù)，Q30值最少為92.18%，比對(duì)率在76.52%～90.55%之間。對(duì)15周齡與22周齡脛骨轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，鑒定出1 832個(gè)差異表達(dá)基因，其中914個(gè)基因下調(diào)，918個(gè)基因上調(diào)。GO功能注釋發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要顯著富集在蛋白加工、對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)和膠原原纖維組織等過(guò)程。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，與骨代謝相關(guān)的顯著富集通路有類(lèi)固醇生物合成、甲狀腺激素合成、TGF-β信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路，篩選出18個(gè)這些通路共有的基因作為調(diào)控骨代謝的關(guān)鍵候選基因。本研究揭示了產(chǎn)蛋前后蛋雞脛骨組織中基因表達(dá)存在差異，篩選到多個(gè)影響骨代謝的差異表達(dá)基因和通路，為進(jìn)一步研究蛋雞產(chǎn)蛋前后骨代謝轉(zhuǎn)換機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 蛋雞；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因；生理階段；脛骨；骨代謝

中圖分類(lèi)號(hào)：S831.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4455-11

收稿日期：2024-03-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32272922）；河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目現(xiàn)代種業(yè)科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（22326319D）；河北省雞現(xiàn)代種業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（21326303D）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金（HBCT2024260204）

作者簡(jiǎn)介：張寅梁（1998-），男，山西原平人，碩士生，主要從事畜禽遺傳資源種質(zhì)特性挖掘、保存與利用研究，E-mail：874197127@.qq.com

*通信作者：周榮艷，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： rongyanzhou@126.com

Mining of Key Candidate Genes Involved in Bone Metabolism Differences at Pre- and Post-

laying Stage Based on Transcriptome Data in Laying Hens

ZHANG" Yinliang， ZHANG" Ran， WANG" Wenjun， WANG" Dehe， LI" Lanhui， ZHOU" Rongyan*

（College of Animal Science and Technology， Hebei Agricultural University， Baoding 071001，" China）

Abstract：" The study aimed to explore the regulatory pathways and important candidate genes that affect the differences in bone metabolism before and after egg laying in laying hens， providing a theoretical basis for further research on the regulatory mechanisms for maintaining bone health in laying hens. A total of 15 at 15-week-old and 12 at 22-week-old Hyline Grey laying hens with similar body weights and reared under identical conditions were selected. Blood and tibia samples were collected to measure plasma levels of calcium， phosphorus， estrogen， and other biochemical markers related to bone metabolism. Based on estrogen levels， tibia tissues from 6 hens within each age group were selected to construct 12 transcriptome libraries. Differentially expressed genes （DEGs） were then screened from these libraries， and GO functional annotation and KEGG pathway enrichment analyses were performed with DEGs. Additionally， 6 randomly selected DEGs were validated for their relative expression levels using qRT-PCR. When comparing 15-week-old hens to 22-week-old hens， significant changes （Plt;0.05） were observed in plasma bone metabolism markers and estrogen levels in the laying hens. The clean reads of 40 082 240-186 154 554 were obtained from the 12 constructed tibial cDNA libraries， with a minimum Q30 value of 92.18% and a contrast rate between 76.52% and 90.55%. A total of 1 832 DEGs were screened from the tibia of laying hens at 15 and 22 weeks of age. Among them， 914 genes were downregulated and 918 genes were upregulated. GO functional annotation revealed that differentially expressed genes were significantly enriched in protein processing， response to endoplasmic reticulum stress， and collagen fibril organization （P＜0.05）. KEGG enrichment analysis revealed significant enrichment pathways related to bone metabolism， including steroid biosynthesis， thyroid hormone synthesis， and TGF- β signal pathway， MAPK signaling pathway， PI3K-Akt signaling pathway. Screening out 18 genes were shared by these pathways as key candidate genes for regulating bone metabolism. This study revealed that there are differences in gene expression in the tibia tissue of laying hens， and multiple DEGs and pathways affecting bone metabolism at pre- and post-laying stages were screened in laying hens. These results provide theoretical basis for further research on the mechanism of bone metabolism changes in laying hens before and after egg laying.

Key words： laying hens; transcriptome; differentially expressed genes; physiological stages; tibia; bone metabolism

*Corresponding author： ZHOU Rongyan， E-mail： rongyanzhou@126.com

蛋雞的骨骼健康是限制其延養(yǎng)潛力的關(guān)鍵因素，直接關(guān)系到蛋雞產(chǎn)業(yè)能否實(shí)現(xiàn)高質(zhì)高效的發(fā)展［1］。而蛋雞產(chǎn)蛋前后受內(nèi)分泌信號(hào)影響引起的骨代謝轉(zhuǎn)換和髓質(zhì)骨沉積是影響蛋雞骨骼健康的主要原因［2］。蛋雞產(chǎn)蛋前骨骼發(fā)育以結(jié)構(gòu)骨生成為主，開(kāi)產(chǎn)后血漿雌激素水平升高，而雌激素是禽類(lèi)髓質(zhì)骨形成的關(guān)鍵因素［3］。同時(shí)，結(jié)構(gòu)骨生成開(kāi)始向髓質(zhì)骨生成轉(zhuǎn)換［4］。在從性成熟開(kāi)始到完全性成熟的階段內(nèi)，蛋雞髓質(zhì)骨會(huì)在骨髓腔中大量?jī)?chǔ)存，以備開(kāi)產(chǎn)后為蛋殼形成提供鈣源，而骨鈣卻被大量消耗轉(zhuǎn)化為髓質(zhì)骨［5］，導(dǎo)致蛋雞易發(fā)骨質(zhì)疏松。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞在產(chǎn)蛋前其髓質(zhì)骨的累積是影響其產(chǎn)蛋后期骨骼健康問(wèn)題的關(guān)鍵［6］。延遲性成熟有助于蛋雞在產(chǎn)蛋前充分地發(fā)育骨骼以確保產(chǎn)蛋期骨骼質(zhì)量［7］。此外，有研究表明，蛋雞產(chǎn)蛋前期骨質(zhì)量的水平能持續(xù)影響生產(chǎn)階段骨質(zhì)情況，而骨骼質(zhì)量的提高有助于延長(zhǎng)蛋雞的產(chǎn)蛋周期和提高產(chǎn)蛋性能［8］。因此，研究蛋雞產(chǎn)蛋前后骨代謝機(jī)制是維持蛋雞產(chǎn)蛋期骨骼健康的關(guān)鍵。

近年來(lái)，蛋雞骨代謝領(lǐng)域的研究取得了一些進(jìn)展。蛋雞龍骨骨折所引發(fā)的骨代謝異?？赡芘c骨折后愈合相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)為骨折愈合機(jī)制的研究提供了新的視角［9］。蛋雞日常營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入也會(huì)對(duì)骨代謝產(chǎn)生一定的影響。低磷飼料對(duì)老年蛋雞骨代謝并無(wú)不利影響［10］，但低鈣條件下蛋雞誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥而發(fā)病原因與腸道菌群變化有關(guān)［11］。蛋雞產(chǎn)蛋高峰后飼喂發(fā)酵丁酸鈣可通過(guò)增強(qiáng)腸道完整性減少炎癥介導(dǎo)的骨吸收［12］。此外，利用組學(xué)研究篩選出的差異代謝物及差異表達(dá)基因能闡明一些蛋雞骨質(zhì)變化的原因?；\養(yǎng)模式對(duì)雞的骨質(zhì)量參數(shù)有負(fù)面影響，通過(guò)非靶向代謝組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)與氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和糖代謝等相關(guān)［13］。通過(guò)對(duì)蛋雞脛骨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)蛋雞脛骨強(qiáng)度與Pax5、TIMP4和KLHL14 等相關(guān)［14］。此外，維持骨代謝穩(wěn)態(tài)也被視為動(dòng)物福利的重要組成部分［15-16］。因此，深入研究與鑒定蛋雞骨代謝相關(guān)調(diào)控因子具有重要意義。而目前對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋前后骨代謝變化的血漿代謝物、激素水平和骨代謝差異表達(dá)基因的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)海蘭灰蛋雞的血漿代謝標(biāo)記物水平、血漿鈣磷含量以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，明確不同生理時(shí)期蛋雞骨代謝的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步闡明蛋雞骨骼健康的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

選擇在相同環(huán)境條件下飼養(yǎng)的30只12周齡海蘭灰蛋雞繼續(xù)養(yǎng)至15周齡，在15周齡時(shí)選擇15只體重相近的個(gè)體，采集血液和脛骨；選擇12只體重相近、開(kāi)產(chǎn)日齡為140天的22周齡蛋雞，記錄每天產(chǎn)蛋時(shí)間，在產(chǎn)蛋后3 h內(nèi)采集血液和脛骨。將EDTA抗凝的血液離心（2 000 r·min-1，15 min），分離血漿，放置于-20 ℃保存用于測(cè)定生化指標(biāo)；將剔除肌肉和軟骨的左側(cè)脛骨液氮速凍后置于-80 ℃保存用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)定。為篩選出蛋雞性成熟前后與骨代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，根據(jù)血漿雌激素濃度對(duì)15和22周齡蛋雞從高到低排序，選擇15周齡（17.92～24.84 pg·mL-1）和22周齡（52.74～61.21 pg·mL-1）的脛骨各6個(gè)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 血漿骨代謝相關(guān)標(biāo)記物、激素水平檢測(cè)

血漿生化指標(biāo)均利用ELISA試劑盒和酶標(biāo)分析儀（型號(hào)：Rayto RT-6100）進(jìn)行檢測(cè)。核因子κB受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κb ligand，RANKL）、雞核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κb，RANK）、雞骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、雞骨鈣素（osteocalcin，OCN）、雞骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、雞硫酸角質(zhì)素（keratan sulfate，KS）、雞硬骨素（sclerostin，SOST）、雞吡啶酚（pyridinoline，PYD）和雌激素（estrogens，E）試劑盒均購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司；蛋雞血漿鈣離子和無(wú)機(jī)磷試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究院。

1.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

用TRIzol法提取15和22周齡蛋雞脛骨組織總RNA，利用Agilent 2100生物分析儀（安捷倫科技，美國(guó)）檢測(cè)總RNA完整性。樣品合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，后用fragmentation將其打碎成小片段，以此為模板，用隨機(jī)引物合成cDNA，后合成二鏈cDNA。最后用PCR法富集cDNA，構(gòu)建海蘭灰蛋雞脛骨cDNA文庫(kù)。構(gòu)建完成后，用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行分析。在Illumina HiSeq平臺(tái)上對(duì)12個(gè)脛骨組織cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 脛骨組織差異表達(dá)基因篩選

對(duì)原始序列進(jìn)行FastQC質(zhì)控，將過(guò)濾后的高質(zhì)量堿基序列，使用HISAT2軟件比對(duì)到雞基因組（版本號(hào)：GRCg6a），利用DESeq2以|Fold Change|≥1.5且FDRlt;0.05作為篩選條件篩選差異表達(dá)基因。利用GOseq R包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析。使用KOBAS軟件進(jìn)行KEGG富集分析。

1.5 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇6個(gè)差異表達(dá)基因，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：Forget-Me-Not EvaGreen qPCR Master Mix（上海開(kāi)放生物科技有限公司）10 μL，ROX 3 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因LBR在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)。用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用Mann-Whitney進(jìn)行分析。方差分析顯著進(jìn)行Duncan多重比較，Plt;0.05為顯著標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)分析和繪圖均利用OriginPro 2021軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)蛋前后蛋雞血漿指標(biāo)的變化

對(duì)產(chǎn)蛋前后血漿雌激素水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)15周齡顯著低于22周齡（P＜0.05，圖1）。對(duì)產(chǎn)蛋前后血漿骨代謝相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行比較 ，發(fā)現(xiàn)15周齡骨代謝標(biāo)記物RANKL、OCN、KS、PYD、RANK水平均顯著高于22周齡（P＜0.05，圖2A、B、D、E、G）。15周齡BSP、OPG、SOST水平顯著低于22周齡（P＜0.05，圖2C、F、H）。對(duì)產(chǎn)蛋前后血漿鈣、磷水平進(jìn)行比較 ，發(fā)現(xiàn)15周齡血漿無(wú)機(jī)磷含量與22周齡沒(méi)有顯著差異（圖3A）。22周齡血漿中的鈣離子水平顯著低于15周齡組（P＜0.05，圖3B）。

2.2 蛋雞脛骨組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

從構(gòu)建的12個(gè)海蘭灰蛋雞脛骨cDNA文庫(kù)中得到40 082 240～186 154 554條高質(zhì)量序列，所有樣本Q30值至少為92.18%（表2），表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量?jī)?yōu)良，可用于后續(xù)分析。將高質(zhì)量序列與雞的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，與雞參考基因組的比對(duì)率為76.52%～90.55% （表2）。

2.3 蛋雞差異表達(dá)基因篩選與富集分析

利用DESeq2對(duì)脛骨轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)以|Fold Change|gt;1.5且FDRlt;0.05作為條件篩選差異表達(dá)基因。蛋雞性成熟前（15周齡）對(duì)比性成熟后（22周齡）脛骨的差異表達(dá)基因共有1 832個(gè)（圖4），其中914個(gè)基因下調(diào)，918個(gè)基因上調(diào)。

為探究蛋雞15周齡與22周齡脛骨差異基因的功能，對(duì)1 832個(gè)差異表達(dá)基因做GO富集分析，分為了3個(gè)主要分支，即生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）（圖5）。在BP分類(lèi)中，差異表達(dá)基因在蛋白加工（protein processing）、對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)（response to endoplasmic reticulum stress）和膠原原纖維組織（collagen fibril organization）等條目顯著富集（P＜0.05）。在CC功能方面，差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞外泌體（extracellular exosome）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔（endoplasmic reticulum lumen）和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）等條目（P＜0.05）。在MF中，差異表達(dá)基因顯著富集在肝素結(jié)合（heparin binding）、膠原結(jié)合（collagen binding）、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶活性（protein disulfide isomerase activity）和鈣離子結(jié)合（calcium lon binding）等（P＜0.05）。

對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，將其分為5個(gè)生物途徑，其中包括細(xì)胞過(guò)程（cellular processes）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、遺傳信息處理（genetic information processing）、新陳代謝（metabolism）和生物體系統(tǒng)（organismal systems）通路（圖6A）。這些差異表達(dá)基因共富集到204個(gè)通路，其中30條通路顯著富集（P＜0.05， q value＜0. 2），包括類(lèi)固醇生物合成（steroid biosynthesis）、TGF-β信號(hào)通路（TGF-beta

signaling pathway）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）和倍半萜及三萜生物合成（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis）等（圖6B）。

2.4 產(chǎn)蛋前后蛋雞骨代謝差異的候選調(diào)控基因篩選

為研究蛋雞產(chǎn)蛋前后脛骨中骨代謝變化的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制，從KEGG顯著富集通路中通過(guò)文獻(xiàn)篩選與骨代謝相關(guān)的通路，分別是類(lèi)固醇生物合成［6］、TGF-β信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和倍半萜及三萜生物合成［6］。對(duì)上述通路中的DEGs根據(jù)在各通路間的關(guān)聯(lián)情況篩選與蛋雞產(chǎn)蛋前后骨代謝變化相關(guān)的關(guān)鍵候選DEGs（表3）。與膠原合成功能相關(guān)的基因有PDGFA和PDGFB，與細(xì)胞外泌體功能相關(guān)的基因有PDGFC、PDGFD和THBS1，與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的DEGs為FGF10和THBS1，與肝素結(jié)合相關(guān)的DEGs有FGF10、FGFR1和THBS1，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的DEGs有FGFR3和FDFT1，與鈣離子結(jié)合相關(guān)的DEGs僅有THBS1（表3）。

2.5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇DEGs中的6個(gè)差異表達(dá)基因，利用qRT-PCR進(jìn)行表達(dá)水平檢測(cè)，LBR為內(nèi)參基因，與15周齡相比，22周齡脛骨中COL1A1、COL1A2、SPARC和DCN表達(dá)水平下調(diào)，TF和CNRIP1表達(dá)水平上調(diào)（圖7）。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)，6個(gè)基因的qRT-PCR表達(dá)規(guī)律與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達(dá)規(guī)律（圖7）完全一致。

3 討 論

蛋雞的骨骼發(fā)育受到多個(gè)因素的影響，如日糧配比、飼養(yǎng)管理和遺傳因素等。這些因素不僅直接關(guān)系到蛋雞骨代謝狀態(tài)，還影響蛋殼質(zhì)量，進(jìn)而決定蛋雞產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和動(dòng)物福利。目前，盡管已經(jīng)對(duì)蛋雞骨代謝的調(diào)控因子［10］和骨組織結(jié)構(gòu)［17］等開(kāi)展了初步研究，但多數(shù)研究仍聚焦于血漿代謝物、鈣磷檢測(cè)、骨代謝相關(guān)基因以及相關(guān)因子對(duì)骨代謝的影響等方面。相對(duì)而言，蛋雞骨組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面的研究仍顯不足。

蛋雞開(kāi)產(chǎn)前后骨代謝發(fā)生轉(zhuǎn)換，伴隨著血漿骨代謝相關(guān)指標(biāo)濃度變化。為進(jìn)一步了解蛋雞在產(chǎn)蛋前后骨代謝的變化情況，對(duì)雌激素和多種骨代謝標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。隨著周齡的增加，蛋雞22周齡組雌激素含量顯著高于15周齡組，雌激素的增加會(huì)導(dǎo)致雞體內(nèi)骨骼的改建和鈣的儲(chǔ)存，特別是在產(chǎn)蛋周期中會(huì)促進(jìn)雞體內(nèi)鈣的沉積停止，開(kāi)始形成骨髓骨，為未來(lái)的蛋殼形成提供鈣源［18］。RANK和RANKL水平相較于15周齡組均顯著下降，而OPG含量卻顯著上調(diào)。RANKL與其受體RANK結(jié)合，促進(jìn)成骨細(xì)胞前體的分化和活化，從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成，而OPG則是RANKL的拮抗受體，通過(guò)阻止RANKL與RANK的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的成熟過(guò)程［19］。由此可知，蛋雞在產(chǎn)蛋前后骨吸收過(guò)程發(fā)生了顯著變化。此外，骨鈣素和硬骨素都作為成骨細(xì)胞所分泌的蛋白，但在功能方面存在不同，骨鈣素主要調(diào)節(jié)骨代謝過(guò)程，而硬骨素主要作為骨基質(zhì)蛋白參與骨骼形成和骨質(zhì)礦化［20］。22周齡蛋雞血漿中的骨鈣素水平顯著降低，而血漿中硬骨素水平顯著升高，這進(jìn)一步證實(shí)蛋雞在產(chǎn)蛋前后骨代謝活躍。髓質(zhì)骨是蛋雞骨骼的重要組成部分，而KS作為髓質(zhì)骨的重要成分［21-22］，在22周齡時(shí)顯著下降。這表明蛋雞22周齡時(shí)可能利用血漿KS進(jìn)行髓質(zhì)骨的生成，從而導(dǎo)致血漿KS水平下降。PYD水平作為機(jī)體骨質(zhì)吸收時(shí)產(chǎn)生的代謝物，可作為破骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物［23］，PYD水平22周齡時(shí)顯著下降，表明破骨活動(dòng)減弱，這與RANK和RANKL的結(jié)果保持一致。BSP作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白有促進(jìn)成骨和誘導(dǎo)骨吸收的功能，可以調(diào)控骨代謝［24］，22周齡蛋雞BSP水平顯著升高，表明開(kāi)產(chǎn)后蛋雞骨代謝變得更活躍。綜上所述，蛋雞骨代謝在22周齡時(shí)整體增強(qiáng)，而出現(xiàn)骨吸收減弱和成骨增強(qiáng)的原因可能與采樣時(shí)間是蛋雞產(chǎn)蛋后3 h內(nèi)有關(guān)，此時(shí)蛋雞成骨活性增加［25］。

此外，通過(guò)對(duì)血漿中鈣離子和無(wú)機(jī)磷濃度的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著蛋雞周齡的增加，鈣離子濃度呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，可能是由于蛋雞開(kāi)始排卵后，對(duì)鈣離子的需求顯著增加。排卵過(guò)程是一個(gè)高度依賴鈣離子的生理過(guò)程，隨著蛋雞進(jìn)入產(chǎn)蛋期，其對(duì)鈣離子的攝取和利用效率可能發(fā)生改變，以滿足蛋殼形成的需要［26-27］。相比之下，血漿無(wú)機(jī)磷含量在蛋雞周齡增加的過(guò)程中并未出現(xiàn)顯著變化，這與Habig等［28］的研究結(jié)果相一致。而Yan等［29］發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋后蛋雞在短期內(nèi)血漿無(wú)機(jī)磷水平會(huì)發(fā)生顯著變化。表明血漿鈣離子與無(wú)機(jī)磷相比，鈣離子平衡濃度由于需要量增加而降低，但無(wú)機(jī)磷只在短期內(nèi)有顯著降低后又恢復(fù)正常水平。因此推斷蛋雞無(wú)機(jī)磷獲得途徑較為穩(wěn)定，而鈣離子容易缺乏。

為研究產(chǎn)蛋前后蛋雞骨代謝轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制，基于脛骨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選差異表達(dá)基因，從KEGG顯著富集的通路中篩選與骨代謝相關(guān)的代謝通路。類(lèi)固醇生物合成和倍半萜及三萜生物合成與雌激素的前體物質(zhì)膽固醇合成緊密相關(guān)，而雌激素在骨代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，能夠刺激髓質(zhì)骨的形成［6］。此外，雌激素還通過(guò)抑制TGFβ1的作用影響骨代謝［30］。MAPK通路發(fā)揮促進(jìn)破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵作用，且該作用受RANKL誘導(dǎo)［31］。SOD3通過(guò)PI3K-Akt和MAPK信號(hào)通路途徑調(diào)節(jié)FLT1影響骨代謝抑制脂肪形成［32］。這些通路共同構(gòu)成了蛋雞骨代謝過(guò)程中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，本研究還從參與蛋雞骨代謝的膠原結(jié)合、肝素結(jié)合、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和鈣離子結(jié)合功能的信號(hào)通路中篩選到關(guān)鍵候選基因。FGF10作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的一員，其表達(dá)水平與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)［33］。THBS1的表達(dá)能通過(guò)激活PI3K和Akt磷酸化水平促進(jìn)bFGF表達(dá)促進(jìn)骨形成［34］。血小板衍生生長(zhǎng)因子家族中的PDGFA、PDGFC、PDGFB、PDGFD均對(duì)骨骼發(fā)育和修復(fù)有重要調(diào)節(jié)作用［35］。這些基因在蛋雞骨代謝過(guò)程中都可能發(fā)揮著重要作用。本研究篩選的這些關(guān)鍵候選基因?qū)⒂兄谏钊肟鼐康半u產(chǎn)蛋前后骨代謝轉(zhuǎn)換機(jī)制及維持產(chǎn)蛋期骨骼健康問(wèn)題奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

蛋雞在15周齡和22周齡血漿骨代謝標(biāo)記物和雌激素水平均呈現(xiàn)顯著變化，基于脛骨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出1 832個(gè)差異表達(dá)基因，基于顯著富集的信號(hào)通路篩選出18個(gè)影響骨代謝的關(guān)鍵候選基因，為進(jìn)一步深入研究蛋雞產(chǎn)蛋前后骨代謝變化機(jī)制提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ WEI H D，CHEN Y Q，NIAN H Y，et al.Abnormal bone metabolism may be a primary causative factor of keel bone fractures in laying hens［J］.Animals （Basel），2021，11（11）：3133.

［2］ ALFONSO-CARRILLO C，BENAVIDES-REYES C，DE LOS MOZOS J，et al.Relationship between bone quality，egg production and eggshell quality in laying hens at the end of an extended production cycle （105 Weeks）［J］.Animals，2021，11（3）：623.

［3］ YUE Q X，HUANG C X，ZHOU R Y，et al.Integrated transcriptomic and metabolomic analyses reveal potential regulatory pathways regulating bone metabolism pre- and postsexual maturity in hens［J］.Poult Sci，2024，103（4）：103555.

［4］ BAIN M M，NYS Y，DUNN I C.Increasing persistency in lay and stabilising egg quality in longer laying cycles.What are the challenges？［J］.Brit Poult Sci，2016，57（3）：330-338.

［5］ CRANSBERG P H，PARKINSON G B，WILSON S，et al.Sequential studies of skeletal calcium reserves and structural bone volume in a commercial layer flock［J］.Brit Poult Sci，2001，42（2）：260-265.

［6］ DUNN I C，DE KONING D J，MCCORMACK H A，et al.No evidence that selection for egg production persistency causes loss of bone quality in laying hens［J］.Genet Sel Evol，2021，53（1）：11.

［7］ HESTER P Y，WILSON D A，SETTAR P，et al.Effect of lighting programs during the pullet phase on skeletal integrity of egg-laying strains of chickens［J］.Poult Sci，2011，90（8）：1645-1651.

［8］ XIN Q，MA N，JIAO H C，et al.Dietary energy and protein levels during the prelay period on production performance，egg quality，expression of genes in hypothalamus-pituitary-ovary axis，and bone parameters in aged laying hens［J］.Front Physiol，2022，13： 887381.

［9］ WEI H D，BI Y J，WANG Y L，et al.Serum bone remodeling parameters and transcriptome profiling reveal abnormal bone metabolism associated with keel bone fractures in laying hens［J］.Poult Sci，2023，102（4）：102438.

［10］ REN Y C，LIU Y P，JIANG K X，et al.Effects of low-phosphorus diets supplemented with Phytase on the production performance，phosphorus-calcium metabolism，and bone metabolism of aged Hy-line Brown laying hens［J］.Animals，2023，13（6）：1042.

［11］ JIANG S，ZOU X Y，MAO M，et al.Low Ca diet leads to increased Ca retention by changing the gut flora and ileal pH value in laying hens［J］.Anim Nutr，2023（13）：270-281.

［12］ ZHANG H Y，WANG Y S，WANG Y L，et al.Fermented calcium butyrate supplementation in post-peak laying hens improved ovarian function and tibia quality through the “gut-bone” axis［J］.Anim Nutr，2024，16：350-362.

［13］ LI D F，WU Y F，SHI K，et al.Untargeted metabolomics reveals the effect of rearing systems on bone quality parameters in chickens［J］.Front Genet，2023，13：1071562.

［14］ YUE Q X，CHEN Y，CHEN H，et al.Transcriptome profile reveals novel candidate genes associated with bone strength in end-of-lay hens［J］.Anim Biotechnol，2023，34（7）：3099-3107.

［15］ Farm Animal Welfare Council.Opinion on osteoporosis and bone fractures in laying hens［R］.2010：14.

［16］ RIBER A B，CASEY-TROTT T M，HERSKIN M S.The influence of keel bone damage on welfare of laying hens［J］.Front Vet Sci，2018（5）：6.

［17］ YAMADA M，CHEN C X，SUGIYAMA T，et al.Effect of age on bone structure parameters in laying hens［J］.Animals，2021， 11（2）：570.

［18］ HANLON C，ZIEZOLD C J，BéDéCARRATS G Y.The diverse roles of 17β-estradiol in non-gonadal tissues and its consequential impact on reproduction in laying and broiler breeder hens［J］.Front Physiol，2022，13：942790.

［19］ YASUDA H.Discovery of the RANKL/RANK/OPG system［J］.J Bone Miner Metab，2021，39（1）：2-11.

［20］ WANG J S，MAZUR C M，WEIN M N.Sclerostin and osteocalcin：candidate bone-produced hormones［J］.Front Endocrinol，2021（12）： 584147.

［21］ CANOVILLE A，ZANNO L E，ZHENG W X，et al.Keratan sulfate as a marker for medullary bone in fossil vertebrates［J］.J Anat， 2021， 238（6）：1296-1311.

［22］ WANG X B，F(xiàn)ORD B C，PRAUL C A，et al.Characterization of the non-collagenous proteins in avian cortical and medullary bone［J］.Comp Biochem Phys B：Biochem Molecul Biol，2005，140（4）：665-672.

［23］ 郭軍鵬，張兆鵬，孟慶楠，等.人參總皂苷對(duì)老年性骨質(zhì)疏松大鼠血清吡啶酚和骨鈣素水平的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2020， 40（3）：614-615.

GUO J P，ZHANG Z P，MENG Q N，et al.Effect of the total ginsenoside on pyridine and OPG levels in serum of aged osteoporosis rats［J］.Chinese Journal of Gerontology，2020，40（3）：614-615.（in Chinese）

［24］ 曾俊銘，賀小寧.骨涎蛋白在破骨細(xì)胞分化和骨吸收中的研究進(jìn)展［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2023，29（18）：1425-1429.

ZENG J M，HE X N.Research progress of bone sialoprotein in osteoclast differentiation and bone resorption［J］.Journal of Hainan Medical University，2023，29（18）：1425-1429.（in Chinese）

［25］ TAYLOR A C，HORVAT-GORDON M，MOORE A，et al.The effects of melatonin on the physical properties of bones and egg shells in the laying hen［J］.PLoS One，2013，8（2）：e55663.

［26］ BAR A.Calcium homeostasis and vitamin D metabolism and expression in strongly calcifying laying birds［J］.Comp Biochem Physiol A： Mol Integr Physiol，2008，151（4）：477-490.

［27］ GLOUX A，LE ROY N，EZAGAL J，et al.Possible roles of parathyroid hormone，1.25（OH）2D3，and fibroblast growth factor 23 on genes controlling calcium metabolism across different tissues of the laying hen［J］.Domest Anim Endocrinol，2020（72）：106407.

［28］ HABIG C，WEIGEND A，BAULAIN U，et al.Influence of age and phylogenetic background on blood parameters associated with bone metabolism in laying hens［J］.Front Physiol，2021（12）：678054.

［29］ YAN J K，WANG J J，CHEN J，et al.Adjusting phosphate feeding regimen according to daily rhythm increases eggshell quality via enhancing medullary bone remodeling in laying hens［J］.J Anim Sci Biotechnol，2023，14（1）：17.

［30］ FARAONI E Y，CAMILLETTI M A，ABELEDO-MACHADO A，et al.Sex differences in the development of prolactinoma in mice overexpressing hCGβ：role of TGFβ1［J］.J Endocrinol，2017，232（3）：535-546.

［31］ MA C，WANG Z Z，MO L，et al.Tanshinone I attenuates estrogen-deficiency bone loss via inhibiting RANKL-induced MAPK and NF-κB signaling pathways［J］.Int Immunopharmacol，2024，127：111322.

［32］ XU K，F(xiàn)EI W C，GAO W X，et al.SOD3 regulates FLT1 to affect bone metabolism by promoting osteogenesis and inhibiting adipogenesis through PI3K/AKT and MAPK pathways［J］.Free Radical Biol Med，2024，212：65-79.

［33］ CHO H W，JIN H S，EOM Y B.FGFRL1 and FGF genes are associated with height，hypertension，and osteoporosis［J］.PLoS One，2022，17（8）：e0273237.

［34］ LIAO F C，LIAO Z Q，ZHANG T，et al.ECFC-derived exosomal THBS1 mediates angiogenesis and osteogenesis in distraction osteogenesis via the PI3K/AKT/ERK pathway［J］.J Orthop Translat，2022，37：12-22.

［35］ BRUN J，ANDREASEN C M，EJERSTED C，et al.PDGF receptor signaling in osteoblast lineage cells controls bone resorption through upregulation of Csf1 expression［J］.J Bone Miner Res，2020，35（12）：2458-2469.

（編輯 郭云雁）