PPP5C基因調(diào)控牛脂肪細(xì)胞增殖、分化的功能研究

摘 要： 旨在探究PPP5C基因在牛脂肪細(xì)胞增殖、分化過程中的作用。本研究以固原黃牛為研究對(duì)象，在牛前體脂肪細(xì)胞中進(jìn)行PPP5C基因功能缺失和功能獲得性試驗(yàn)，利用qRT-PCR、EdU、CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測候選標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活力，甘油三酯（TG）檢測、油紅O、BODIPY和Nile red染色結(jié)果為脂肪細(xì)胞分化過程中脂滴蓄積情況提供表型數(shù)據(jù)支撐。結(jié)果表明，相比對(duì)照組，干擾PPP5C基因顯著上調(diào)增殖標(biāo)志基因（CDK1、CDK2和PCNA）mRNA表達(dá)量（Plt;0.01），細(xì)胞活力顯著上升（Plt;0.01），促進(jìn)牛前體脂肪細(xì)胞從S期向G2期的轉(zhuǎn)變（Plt;0.01）。研究結(jié)果也提示，PPP5C可能也在牛前體脂肪分化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。主要表現(xiàn)在干擾PPP5C基因后，顯著上調(diào)成脂標(biāo)志基因（PPARγ、C/EBPα和FABP4）的mRNA表達(dá)（Plt;0.01），脂肪細(xì)胞中TG含量顯著增多（Plt;0.01）。同時(shí)，油紅O、BODIPY和Nilered染色的細(xì)胞表型數(shù)據(jù)結(jié)果提示干擾PPP5C會(huì)促進(jìn)牛前體脂肪細(xì)胞分化，脂滴蓄積增多。而PPP5C基因的功能獲得性試驗(yàn)結(jié)果恰好與之相反。綜上，干擾PPP5C基因后促進(jìn)牛前體脂肪細(xì)胞增殖和分化，過表達(dá)PPP5C基因后抑制牛前體脂肪細(xì)胞增殖和分化，提示PPP5C基因可能在牛前體脂肪細(xì)胞增殖和分化過程中作為負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮作用。本研究為進(jìn)一步探究PPP5C基因調(diào)控牛脂肪沉積分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞： PPP5C；牛；前體脂肪細(xì)胞；分化；增殖；流式細(xì)胞術(shù)

中圖分類號(hào)：S823.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4391-12

收稿日期：2024-03-25

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U22A20506；32072720）；寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2023BCF01006；2021BEF01002）；自治區(qū)科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2020GKLRLX02）

作者簡介：馮 蘭（1990-） ，女，寧夏吳忠人，碩士生，主要從事肉牛遺傳育種研究，E-mail： 15202683541@163.com

*通信作者：馬 云，主要從事生物技術(shù)與牛的生產(chǎn)和遺傳改良，E-mail： mayun@nxu.edu.cn

Study on the Function of PPP5C Gene in Regulating the Proliferation and Differentiation

of Bovine Adipocytes

FENG" Lan1， FENG" Xue1， MA" Yulin1， ZHANG" Lingkai1， MA" Yanfen1， WEI" Dawei1， LI" Fen2， ZHANG" Lupei3， YANG" Runjun4， MA" Yun1*， CAI" Bei1*

（1.Key Laboratory of Ruminants Molecular Cell Breeding，College of Animal Science and Technology， Ningxia University， Yinchuan 750021， China;

2.School of Food Science and Engineering， Ningxia University， Yinchuan 750021， China;

3.Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China;

4.College of Animal Science， Jilin University， Changchun 130000， China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the role of PPP5C gene in the proliferation and differentiation of bovine adipocytes. Loss-of-function and gain-of-function experiments of PPP5C gene were performed in precursor adipocytes of Guyuan cattle. mRNA expression levels of marker genes and cell proliferation viability were detected using qRT-PCR， EdU， CCK-8 and flow cytometry. The results of TG assay， Oil Red O， BODIPY and Nile red staining provided phenotypic data support of lipid droplets accumulation during adipocytes differentiation. The results showed that， compared with the control group， interfering with the PPP5C gene significantly up-regulated the mRNA expression of proliferation marker genes （CDK1， CDK2， and PCNA） （Plt;0.01）， and cell viability was significantly increased （Plt;0.01）， which facilitated the transition of bovine precursor adipocytes from the S-phase to the G2-phase （Plt;0.01）. The results also suggested that PPP5C might also play a negative regulatory role in bovine precursor adipose differentiation. This was mainly manifested in the significant up-regulation of mRNA expression of lipogenic marker genes （PPARγ， C/EBPα， and FABP4） （Plt;0.01） and the significant increase of TG content in adipocytes （Plt;0.01） after interfering with the PPP5C gene. Meanwhile， the results of cellular phenotypic data of Oil Red O， BODIPY and Nilered staining suggested that interfering with PPP5C promoted bovine precursor adipocyte differentiation and increased lipid droplet accumulation. The results of functional acquisition experiments with the PPP5C gene were just the opposite. In summary， interfering with the PPP5C gene promotes bovine precursor adipocyte proliferation and differentiation， and overexpression of the PPP5C gene inhibits bovine precursor adipocyte proliferation and differentiation， suggesting that the PPP5C gene may play a role as a negative regulator in bovine precursor adipocyte proliferation and differentiation. This study provides basic data for further investigation of the molecular mechanism of PPP5C gene in regulating bovine fat deposition.

Key words： PPP5C; bovine; precursor adipocytes; differentiation; proliferation; flow cytometry

*Corresponding author： MA Yun， E-mail： mayun@nxu.edu.cn

脂肪沉積和脂肪酸代謝是一個(gè)復(fù)雜而又高度協(xié)調(diào)的基因表達(dá)程序，涉及前體脂肪細(xì)胞的增殖、分化和成熟，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量基因參與調(diào)控這一形成過程，這些調(diào)節(jié)過程中所涉及的重要調(diào)控因子主要包括糖皮質(zhì)激素、各種細(xì)胞因子、胰島素、脂聯(lián)素和瘦素，以及對(duì)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控起著至關(guān)重要作用的轉(zhuǎn)錄因子PPARy、C/EBPs和SREBP-1c等［1-3］。

PPP5C基因是PPP家族的一種蛋白磷酸酶，有研究證明干擾PPP5C導(dǎo)致Dvl2磷酸化在基礎(chǔ)水平和Wnt刺激后均升高［4］。PPP5C基因與多種應(yīng)激蛋白相互作用，包括凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）、熱休克蛋白-90（HSP-90）和HSP-90合子復(fù)合蛋白（糖皮質(zhì)激素受體［GR］、STIP1、CDC37）等［5-7］。PPP5C基因在物種間具有高度保守性［8］（在氨基酸水平上，牛和人類約98%、與小鼠具有99%以上的同一性）（NCBI保守型檢測），表明PPP5C的作用在哺乳動(dòng)物中是保守的。本課題組前期測序結(jié)果顯示，該基因在固原黃牛中的表達(dá)量高于和牛和中國西門塔爾牛。從功能上講，PPP5C已被證實(shí)是激素和應(yīng)激相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)劑［9-10］，參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞周期控制和細(xì)胞生長［11］，同時(shí)，PPP5C基因還被發(fā)現(xiàn)與肥胖和胰島素存在密切關(guān)系，例如，敲低PPP5C可防止高脂飲食（HFD）引起的小鼠體重增加［8］。然而，截止目前PPP5C基因?qū)εＶ境练e的作用尚不明晰。因此，本研究通過進(jìn)行PPP5C功能獲得和缺失試驗(yàn)，采用qRT-PCR、CCK-8、EdU、流式細(xì)胞術(shù)、TG檢測、油紅O、BODIPY和Nile red染色方法探究PPP5C基因在牛脂肪細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮的作用，以期為進(jìn)一步探究其對(duì)牛脂肪沉積的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 牛脂肪組織采集與細(xì)胞分離

本試驗(yàn)中使用的細(xì)胞取自固原黃牛健康公犢（1周齡）皮下脂肪細(xì)胞，利用高糖DMEM培養(yǎng)基，添加1%青鏈霉素和10%胎牛血清（FBS）培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

胎牛血清（PAN，德國）、高糖DMEM（BI，以色列）、胰酶（HyClone，美國）、青鏈霉素雙抗（HyClone，美國）、2×M5HiPerSYBRPremixEsTaq（聚合美，中國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；CCK-8試劑（蘭博利德，中國）；EDU增殖檢測試劑盒（碧云天，中國）、TG測試盒（建成，中國）；細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒（碧云天，中國）。

1.3 牛前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

本試驗(yàn)采用組織塊法分離培養(yǎng)牛前體脂肪細(xì)胞。

組織塊法：將剔除表皮、筋膜、血管的脂肪組織用PBS溶液（含1%青鏈霉素）清洗2次后，剪成1 mm3大小的脂肪塊；依據(jù)一定密度接種于9 cm皿中，37℃倒置培養(yǎng)6 h，向皿中加入10 mL培養(yǎng)基（貼壁，不可晃動(dòng)），37℃，5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，并定期觀察。大概長到5 d的時(shí)候細(xì)胞出現(xiàn)，8 d左右挑出組織塊，進(jìn)行清洗消化傳代凍存。

獲得的細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，將培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（地塞米松、IBMX、胰島素、羅格列酮、雙抗、高糖DMEM），2 d后，棄去誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，加維持培養(yǎng)基（胰島素、羅格列酮、雙抗、高糖DMEM），每2 d換液1次并收集一批細(xì)胞。誘導(dǎo)8 d后，收獲最后一批細(xì)胞，用于qRT-PCR分析。

1.4 PPP5C siRNA的合成和轉(zhuǎn)染

由上海生工合成3條針對(duì)牛PPP5C基因的siRNA和1條陰性對(duì)照（表1）。當(dāng)前體脂肪細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%左右時(shí)，換成opti/DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并利用LipofectamineTM 3000試劑進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6 h換為生長培養(yǎng)基培養(yǎng)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：當(dāng)脂肪細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)進(jìn)行消化，計(jì)數(shù)后將每組細(xì)胞配成1.0×105個(gè)·mL-1后，六孔板中每孔加入2 mL的無抗培養(yǎng)基，每孔鋪130 μL細(xì)胞，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；12～20 h后，觀察細(xì)胞的融合率達(dá)到70%～90%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染；配制質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液，干擾片段體系，A液：100 μL opti＋3.75 μL Lipo3000；B液：100 Ml opti+7 μL NC/si；過表達(dá)體系，A液：100 μL opti+3.75 μL Lipo3000；B液：100 μL opti+4 μL P3000+2 500（ng）/質(zhì)粒（ng·μL-1）。各體系轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育5 min；A液轉(zhuǎn)入B液混勻，常溫靜置15 min；轉(zhuǎn)入先提前加入1 000 μL opti/DMEM的6孔板中，6 h后換成完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，利用TRIZOL收取細(xì)胞，直接使用進(jìn)行下一步試驗(yàn)或者-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

收取細(xì)胞后離心，棄去上清，然后每孔加200 μL氯仿，劇烈振蕩混勻1 min，冰上靜置2 min，循環(huán)10 min；4℃離心機(jī)，12 000 r·min-1離心15 min；吸取上清至新的1.5 mL無酶EP管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕度混勻1 min，冰上靜置2 min，循環(huán)10 min；4℃，12 000 r·min-1離心10 min后，棄掉上清液；4℃預(yù)冷的75%乙醇（含DEPC水）洗滌，4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min，循環(huán)兩遍，棄去上清，冰上放置15～30 min，先添加20～60 μL RNase-free水，等待充分溶解后，測定RNA的濃度與吸光值，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

總RNA反轉(zhuǎn)錄操作參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

引物使用NCBI在線網(wǎng)站和Primer6.0相結(jié)合設(shè)計(jì)，脂肪細(xì)胞增殖（CDK1、CDK2和PCNA）和脂肪細(xì)胞分化（PPARγ、CEBPα和FABP4）標(biāo)志基因及內(nèi)參引物序列見表2。

1.7 細(xì)胞增殖測定

使用CCK-8方法對(duì)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行定量分析，具體步驟如下：細(xì)胞經(jīng)過消化作用、重懸和計(jì)數(shù)后，鋪于96孔板上，細(xì)胞貼壁后，根據(jù)分組進(jìn)行對(duì)應(yīng)處理，在每個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)（0、6、12、24、36和48 h）棄上清，加入CCK-8試劑10 μL于每孔中，經(jīng)過1 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm OD值。

1.8 EdU檢測

牛脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染 48 h 后棄去培養(yǎng)液，將已預(yù)熱的EdU工作液（EdU工作液∶培養(yǎng)基=1∶1）加入培養(yǎng)板中，孵育6 h。棄培養(yǎng)液，加入適量固定液，室溫條件下固定15 min。根據(jù)EdU試劑盒操作說明進(jìn)行洗滌、通透，最后進(jìn)行 Click 反應(yīng)和細(xì)胞核進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下進(jìn)行熒光檢測，并拍照記錄。

1.9 TG測定

細(xì)胞樣品經(jīng)PBS清洗后，加入200 μL勻漿介質(zhì)，并于冰水浴條件下進(jìn)行超聲破碎。采用TG測定試劑盒（南京建成）檢測處理組與試驗(yàn)組脂肪細(xì)胞中TG含量。計(jì)算公式如下：

甘油三脂含量（mmol·g-1 pro）=樣本OD值-空白OD值校準(zhǔn)OD值-空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol·L-1）÷細(xì)胞數(shù)量。

1.10 染色方法

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)油紅O染色、BODIPY染色、Nile red染色操作說明書分別進(jìn)行染色，后于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行成像檢測。

1.11 細(xì)胞流式檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶消化細(xì)胞，加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液后1 000 g離心5 min，小心吸取上清后加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸取上清，加入1 mL預(yù)冷70% 乙醇，輕輕吹打混勻后固定24 h后，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞后吸棄上清后使用0.5 mL碘化丙啶染色液37℃避光孵育30 min，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期（每個(gè)處理組有3個(gè)重復(fù)）。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析方法

利用2-ΔΔCt法分析qRT-PCR 結(jié)果，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用GraphPadPrism9.5.1對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析并作圖，Plt;0.05（*）表示差異顯著；Plt;0.01（**）表示差異極顯著；Pgt;0.05（ns）表示無顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 牛前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)

利用組織塊法成功分離得到牛脂肪細(xì)胞（圖 1A），當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%以上進(jìn)行傳代培養(yǎng)（圖 1B、C），此時(shí)牛脂肪細(xì)胞形態(tài)良好，形態(tài)規(guī)則、呈長梭形。

2.2 前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型的構(gòu)建

首先，構(gòu)建牛前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型。油紅O和BODIPY染色結(jié)果表明，相對(duì)于分化0 d的前體脂肪細(xì)胞，分化6 d后的細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積明顯增多（圖2A，B）。成脂分化標(biāo)志基因C/EBPα和PPARγ的mRNA表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間增加（相對(duì)分化0 d），其表達(dá)顯著上調(diào)（圖2C，D；Plt;0.01）。結(jié)果表明，牛前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型構(gòu)建成功，模型可用于后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí)，檢測PPP5C基因在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的時(shí)序表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)PPP5C在脂肪細(xì)胞分化過程中顯著上調(diào)，且在分化4 d后的脂肪細(xì)胞中表達(dá)最高（圖2E；Plt;0.01）。

2.3 PPP5C基因過表達(dá)載體的構(gòu)建、過表達(dá)效率以及干擾片段的篩選

由上海生工進(jìn)行PPP5C基因過表達(dá)載體構(gòu)建，簡單過程即將PPP5C基因CDS區(qū)連接到pcDNA3.1載體上，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，凝膠電泳檢測表明pcDNA3.1-PPP5C過表達(dá)載體構(gòu)建成功。qRT-PCR檢測過表達(dá)效率結(jié)果顯示，相對(duì)于OE-NC組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PPP5C過表達(dá)質(zhì)粒后，牛前體脂肪細(xì)胞中PPP5C的表達(dá)水平顯著上升（圖3A；Plt;0.01）。

將設(shè)計(jì)的3條siRNA序列轉(zhuǎn)染至牛前體脂肪細(xì)胞中，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，相對(duì)于si-NC組，3條siRNA片段均使PPP5C基因的表達(dá)量顯著下降，其中si-PPP5C-425干擾效果最佳（圖3B；Plt;0.01），因此后續(xù)試驗(yàn)采用si-PPP5C-425進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

2.4 干擾PPP5C基因調(diào)控牛脂肪細(xì)胞增殖的作用

通過轉(zhuǎn)染si-PPP5C-425至細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)PPP5C基因功能缺失，探究PPP5C對(duì)牛前體脂肪細(xì)胞增殖的影響。qRT-PCR結(jié)果表明，與si-NC組相比，干擾PPP5C后導(dǎo)致脂肪增殖標(biāo)志基因CDK1、CDK2和PCNA的表達(dá)量顯著上升（圖4A；Plt;0.01）；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾PPP5C基因促進(jìn)了細(xì)胞從S期向G2期轉(zhuǎn)變（圖4B，C）。EdU染色結(jié)果顯示，干擾PPP5C基因后牛脂肪細(xì)胞顯著增多（圖4D，E；Plt;0.01）；CCK-8檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示干擾PPP5C基因后細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（圖4F；Plt;0.01）。綜上所述，干擾PPP5C基因后促進(jìn)牛脂肪細(xì)胞的增殖。

2.5 過表達(dá)PPP5C基因調(diào)控牛脂肪細(xì)胞增殖的作用

通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PPP5C至細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)PPP5C基因功能獲得，探究PPP5C對(duì)牛前體脂肪細(xì)胞的增殖的影響。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，相對(duì)于pcDNA3.1組，過表達(dá)PPP5C顯著下調(diào)CDK1、CDK2和PCNA的表達(dá)量（圖5A；Plt;0.01）。細(xì)胞周期檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PPP5C抑制了細(xì)胞從S期向G2期轉(zhuǎn)變（圖5B ，C；Plt;0.01）。同時(shí)，EdU結(jié)果顯示，過表達(dá)PPP5C基因后牛前體脂肪細(xì)胞增殖顯著減少（圖5D，E；Plt;0.01）。CCK-8檢測細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PPP5C基因?qū)е屡Ｖ炯?xì)胞的活力顯著降低（圖5F；Plt;0.01）。綜上，過表達(dá)PPP5C基因抑制牛脂肪細(xì)胞增殖。

2.6 干擾PPP5C基因?qū)εＶ炯?xì)胞分化的影響

通過轉(zhuǎn)染si-PPP5C-425至細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)PPP5C基因功能缺失，探究PPP5C對(duì)牛前體脂肪細(xì)胞的分化的影響。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，與si-NC組相比，干擾PPP5C后顯著上調(diào)脂肪分化標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4的mRNA表達(dá)水平（圖6A；Plt;0.01）。BODIPY、油紅O、Nile red染色結(jié)果顯示，干擾PPP5C基因明顯促進(jìn)牛前體脂肪細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴蓄積（圖6B，C，D）。同樣，TG含量測定數(shù)據(jù)與上述結(jié)果一致（圖6E；Plt;0.01）。綜上所述，干擾PPP5C基因促進(jìn)牛前體脂肪細(xì)胞的分化。

2.7 過表達(dá)PPP5C基因?qū)εＶ炯?xì)胞分化的影響

通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PPP5C至細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)PPP5C基因功能獲得，探究PPP5C對(duì)牛前體脂肪細(xì)胞的分化的影響。結(jié)果顯示，相對(duì)于pcDNA3.1組，過表達(dá)PPP5C顯著下調(diào)成脂標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4的mRNA的表達(dá)水平（圖7A；Plt;0.01）。BODIPY、油紅O、Nile red染色結(jié)果顯示，過表達(dá)PPP5C基因明顯下調(diào)牛前體脂肪細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴蓄積（圖7B，C，D）；同樣，TG含量測定數(shù)據(jù)與上述結(jié)果一致（圖7E；Plt;0.01）。綜上所述，過表達(dá)PPP5C基因后抑制牛脂肪細(xì)胞的分化。

3 討 論

在動(dòng)物體內(nèi)，脂肪主要包括內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪、肌間脂肪和肌內(nèi)脂肪（IMF）［12］。脂肪組織的形成是脂肪細(xì)胞數(shù)量增加以及體積增大，受轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路的精準(zhǔn)調(diào)控［13］。本研究主要對(duì)PPP5C基因在牛脂肪細(xì)胞沉積中的作用進(jìn)行探究。

3.1 PPP5C基因在牛脂肪生成中的作用

脂肪組織是一種復(fù)雜且重要的代謝和內(nèi)分泌器官，主要由前體脂肪細(xì)胞發(fā)育而來，并以脂質(zhì)的形式儲(chǔ)存能量。脂肪細(xì)胞來源于中胚層中產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），MSC可以分化成多種細(xì)胞類型，包括脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞等。脂肪生成的初始階段主要涉及脂肪祖細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［14］，該過程受到多種信號(hào)的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞外因子（如成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）和細(xì)胞外基質(zhì) （ECM）等）［15］ 。在增殖階段，脂肪細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，并出現(xiàn)一系列激素和生長因子來促進(jìn)有絲分裂。當(dāng)增殖的脂肪細(xì)胞數(shù)量過多而受到抑制時(shí)，分化轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)被激活，細(xì)胞由梭型變?yōu)閳A形，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯開始大量積累，最終形成脂滴。在脂肪形成的末期，還有一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子控制前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，如CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBPs）［16］、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等，它們誘導(dǎo)許多參與脂質(zhì)代謝的下游靶基因的表達(dá)。

PPP5C是蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶家族的一員，通過調(diào)節(jié)蛋白絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化以及激活或失活相應(yīng)底物，在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。

PPP5C被發(fā)現(xiàn)在幾乎所有人體組織中表達(dá)，并參與許多細(xì)胞過程［17］。PPP5C 可以通過影響絲裂原激活蛋白激酶 （MAPK） 信號(hào)通路的活性來干擾細(xì)胞增殖和分化［18］。Jeong等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，PPP5C在酵母增殖細(xì)胞中表達(dá)水平升高。隨后的幾項(xiàng)研究報(bào)告也稱，PPP5C在乳腺癌、套細(xì)胞淋巴瘤和肝癌組織以及腹水中表達(dá)上調(diào)［20］。另一方面，PPP5C基因在脂肪細(xì)胞分化中的作用在小鼠中也有相關(guān)的研究，比如有研究者發(fā)現(xiàn)抑制 PPP5C 活性可能有助于在糖皮質(zhì)激素治療期間預(yù)防肥胖［21］。此外，本課題組前期分析發(fā)現(xiàn)，該基因在固原黃牛與和牛中存在的較高的差異表達(dá)。綜上，推測該基因在牛脂肪細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，但是目前并未發(fā)現(xiàn)該基因在脂肪細(xì)胞中的相關(guān)研究，因此，深入研究PPP5C基因?qū)εＶ炯?xì)胞增殖、分化的作用，對(duì)于改善牛肉質(zhì)性狀具有重要意義。

3.2 PPP5C基因影響牛脂肪細(xì)胞的增殖

PPP5C基因是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，屬于磷蛋白磷酸酶（PPP）家族［22］。與大多數(shù)其他PPP家族磷酸酶不同的是，PPP5C是單個(gè)亞基酶，利用其N端TPR結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)底物識(shí)別和活性調(diào)節(jié)。PPP5C的基礎(chǔ)磷酸酶活性相對(duì)較低，這是因?yàn)門PR結(jié)構(gòu)域與C端αJ螺旋之間的相互作用產(chǎn)生了分子內(nèi)自抑制作用［23］。在人體腫瘤研究中，通過慢病毒介導(dǎo)的short hairpin RNA（shRNA）敲除PPP5C基因可明顯抑制細(xì)胞增殖［24］。在胰腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)PPP5C通過促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲而在胰腺癌中具有預(yù)后作用，并發(fā)現(xiàn)miR-520-5p與PPP5C之間存在靶向抑制關(guān)系［25］。在癌癥方面，PPP5C 在增殖和細(xì)胞存活中的作用及其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其成為潛在有吸引力的治療靶點(diǎn)，并且在乳腺癌和腎癌臨床研究中發(fā)現(xiàn) PPP5C 表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞增殖［26］。如果PPP5C在P位點(diǎn)去磷酸化，其高度保守的催化核心和雙金屬系統(tǒng)（M1/M2）將轉(zhuǎn)變?yōu)榈孜锝Y(jié)合和水解位點(diǎn)，就會(huì)導(dǎo)致PPP5C的過度表達(dá)，這也是細(xì)胞增殖的原因之一［27］。

細(xì)胞增殖主要有S期（合成期）和M期（有絲分裂期），這兩者之間還包含兩個(gè)中間期：G1（G0）和G2期［28］。CDK的活性是通過與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合來調(diào)節(jié)，CDK1在G1之前的M期被激活﹐CDK2在G1/S轉(zhuǎn)化時(shí)與CCNE結(jié)合，在S期時(shí)與CCNA結(jié)合［29］。PCNA是DNA聚合酶在復(fù)制過程中必不可少的輔助因子，且其可將聚合酶與DNA結(jié)合并顯著增加其合成能力［30］。在本研究中，干擾PPP5C后顯著促進(jìn)了增殖標(biāo)志基因CDK1、CDK2和PCNA的表達(dá)（Plt;0.05），同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)顯示干擾PPP5C顯著增加了S期牛脂肪細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)量，其可通過縮短G1/S期轉(zhuǎn)化的時(shí)間促進(jìn)牛脂肪細(xì)胞增加，進(jìn)而正向調(diào)控牛脂肪細(xì)胞增殖，過表達(dá)后結(jié)果則與之相反。而本研究與之前的研究結(jié)果不符，考慮可能存在物種間及樣本間的差異，這也為后期進(jìn)一步研究提供了參考。

3.3 PPP5C基因影響牛脂肪細(xì)胞的分化

脂肪細(xì)胞的分化受到轉(zhuǎn)錄因子（TFs）、酶、激素和信號(hào)通路形成的復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子通過識(shí)別特定的DNA序列來調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程。有研究者發(fā)現(xiàn)，PPP5C基因主要富集在24個(gè)與脂肪沉積和脂肪酸合成有關(guān)功能分子中［31］。為了更好地了解PPP5C基因在生物學(xué)中的作用，研究者們利用PPP5C基因敲除小鼠（PPP5C（-/-））研究其在高脂飲食引起的肥胖和胰島素抵抗中的作用，結(jié)果顯示，盡管攝入的熱量相似，但與野生型同窩小鼠（PPP5C（+/+））相比，基因敲除小鼠（PPP5C（-/-））在高脂飲食中的體重明顯減少，而且沒有積累內(nèi)臟脂肪，血糖控制有明顯改善［8］。在另一項(xiàng)使用小鼠細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的試驗(yàn)中，PPP5C基因敲除動(dòng)物顯示出較低的脂質(zhì)沉積和較低的脂肪酸合成，PPP5C可通過同時(shí)抑制GR-α和過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARγ）在分別促進(jìn)脂肪分解或脂肪生成的位點(diǎn)上的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)脂肪生成的作用，這表明PPP5C基因參與了低油酸的調(diào)控機(jī)制，重申了該基因與脂肪酸的關(guān)系［32］。PPP5C 的底物包括糖皮質(zhì)激素受體 （GR）、腫瘤抑制因子 p53、Hsp90 和共伴侶 Cdc37［33］，由于這一特性，PPP5C 與哮喘、心臟病、糖尿病、脂質(zhì)代謝和肥胖等疾病相關(guān)［34］。

成脂標(biāo)志基因PPAR和C/EBP在脂肪細(xì)胞生成過程中相互作用、相互調(diào)控，共同調(diào)控著成脂基因的表達(dá)和胰島素的敏感性，推動(dòng)著脂肪生成的進(jìn)程，CEBPB和C/EBP6在早期激活PPAR表達(dá)中起重要作用，激活的PPAR誘導(dǎo)CEBPA和其他成脂基因的表達(dá)從而促進(jìn)分化之后CEBPA又通過正反饋回路維持PPAR的表達(dá)［35］。FABP4主要參與體內(nèi)平衡相關(guān)的多種代謝功能，通過與激素敏感脂肪酶相互作用進(jìn)行脂解調(diào)節(jié)［36］。在本研究中，干擾PPP5C促進(jìn)了脂肪標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4的表達(dá)（Plt;0.05），并增加了脂滴生成和甘油三酯含量（Plt;0.05），過表達(dá)PPP5C基因則抑制了脂肪標(biāo)志基因PPARγ、CEBPα和FABP4的表達(dá)（Plt;0.05），減少了脂滴生成和甘油三酯含量（Plt;0.05）。

4 結(jié) 論

綜上，本研究構(gòu)建了PPP5C基因過表達(dá)載體并篩選了最佳干擾片段，探究PPP5C基因?qū)εＶ炯?xì)胞增殖和分化的作用。結(jié)果表明，干擾PPP5C基因促進(jìn)牛脂肪細(xì)胞的增殖和分化，而過表達(dá)后則抑制牛脂肪細(xì)胞的增殖和分化。該研究結(jié)果為進(jìn)一步探究PPP5C基因調(diào)控牛脂肪細(xì)胞的分子機(jī)制提供參考。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ ALVAREZ-GUAITA A，PATEL S，LIM K，et al.Phenotypic characterization of Adig 1 mice suggests roles for adipogenin in the regulation of fat mass accrual and leptin secretion［J］.Cell Rep，2021，34（10）：108810.

［2］ GWON M H，YUN J M.Phenethyl isothiocyanate improves lipid metabolism and inflammation via mTOR/PPARγ/AMPK signaling in the adipose tissue of obese mice［J］.J Med Food，2021，24（6）：666-669.

［3］ 劉 暢，郝科興，陳 巖，等.干擾PPARγ基因?qū)d羊滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和脂質(zhì)積累的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2024，55（6）：2421-2430.

LIU C，HAO K X，CHEN Y，et al.Effects of interference with PPARγ gene on proliferation，apoptosis，migration and lipid accumulation of trophoblast cells in sheep［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2024，55（6）：2421-2430.（in Chinese）

［4］ XIE J L，HAN M，ZHANG M J，et al.PP5 （PPP5C） is a phosphatase of Dvl2［J］.Sci Rep，2018，8（1）：2715.

［5］ MORITA K I，SAITOH M，TOBIUME K，et al.Negative feedback regulation of ASK1 by protein phosphatase 5 （PP5） in response to oxidative stress［J］.EMBO J，2001，20（21）：6028-6036.

［6］ SKARRA D V，GOUDREAULT M，CHOI H，et al.Label-free quantitative proteomics and SAINT analysis enable interactome mapping for the human Ser/Thr protein phosphatase 5［J］.Proteomics，2011，11（8）：1508-1516.

［7］ SILVERSTEIN A M，GALIGNIANA M D，CHEN M S，et al.Protein phosphatase 5 is a major component of glucocorticoid receptor·hsp90 complexes with properties of an FK506-binding immunophilin［J］.J Biol Chem，1997，272（26）：16224-16230.

［8］ GRANKVIST N，HONKANEN RE，SJ?HOLM ，et al.Genetic disruption of protein phosphatase 5 in mice prevents high-fat diet feeding-induced weight gain［J］.FEBS Lett，2013，587（23）：3869-3874.

［9］ HINDS T D JR，SNCHEZ E R.Protein phosphatase 5［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40（11）：2358-2362.

［10］ GOLDEN T，SWINGLE M，HONKANEN R E.The role of serine/threonine protein phosphatase type 5 （PP5） in the regulation of stress-induced signaling networks and cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2008，27（2）：169-178.

［11］ LI G Y，LIU J Z，ZHANG L，et al.Knockdown of protein phosphatase 5 （PPP5C） suppresses the growth of leukemic cell line U937［J］.Cell Mol Biol （Noisy-le-grand），2016，62（11）：27-31.

［12］ 王中波，劉 爽，賀麗霞，等.固原黃牛不同部位肌肉組織代謝組學(xué)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2024，55（4）：1565-1578.

WANG Z B，LIU S，HE L X，et al.Metabolomics analysis on different muscle tissues of Guyuan cattle［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2024，55（4）：1565-1578.（in Chinese）

［13］ GAO Y H，WANG S Z，MA Y F，et al.Circular RNA regulation of fat deposition and muscle development in cattle［J］.Vet Med Sci，2022，8（5）：2104-2113.

［14］ UEZUMI A，ITO T，MORIKAWA D，et al.Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle［J］.J Cell Sci，2011，124（Pt 21）：3654-3664.

［15］ ZAMANI N，BROWN C W.Emerging roles for the transforming growth factor-β superfamily in regulating adiposity and energy expenditure［J］.Endocr Rev，2011，32（3）：387-403.

［16］ HAUSMAN G J，DODSON M V，AJUWON K，et al.BOARD-INVITED REVIEW：the biology and regulation of preadipocytes and adipocytes in meat animals［J］.J Anim Sci，2009，87（4）：1218-1246.

［17］ XU X L，LAGERCRANTZ J，ZICKERT P，et al.Chromosomal localization and 5′ sequence of the human protein serine/threonine phosphatase 5′ gene［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，218（2）：514-517.

［18］ VON KRIEGSHEIM A，PITT A，GRINDLAY G J，et al.Regulation of the Raf-MEK-ERK pathway by protein phosphatase 5［J］.Nat Cell Biol，2006，8（9）：1011-1016.

［19］ JEONG J Y，JOHNS J，SINCLAIR C，et al.Characterization of Saccharomyces cerevisiae protein Ser/Thr phosphatase T1 and comparison to its mammalian homolog PP5［J］.BMC Cell Biol，2003，4：3.

［20］ GOLDEN T，ARAGON I V，RUTLAND B，et al.Elevated levels of Ser/Thr protein phosphatase 5 （PP5） in human breast cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1782（4）：259-270.

［21］ JACOB W，ROSENZWEIG D，VZQUEZ-MARTIN C，et al.Decreased adipogenesis and adipose tissue in mice with inactivated protein phosphatase 5［J］.Biochem J，2015，466（1）：163-176.

［22］ SHI Y G.Serine/threonine phosphatases：mechanism through structure［J］.Cell，2009，139（3）：468-484.

［23］ YANG J，ROE S M，CLIFF M J，et al.Molecular basis for TPR domain-mediated regulation of protein phosphatase 5［J］.EMBO J，2005，24（1）：1-10.

［24］ CHEN M，LV J M，YE J Q，et al.Disruption of serine/threonine protein phosphatase 5 inhibits tumorigenesis of urinary bladder cancer cells［J］.Int J Oncol，2017，51（1）：39-48.

［25］ FU R B，SHAO Q，YANG B，et al.MiR-520a-5p/PPP5C regulation pattern is identified as the key to gemcitabine resistance in pancreatic cancer［J］.Front Oncol，2022，12：903484.

［26］ THIJS J L，HERATH A，DE BRUIN-WELLER M S，et al.Multiplex platform technology and bioinformatics are essential for development of biomarkers in atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol，2017，139（3）：1065.

［27］ SALTER E A，WIERZBICKI A，HONKANEN R E.Quantum-based modeling of dephosphorylation in the catalytic site of serine/threonine protein phosphatase-5 （PPP5C）［J］.Catalysts，2020，10（6）：674.

［28］ MATSON J P，COOK J G.Cell cycle proliferation decisions：the impact of single cell analyses［J］.FEBS J，2017，284（3）：362-375.

［29］ 宋雅萍，張久盤，魏大為，等.FOXO1基因調(diào)控牛前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的功能研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2024，29（4）：226-238.

SONG Y P，ZHANG J P，WEI D W，et al.Study on the function of FOXO1 gene in regulating the proliferation and differentiation of bovine preadipocytes［J］.Journal of China Agricultural University，2024，29（4）：226-238.（in Chinese）

［30］ CHOE K N，MOLDOVAN G L.Forging ahead through darkness：PCNA，still the principal conductor at the replication fork［J］.Mol Cell，2017，65（3）：380-392.

［31］ SCHETTINI G P，PERIPOLLI E，ALEXANDRE P A，et al.Transcriptomic profile of Longissimus thoracis associated with fatty acid content in Nellore beef cattle［J］.Anim Genet，2022，53（3）：264-280.

［32］ HINDS T D JR，STECHSCHULTE L A，CASH H A，et al.Protein phosphatase 5 mediates lipid metabolism through reciprocal control of glucocorticoid receptor and peroxisome proliferator-activated receptor-γ （PPARγ）［J］.J Biol Chem，2011，286（50）： 42911-42922.

［33］ MA C H，CUI Z L，WANG Y C，et al.Bioinformatics analysis reveals TSPAN1 as a candidate biomarker of progression and prognosis in pancreatic cancer［J］.Bosn J Basic Med Sci，2021，21（1）：47-60.

［34］ WU M Y，LAI T T，LIAO W T，et al.Clinicopathological and prognostic significance and molecular mechanisms governing uveal melanoma［J］.Ther Adv Med Oncol，2020，12：1758835920917566.

［35］ 高玉紅，馮 雪，汪書哲，等.黃牛circCAP2在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的功能研究［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2023， 31（7）：1441-1449.

GAO Y H，F(xiàn)ENG X，WANG S Z，et al.Function of circCAP2 in the differentiation of cattle （Bos taurus） preadipocytes［J］.Journal of Agricultural Biotechnology，2023，31（7）：1441-1449.（in Chinese）

［36］ PRENTICE K J，SAKSI J，HOTAMISLIGIL G S.Adipokine FABP4 integrates energy stores and counterregulatory metabolic responses［J］.J Lipid Res，2019，60（4）：734-740.

（編輯 郭云雁）