基于不同方法的微量細(xì)胞全基因組遺傳變異檢測(cè)和比較分析

摘 要： 旨在用不同方法對(duì)微量細(xì)胞全基因組遺傳變異進(jìn)行檢測(cè)和比較分析。本研究首先以3、5、7、10個(gè)豬耳緣成纖維細(xì)胞為試驗(yàn)材料，利用不同方法提取微量細(xì)胞基因組，進(jìn)行全基因組測(cè)序 （whole genome sequencing， WGS），比較不同細(xì)胞數(shù)及不同提取方法之間的遺傳變異檢測(cè)性能。隨后利用牛囊胚的5個(gè)和7個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞獲得的基因組進(jìn)行全基因組測(cè)序和SNP芯片技術(shù)的比較分析，每組均進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果表明，針對(duì)不同細(xì)胞數(shù)，基于全基因組擴(kuò)增技術(shù) （whole genomic amplification， WGA） 的MDA （multiple displacement amplification） 方法均比其他方法的DNA產(chǎn)物濃度、測(cè)序質(zhì)量及SNP檢出性能效果更優(yōu)。使用REPLI-g? Single Cell Kit擴(kuò)增7、10細(xì)胞數(shù)的DNA濃度顯著高于3、5細(xì)胞數(shù)，但質(zhì)量評(píng)估的各項(xiàng)性能基本無顯著差異，且不同細(xì)胞數(shù)檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)數(shù)量相似。5、7細(xì)胞數(shù)的Illumina Bovine GGP芯片SNP位點(diǎn)call rate分別為74.09%和81.52%。全基因組測(cè)序相較于芯片可以獲得更豐富的遺傳變異信息，但兩種檢測(cè)手段共同檢測(cè)到的SNP以及基因型相同的位點(diǎn)數(shù)占比較低。綜上所述，本研究系統(tǒng)比較了不同細(xì)胞數(shù)下不同微量細(xì)胞基因組提取方法以及不同全基因組遺傳變異檢測(cè)技術(shù)的各項(xiàng)性能，結(jié)果顯示利用REPLI-g? Single Cell Kit擴(kuò)增7細(xì)胞進(jìn)行二代測(cè)序可得到較為準(zhǔn)確且穩(wěn)定的結(jié)果，本研究建立了一套較為可靠的家畜胚胎微量細(xì)胞樣品基因組提取和遺傳變異檢測(cè)方案，為將來實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的胚胎基因組選擇和胚胎質(zhì)量評(píng)估具有重要的意義和價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 微量細(xì)胞；胚胎；全基因組擴(kuò)增；重測(cè)序；SNP芯片；遺傳變異

中圖分類號(hào)：S828.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4311-14

收稿日期：2024-04-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2022YFD1302200）

作者簡(jiǎn)介：石慶珍（1999-），女，侗族，貴州黎平人，碩士生，主要從事動(dòng)物分子遺傳育種研究，E-mail：sqz20000515@163.com

*通信作者：姜 力，主要從事動(dòng)物分子遺傳育種和功能基因組學(xué)研究，E-mail：lijiang@cau.edu.cn

Detection and Comparative Analysis of Genomic Genetic Variations in Trace Cells Using

Different Methods

SHI" Qingzhen1， XU" Hongyang2， ZHANG" Yan3， ZHANG" Yi1， WANG" Yachun1， HAN" Jianyong2， JIANG

Li1*

（1.State Key Laboratory of Animal Biotech Breeding，College of Animal Science and Technology，China

Agricultural University， Beijing 100193，" China;

2.College of Biological Sciences， China Agricultural

University， Beijing 100193，" China;

3.Shandong OX Livestock Breeding Co.， Ltd.， Jinan 250100，

China）

Abstract：" The aim of this study was to detect and compare the genetic variation of the whole genome of trace cells by different methods. In this study， 3， 5， 7 and 10 cell numbers from pig ear fibroblasts were used as experimental materials， and trace cell genomes were extracted by different methods for whole genome sequencing （WGS） to compare the performance of genetic variation detection among different cell numbers and extraction methods. Subsequently， comparative analysis of whole genome sequencing and SNP chip technology was conducted using the genomes obtained from 5 or 7 bovine trophectoderm cells， with 3 replicates per group. The results showed that the multiple displacement amplification （MDA） method based on whole genomic amplification （WGA） technology had better DNA product concentration， sequencing data quality and SNP detection performance than other methods for different cell numbers. The DNA concentrations of 7 and 10 cell numbers amplified by REPLI-g? Single Cell Kit were significantly higher than those of 3 and 5 cell numbers， but there was no significant difference in the performance of quality assessment， and the number of SNPs detected was similar in different cell numbers. The call rates of Illumina Bovine GGP chip with 5 and 7 cell numbers were 74.09% and 81.52%， respectively. The results showed that more genetic variation information could be obtained by whole genome sequencing compared to SNP chips， but the proportion of SNPs and the number of loci with the same genotype detected by both methods was low. In conclusion， this study systematically compared the performance of genome extraction methods and whole genome genetic variation detection techniques for different cell numbers. The results showed that NGS amplification of 7 cells using the REPLI-g? Single Cell Kit could obtain relatively accurate and stable results. This study established a reliable genome extraction and genetic variation detection scheme for trace cell samples of livestock embryos， which is of important significance and value for accurate embryo genomic selection and embryo quality assessment in the future.

Key words： trace cells; embryo; whole genome amplification; resequencing; SNP chip; genetic variation

*Corresponding author： JIANG Li， E-mail：lijiang@cau.edu.cn

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，活體采卵 （ovum pickup， OPU）、體外受精 （in vitro fertilization， IVF）、胚胎移植 （embryo transfer， ET） 和體外生產(chǎn) （in vitro production， IVP） 等一系列家畜繁殖技術(shù)都取得了巨大進(jìn)步。這些技術(shù)的應(yīng)用對(duì)奶牛的良種擴(kuò)繁發(fā)揮了重要作用，并且進(jìn)一步縮短了世代間隔，加快了群體遺傳進(jìn)展［1］。目前，IVP技術(shù)正在成為優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源擴(kuò)繁的一項(xiàng)重要技術(shù)［2］。國(guó)際胚胎技術(shù)協(xié)會(huì)（international embryo technology society， IETS） 發(fā)布的牛胚胎生產(chǎn)和移植數(shù)據(jù)顯示，2020年全球范圍內(nèi)（不包含亞洲）生產(chǎn)了超過100萬枚體外胚胎，相比2019年增加了12.1%［3］。近年來，基因組選擇技術(shù) （genomic selection， GS）在奶牛育種中已得到廣泛應(yīng)用，大幅提高了育種效率。最近的研究顯示，基于胚胎的基因組選擇技術(shù)體系正在逐步建立。例如，F(xiàn)ujii等［4］采用囊胚階段的胚胎細(xì)胞（15個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行SNP芯片檢測(cè)，對(duì)日本黑牛的胴體和肉質(zhì)性狀進(jìn)行了胚胎植入前基因組評(píng)估，結(jié)果表明對(duì)植入前的胚胎進(jìn)行基因組選擇具有實(shí)際應(yīng)用潛力。

干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為加速動(dòng)物育種提供了新的契機(jī)。目前已有研究利用小鼠多能干細(xì)胞 （pluripotent stem cell， PSC） 體外誘導(dǎo)生殖細(xì)胞進(jìn)行配子重建，形成精子或卵母細(xì)胞，可在培養(yǎng)皿中完成完整的生殖循環(huán)。2018年，Bogliotti等［5］從牛囊胚中獲得牛胚胎干細(xì)胞 （embryonic stem cell， ESC） ，為家畜的體外生殖細(xì)胞誘導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)。同年，Hou等［6］在家畜育種中提出了一種基于胚胎干細(xì)胞技術(shù)的育種方案設(shè)想，即通過建立核心繁育群體，利用GS挑選出的優(yōu)秀種公牛精液進(jìn)行體外受精，與優(yōu)良母牛生產(chǎn)優(yōu)良胚胎建立胚胎核心育種群，然后對(duì)胚胎進(jìn)行全基因組測(cè)序或基因分型，用于胚胎基因組育種值的評(píng)估。將具有優(yōu)秀基因組育種值的胚胎用于衍生胚胎干細(xì)胞 （regenerated ESC， rESC） ，體外誘導(dǎo)進(jìn)行配子重建，再進(jìn)入下一周期的胚胎生產(chǎn)，快速實(shí)現(xiàn)從親本胚胎到子代胚胎的跨代育種。隨后，Goszczynski等［7］也在家畜中提出了類似的胚胎育種實(shí)施方案。該策略的實(shí)現(xiàn)有望大幅縮短世代間隔，加快群體遺傳進(jìn)展。

胚胎植入前進(jìn)行遺傳評(píng)估的前提是獲得發(fā)育胚胎的基因組DNA。然而由于活檢會(huì)對(duì)胚胎造成一定的損傷，因此需要切割細(xì)胞的數(shù)量盡可能少。二倍體哺乳動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞大約含有6 pg的基因組［8］。然而，全基因組重測(cè)序通常需要納克乃至微克水平的DNA進(jìn)行文庫(kù)制備［9］。目前的研究顯示，胚胎活檢通常采集10～15個(gè)細(xì)胞［10］，然而超過10個(gè)細(xì)胞就有可能降低胚胎活力，從而導(dǎo)致妊娠率降低。因此，如何通過有限的細(xì)胞數(shù)量獲得高質(zhì)量的基因組一直是胚胎植入前檢測(cè)和基因組育種值評(píng)估的瓶頸問題。全基因組擴(kuò)增技術(shù) （whole genome amplification， WGA） 是用于處理有限數(shù)量的起始遺傳物質(zhì)的主要手段，可產(chǎn)生微克級(jí)的反應(yīng)產(chǎn)物。目前，WGA技術(shù)主要包括degenerate oligonucleotide primer PCR （DOP-PCR）［11］、multiple displacement amplification （MDA）［12］和multiple annealing and looping-based amplification cycles （MALBAC）［13］3種方法。此外，有研究顯示法醫(yī)檢驗(yàn)人體微量脫落細(xì)胞時(shí)，通常使用磁珠法和硅膠膜離心柱法進(jìn)行DNA提取及純化［14］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)微量細(xì)胞取樣數(shù)量、擴(kuò)增手段以及檢測(cè)方法的比較研究仍非常有限。

研究顯示，IVP產(chǎn)生約25%～40%染色體異常的牛胚胎，可能會(huì)導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育失敗、妊娠失敗或不育動(dòng)物的出生［15］。目前胚胎移植的活產(chǎn)比例只有50%左右［16］。因此，在胚胎移植前對(duì)其進(jìn)行遺傳變異檢測(cè)和胚胎質(zhì)量評(píng)估對(duì)提高胚胎移植的活產(chǎn)率具有重要意義。Hou等［17］利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)單個(gè)卵細(xì)胞進(jìn)行高精度全基因組測(cè)序，以獲得受精卵中源自母源基因組的信息，用于檢測(cè)與遺傳疾病有關(guān)的DNA序列變異，從而提高受精成功率。本研究以豬耳緣成纖維細(xì)胞和牛囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞為試驗(yàn)材料，通過比較不同細(xì)胞數(shù)量、不同提取方法之間的基因組遺傳變異檢測(cè)性能，建立一種較為可靠的家畜胚胎早期全基因組遺傳變異檢測(cè)方法，為將來實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確性的家畜胚胎基因組遺傳評(píng)估和胚胎質(zhì)量評(píng)估提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬耳緣成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自有。牛胚胎是第6～7天的囊胚或擴(kuò)張囊胚，為中國(guó)荷斯坦牛體外受精所生產(chǎn)并進(jìn)行體外培養(yǎng)，由山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司提供，采用液氮進(jìn)行運(yùn)輸并保存。

試驗(yàn)中使用的試劑盒包括全基因組擴(kuò)增試劑和DNA提取試劑兩類（圖1）。WGA試劑包括3種：REPLI-g? Single Cell Kit購(gòu)自QIAGEN、GenomePlex? Whole Genome Amplification購(gòu)自Sigma-Aldrich、MALBAC? Single Cell WGA Kit購(gòu)自Yikon。DNA提取試劑包括3種：EasyPure Micro Genomic DNA Kit購(gòu)自TransGen、MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit購(gòu)自TransGen、TIANamp Micro DNA Kit購(gòu)自TIANGEN。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬耳緣成纖維細(xì)胞DNA獲取

挑取狀態(tài)較好、較圓滑的豬耳緣成纖維細(xì)胞，通過口吸管分別吸取3、5、7、10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分裝，嚴(yán)格按照上述各試劑說明書進(jìn)行基因組擴(kuò)增或DNA提取，每種方法進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.2 牛胚胎滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞DNA獲取

使用一次性無菌胰島素注射器針頭切割牛胚胎的透明帶，利用口吸管吸取牛囊胚的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，按照5、7個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分裝，嚴(yán)格按照REPLI-g? Single Cell Kit （Qiagen） 試劑說明書進(jìn)行操作，每組進(jìn)行3個(gè)胚胎重復(fù)。

1.2.3 DNA樣品質(zhì)量檢測(cè)和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

利用Qubit 3.0 （Thermo Fisher Scientific，美國(guó)） 對(duì)獲得的樣品DNA進(jìn)行精確定量。樣品濃度≥20 ng·μL-1，總量≥500 ng即滿足重測(cè)序建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)滿足標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳，檢測(cè)DNA純度及完整性。DNA總量大于500 ng則滿足固相GGP-100K SNP芯片雜交需求。

1.2.4 DNA樣品重測(cè)序

使用Illumina Novaseq-S4測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行PE150模式測(cè)序，耳緣成纖維細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)量為6 G，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞為20 G。原始測(cè)序數(shù)據(jù) （Raw Data） 以fastq文件格式存儲(chǔ)，委托北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和統(tǒng)計(jì)分析

利用fastp軟件 （https：∥github.com/OpenGene/fastp） 對(duì)Raw Data進(jìn)行過濾，去除含接頭、N的個(gè)數(shù)大于3、低質(zhì)量的Reads后獲得Clean Data。測(cè)序數(shù)據(jù)文件使用Samtools （1.9）［18］的flagstat模塊統(tǒng)計(jì)雙端reads比對(duì)率，使用Genome Analysis TK-3.8-0 （https：∥github.com/broadinstitute/gatk） 的DepthOfCoverage模塊統(tǒng)計(jì)測(cè)序深度以及覆蓋度。

1.2.6 測(cè)序數(shù)據(jù)遺傳變異檢測(cè)

利用Burrows Wheeler Aligner （BWA）［19］軟件比對(duì)到參考基因組 （豬耳緣成纖維細(xì)胞為Sscrofa 11.1，牛胚胎滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞為ARS-UCD 1.2）。比對(duì)后的sam文件利用Samtools （1.9）［18］轉(zhuǎn)為二進(jìn)制格式bam文件，使用picard （http：∥broadinstitute.github.io/picard/） 軟件和GATK （4.1.2.0）［20］軟件進(jìn)行標(biāo)記排序。使用GATK （4.1.2.0） 軟件的BaseRecalibrator 獲取堿基質(zhì)量校正表文件，使用ApplyBQSR對(duì)堿基質(zhì)量進(jìn)行校正，使用HaplotypeCaller生成各樣本的gVCF文件，運(yùn)行過程采用默認(rèn)參數(shù)。使用Genome Analysis TK-3.8-0的GenotypeGVCFs模塊進(jìn)行多個(gè)樣本合并檢測(cè)。利用GATK （4.2.0.0）軟件的SelectVariants模塊分別輸出SNP和INDEL突變，利用bcftools （1.11）［21］注釋各樣本檢測(cè)的SNP位點(diǎn)占dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)收錄位點(diǎn)的比例。

1.2.7 SNP芯片基因型檢測(cè)和質(zhì)控

將質(zhì)檢合格的DNA樣品使用Illumina Bovine GGP （100K） 芯片進(jìn)行基因型檢測(cè)，委托紐勤生物科技（上海）有限公司完成。GGP-100K芯片雜交后得到的SNP位點(diǎn)分型原始文件使用PLINK （1.90）［22］進(jìn)行質(zhì)控，刪除重復(fù)位點(diǎn)以及沒有準(zhǔn)確位置的位點(diǎn)。以牛ARS-UCD 1.2參考基因組為基因芯片位點(diǎn)的參考 （REF） 堿基，將forward鏈的位點(diǎn)文件轉(zhuǎn)為VCF格式文件，將芯片數(shù)據(jù)中未判型的位點(diǎn)進(jìn)行剔除。

1.2.8 測(cè)序數(shù)據(jù)與芯片數(shù)據(jù)比對(duì)分析

首先，將芯片分型結(jié)果中的野生純合型位點(diǎn)進(jìn)行剔除。野生純合型是指2個(gè)等位基因均與參考基因組堿基一致的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在重測(cè)序數(shù)據(jù)的變異檢測(cè)過程中未被判定為SNP。其次，利用bcftools （1.11）［21］軟件比較測(cè)序得到的SNP VCF文件與芯片數(shù)據(jù)過濾后的VCF文件，輸出各樣本共有和特有的SNP位點(diǎn)及基因型，然后統(tǒng)計(jì)SNP判型相同的位點(diǎn)個(gè)數(shù)。

1.2.9 數(shù)據(jù)與分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)豬耳緣組織7、10細(xì)胞數(shù)進(jìn)行兩組間的配對(duì)t檢驗(yàn)，不同試劑盒及相同試劑盒的不同細(xì)胞數(shù)3組及以上采用單因素方差分析 （ANOVA），多重比較采用Boferroni校正法，當(dāng)方差不齊時(shí)采用Tamhane’T2方法進(jìn)行校正，牛囊胚5、7細(xì)胞數(shù)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。校正后Plt;0.05被認(rèn)為達(dá)到差異顯著水平，使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖?；赗語言環(huán)境利用CMplot包繪制SNP密度圖。

2 結(jié) 果

2.1 7細(xì)胞和10細(xì)胞數(shù)不同試劑盒效果分析

2.1.1 DNA濃度結(jié)果比較

本研究首先選擇7個(gè)和10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行6種試劑盒的比較分析，每個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。對(duì)36份耳緣成纖維細(xì)胞樣品的DNA濃度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示對(duì)于7細(xì)胞獲得的DNA產(chǎn)物濃度，REPLI-g? Single Cell Kitgt;MALBAC? Single Cell WGA Kitgt;GenomePlex? Whole Genome Amplificationgt;TIANamp Micro DNA Kitgt;EasyPure Micro Genomic DNA Kitgt;MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit （表1）。除EasyPure Micro Genomic DNA Kit與TIANamp Micro DNA Kit、MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit之間無顯著差異，其他各試劑盒之間的差異均達(dá)到顯著水平 （Plt;0.05） 。對(duì)于10細(xì)胞獲得的DNA產(chǎn)物濃度，REPLI-g? Single Cell Kitgt;GenomePlex? Whole Genome Amplificationgt;MALBAC? Single Cell WGA Kitgt;TIANamp Micro DNA Kitgt;MagicPure Microbiome DNA Isolation Kitgt;EasyPure Micro Genomic DNA Kit，其中REPLI-g? Single Cell Kit與其他試劑盒的DNA濃度結(jié)果均存在顯著差異 （Plt;0.05） ，而其余試劑盒提取結(jié)果之間不存在顯著差異。

由于直接提取法獲得的產(chǎn)物濃度較低、總量較少，本研究?jī)H對(duì)WGA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示REPLI-g? Single Cell Kit得到的DNA片段較長(zhǎng)，條帶相對(duì)清晰，可觀察到明顯的DNA條帶；MALBAC? Single Cell WGA Kit與GenomePlex? Whole Genome Amplification得到的條帶較短，無明顯主帶，并出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象（圖2）。

2.1.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

7細(xì)胞和10細(xì)胞的原始測(cè)序數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)質(zhì)量結(jié)果見表2和表3。7細(xì)胞數(shù)和10細(xì)胞數(shù)測(cè)序數(shù)據(jù)Clean rate 在88.87%～99.58%之間，Q20均高于94.30%，GC含量在39.95%～48.78%之間，然而DOP-PCR法 （GenomePlex? Whole Genome Amplification） 獲取樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)Q20顯著低于其他試劑盒。比較10細(xì)胞數(shù)測(cè)序數(shù)據(jù)的Clean Rate，可以看出EasyPure Micro Genomic DNA Kit、GenomePlex? Whole Genome Amplification方法以及REPLI-g? Single Cell Kit方法顯著優(yōu)于MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit （Plt;0.05） 。此外，對(duì)于7細(xì)胞和10細(xì)胞，磁珠法 （MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit）、DOP-PCR （GenomePlex? Whole Genome Amplification）和MDA （REPLI-g? Single Cell Kit） 方法獲取樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)GC含量均與參考基因組的42%相近，表明這3種試劑盒在測(cè)序過程中出現(xiàn)序列偏向的可能性較低。

2.1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)參考基因組結(jié)果分析

在7、10細(xì)胞數(shù)下，分別對(duì)不同試劑盒獲得樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行參考基因組比對(duì)，結(jié)果如表4、5所示。對(duì)于7細(xì)胞數(shù)，REPLI-g? Single Cell Kit測(cè)序數(shù)據(jù)的平均深度Mean顯著高于3種直接提取法，表現(xiàn)最優(yōu)；柱膜法的TIANamp Micro DNA Kit表現(xiàn)最差。對(duì)于10細(xì)胞數(shù)，除MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit之外，WGA擴(kuò)增方法與直接提取方法之間的Mean均差異顯著 （Plt;0.05）。對(duì)于7細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的覆蓋度Coverage，柱膜法 （TIANamp Micro DNA Kit） 顯著低于其他擴(kuò)增方法 （Plt;0.05），且3種WGA擴(kuò)增方法之間存在顯著差異 （Plt;0.05）。對(duì)于10細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的Coverage，各WGA擴(kuò)增方法均顯著高于直接提取方法EasyPure Micro Genomic DNA Kit和TIANamp Micro DNA Kit （Plt;0.05）。此外，10細(xì)胞數(shù)WGA擴(kuò)增方法中REPLI-g? Single Cell Kit的測(cè)序數(shù)據(jù)Mapped rate和Pair mapped rate表現(xiàn)最優(yōu)，并顯著高于GenomePlex? Whole Genome Amplification和MALBAC? Single Cell WGA Kit （Plt;0.05）。

2.2 相同試劑盒不同細(xì)胞數(shù)的各性能比較

2.2.1 DNA濃度結(jié)果比較

基于上述研究結(jié)果選取3種表現(xiàn)較好的試劑盒（TIANamp Micro DNA Kit、MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit和REPLI-g? Single Cell Kit）進(jìn)行3、5、7、10細(xì)胞的DNA提取和質(zhì)量比較。結(jié)果顯示REPLI-g? Single Cell Kit的7、10細(xì)胞數(shù)與3、5細(xì)胞數(shù)獲得的DNA濃度之間存在顯著差異 （Plt;0.05）；而7細(xì)胞與10細(xì)胞數(shù)之間、3細(xì)胞和5細(xì)胞數(shù)之間的DNA濃度差異并不顯著（圖3），且對(duì)于3、5、7、10細(xì)胞數(shù)，REPLI-g? Single Cell Kit擴(kuò)增產(chǎn)物濃度均在120 ng·μL-1以上。TIANamp Micro DNA Kit、MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit試劑盒的3、5、7、10細(xì)胞數(shù)之間的DNA濃度差異均不顯著（圖3）。

2.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估結(jié)果

對(duì)于Clean Rate、Q20與GC含量，MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit的3、5細(xì)胞數(shù)測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果均顯著高于7、10細(xì)胞數(shù) （Plt;0.05），而7細(xì)胞和10細(xì)胞之間、3細(xì)胞和5細(xì)胞之間差異并不顯著（圖4）。對(duì)于Q20，REPLI-g? Single Cell Kit的3、5細(xì)胞數(shù)顯著高于10細(xì)胞數(shù) （Plt;0.05），7細(xì)胞數(shù)與其他細(xì)胞數(shù)差異不顯著；對(duì)于GC含量，REPLI-g? Single Cell Kit的3、5、7、10細(xì)胞數(shù)之間差異均不顯著，最為接近參考基因組的GC含量。對(duì)于Mapped rate、Mean和Coverage，REPLI-g? Single Cell Kit仍然是表現(xiàn)最優(yōu)；MagicPure Microbiome DNA Isolation Kit在不同細(xì)胞數(shù)之間表現(xiàn)不穩(wěn)定，7、10細(xì)胞數(shù)總體高于3、5細(xì)胞數(shù) （Plt;0.05）；TIANamp Micro DNA Kit表現(xiàn)最劣，各細(xì)胞數(shù)之間測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)比較均差異不顯著（圖5）。

2.2.3 不同方法及細(xì)胞數(shù)間遺傳變異檢測(cè)結(jié)果的比較

對(duì)各試劑盒獲取的3、5、7、10細(xì)胞數(shù)基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳變異檢測(cè)，每組3個(gè)重復(fù)樣品合并后的結(jié)果如表6所示。對(duì)于所有細(xì)胞數(shù)，MDA法的（REPLI-g? Single Cell Kit）試劑盒檢出的"""" SNP位點(diǎn)數(shù)均高于其余兩種試劑盒。各試劑盒檢出的SNPs占dbSNP庫(kù)比例為47.56%～82.46%。其中REPLI-g? Single Cell Kit的3、5、7、10細(xì)胞數(shù)之間檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)數(shù)相似，檢出的SNPs收錄在dbSNP庫(kù)中的比例最高 （82.46%） 。

對(duì)檢出的SNP位點(diǎn)以0.01 Mb為窗口繪制SNP密度分布圖，結(jié)果顯示REPLI-g? Single Cell Kit多數(shù)區(qū)域SNP密度均在50個(gè)以內(nèi)，而其余兩種試劑盒多數(shù)區(qū)域SNP密度均在10個(gè)以內(nèi)（圖6～圖8）。

2.3 牛囊胚不同細(xì)胞數(shù)SNP檢測(cè)結(jié)果比較分析

基于上述結(jié)果，選擇性能最優(yōu)的REPLI-g? Single Cell Kit提取擴(kuò)增5個(gè)和7個(gè)牛囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞基因組，進(jìn)行重測(cè)序（gt; 20 Gb）和SNP芯片檢測(cè)，用于比較不同技術(shù)的SNP檢測(cè)效果。

2.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

根據(jù)各樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)可知Clean rate均高于98%，Q20均高于96%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。7細(xì)胞的GC含量均值為41.27%，與參考基因組的42%相近。5細(xì)胞的GC含量均值為40.03%，出現(xiàn)輕微的序列偏向性。將各樣本測(cè)序數(shù)據(jù)與牛的參考基因組比對(duì)，各項(xiàng)性能7細(xì)胞均比5細(xì)胞略高。其中關(guān)于Coverage，5細(xì)胞均值為64.90%，7細(xì)胞數(shù)均值為87.93%。此外，5細(xì)胞數(shù)重復(fù)樣本之間變異較大，可能是由于細(xì)胞數(shù)量過少，基因組提取過程中更容易產(chǎn)生誤差造成的。

2.3.2 測(cè)序數(shù)據(jù)遺傳變異檢測(cè)結(jié)果

5、7細(xì)胞數(shù)的全基因組SNP和Indel檢測(cè)結(jié)果如表7所示，檢測(cè)到的SNPs占dbSNP庫(kù)比例為87.98%～89.26%，7細(xì)胞數(shù)各結(jié)果均高于5細(xì)胞數(shù)。

2.3.3 SNP芯片檢測(cè)結(jié)果

利用GGP-100K芯片進(jìn)行牛胚胎5、7細(xì)胞全基因組SNP的檢測(cè)。結(jié)果如表8所示，5細(xì)胞基因組檢測(cè)SNP的Call Rate在60.83～84.48%（平均為74.09%），檢出SNP位點(diǎn)數(shù)量最高為80475個(gè)。7細(xì)胞基因組檢測(cè)SNP的Call Rate在72.13～87.23%（平均為81.52%），檢出SNP位點(diǎn)數(shù)量最高為83 092個(gè)。5細(xì)胞和7細(xì)胞檢測(cè)SNP基因型的Call rate結(jié)果無顯著差異 （Pgt;0.05）。

2.3.4 芯片和測(cè)序SNP檢測(cè)結(jié)果的比較

5、7細(xì)胞數(shù)芯片和測(cè)序分別檢測(cè)到的SNP數(shù)量及基因型相同的SNP數(shù)量如圖9所示，結(jié)果顯示測(cè)序檢測(cè)出的SNP位點(diǎn)數(shù)顯著高于芯片檢測(cè)結(jié)果。然而，兩種檢測(cè)方法檢測(cè)到的共有SNP數(shù)量占比較低，其中5細(xì)胞樣品中兩種檢測(cè)方法共同檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)數(shù)最多為20 122個(gè)，僅占芯片檢測(cè)總位點(diǎn)數(shù)的21.12%。7細(xì)胞樣品中兩種方法共同檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)最多為20 671個(gè)，僅占芯片檢測(cè)總位點(diǎn)數(shù)的21.70%。此外，兩種檢測(cè)方法檢測(cè)相同SNP位點(diǎn)的基因型存在不一致的情況。例如，5細(xì)胞樣品中兩種方法檢測(cè)到相同SNP位點(diǎn)且基因型一致的最多為17 546個(gè)；7細(xì)胞樣品中最多為17 575個(gè)SNP。5細(xì)胞中相同SNP位點(diǎn)但基因型結(jié)果不一致的位點(diǎn)占比在12.80%～20.36%之間。7細(xì)胞中相同SNP位點(diǎn)但基因型結(jié)果不一致的位點(diǎn)占比在14.98%～44.18%之間。不同方法對(duì)微量細(xì)胞SNP基因型檢測(cè)的可靠性有待于進(jìn)一步比較分析。

3 討 論

哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中，第一次細(xì)胞分化事件是囊胚內(nèi)部的細(xì)胞分化為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層，胚胎干細(xì)胞源自植入前囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。目前，牛的胚胎干細(xì)胞已經(jīng)成功獲得［5］?；诖?，Goszczynski等［7］和Hou等［6］先后提出了利用胚胎干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行家畜體外育種 （in vitro breeding， IVB） 的設(shè)想，即將基因組選擇與衍生胚胎干細(xì)胞和多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞的體外分化相結(jié)合，通過縮短世代間隔進(jìn)一步加速家畜群體的遺傳改良。在家畜胚胎移植前對(duì)早期胚胎進(jìn)行育種價(jià)值和胚胎質(zhì)量的評(píng)估具有重要的意義和價(jià)值。由于對(duì)胚胎進(jìn)行試驗(yàn)需要最小化地?fù)p傷胚胎，因此切割合理的細(xì)胞數(shù)、高效的基因組獲取方法及準(zhǔn)確的遺傳變異檢測(cè)手段顯得尤為重要。

目前微量細(xì)胞DNA提取和擴(kuò)增方法還比較有限。MDA技術(shù)能夠?qū)θ蚪M進(jìn)行高保真的均勻擴(kuò)增，擴(kuò)增效率高，僅依靠極少的起始DNA便能擴(kuò)增到足夠測(cè)序的DNA量［23-24］。本研究的結(jié)果顯示，基于MDA原理的REPLI-g? Single Cell Kit對(duì)微量細(xì)胞的全基因組擴(kuò)增能力最強(qiáng)，對(duì)相同起始量的細(xì)胞樣本，其產(chǎn)物濃度最高，與其他方法均存在顯著差異。這與于婷等［25］利用3種不同的WGA方法擴(kuò)增微量細(xì)胞的結(jié)果相似。2018年，He等［26］利用外周血、細(xì)胞系、廢棄胚胎、單個(gè)細(xì)胞及5個(gè)細(xì)胞試驗(yàn)樣本對(duì)MDA和MALBAC方法進(jìn)行CNV、SNV的檢測(cè)性能比較，發(fā)現(xiàn)MDA的擴(kuò)增率優(yōu)于MALBAC方法，并證實(shí)了MDA在檢測(cè)SNP方面比MALBAC具有更好的效果。Zhang等［27］利用6種細(xì)胞系對(duì)比了4種常見的WGA試劑盒，結(jié)果顯示基于DOP-PCR與MALBAC兩種原理的試劑盒在擴(kuò)增效率、準(zhǔn)確性等方面具有相似的結(jié)果，與本研究結(jié)果一致。

高通量測(cè)序已經(jīng)成為目前獲取基因組信息的主流方式。在利用高通量測(cè)序進(jìn)行遺傳變異檢測(cè)的過程中，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量、比對(duì)率及測(cè)序深度等因素均影響遺傳變異的檢測(cè)效果。在本研究中，雖然不同細(xì)胞數(shù)以及不同試劑盒獲得的產(chǎn)物在測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估上表現(xiàn)出一定的差異，但測(cè)序數(shù)據(jù)量以及質(zhì)量均達(dá)到分析要求。然而，這些方法在擴(kuò)增的均勻性及基因組覆蓋度方面表現(xiàn)不佳，這可能與微量DNA擴(kuò)增的起始基因組產(chǎn)物有偏相關(guān)。此外，本研究對(duì)比3種不同方法的SNP檢測(cè)效果，結(jié)果顯示基于MDA原理的REPLI-g? Single Cell Kit檢出的SNP數(shù)量最多，并且在3、5、7、10細(xì)胞數(shù)之間無顯著差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，測(cè)序與芯片共同檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)數(shù)量較少，這可能是由于測(cè)序和固相芯片檢測(cè)SNP的原理不同造成的?？紤]到液相芯片檢測(cè)SNP基因型的原理與測(cè)序相似，本試驗(yàn)未使用液相芯片進(jìn)行對(duì)比研究。通常對(duì)個(gè)體進(jìn)行基因組育種值預(yù)測(cè)時(shí)，需要SNP芯片的檢出率高于90%，而本次研究結(jié)果均未達(dá)到90%，表明目前WGA方法獲取的微量細(xì)胞基因組雖然滿足固相芯片檢測(cè)的樣品標(biāo)準(zhǔn)，但仍無法保證獲得準(zhǔn)確穩(wěn)定的分型結(jié)果。胡智輝等［28］利用MALBAC方法擴(kuò)增牛早期胚胎，除了使用切割1/2胚胎的試驗(yàn)組以外，其余各組的芯片檢出率均低于90%，與本研究結(jié)果相似。李鈺華等［29］利用4份模擬胚胎樣本（含3～5個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行MDA擴(kuò)增，從而比較NGS與全基因組SNP芯片對(duì)胚胎植入前的檢測(cè)性能，發(fā)現(xiàn)某些特殊區(qū)域SNP芯片的有效位點(diǎn)不足，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)不穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)，最高僅有21.70%的SNP芯片位點(diǎn)在測(cè)序數(shù)據(jù)中同時(shí)被鑒定到，且存在基因型不一致的情況，表明利用微量樣品獲得的基因組信息進(jìn)行遺傳評(píng)估時(shí)可能會(huì)由于基因型錯(cuò)誤影響評(píng)估結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，后續(xù)有必要深入研究植入前胚胎微量細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果與胚胎移植后產(chǎn)出犢牛基因組檢測(cè)結(jié)果之間的一致性，以保證早期胚胎基因組評(píng)估的準(zhǔn)確性。

除了主流的DOP-PCR、MDA、MALBAC方法，還有其他方法用于全基因組擴(kuò)增，如LIANTI （linear amplification via transposon insertion）［30］、SISSOR （single stranded sequencing using microfluidic reactors）［31］等。此外，還可通過優(yōu)化WGA體系、擴(kuò)增過程所用DNA聚合酶和反應(yīng)步驟［32］提高擴(kuò)增和測(cè)序效果［33］。雖然已有多種方法可以實(shí)現(xiàn)微量細(xì)胞的全基因組擴(kuò)增，然而進(jìn)行WGA的成本仍然較高，并且結(jié)果的可靠性仍有待進(jìn)一步的比較和驗(yàn)證，因此亟待開發(fā)準(zhǔn)確性更高、成本較低的微量細(xì)胞基因組獲取方法。

4 結(jié) 論

本研究利用多個(gè)基于不同原理的試劑盒對(duì)3、5、7、10細(xì)胞進(jìn)行基因組提取及擴(kuò)增，并對(duì)獲得的基因組質(zhì)量和遺傳變異檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，不同細(xì)胞數(shù)和不同提取方法均會(huì)影響DNA產(chǎn)物濃度，從而影響后續(xù)的檢測(cè)效果。其中，基于MDA原理的REPLI-g? Single Cell Kit在產(chǎn)物濃度、測(cè)序質(zhì)量及SNP檢出性能方面效果最佳。5細(xì)胞和7細(xì)胞在牛胚胎的遺傳變異檢測(cè)效果上無顯著差異。此外，固相芯片和測(cè)序兩種檢測(cè)技術(shù)在SNP檢測(cè)方面存在偏好性，兩者共同檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)數(shù)量和基因型的一致性較低，需進(jìn)一步研究。本研究系統(tǒng)比較了不同細(xì)胞數(shù)及不同基因組提取和檢測(cè)方法，初步獲得了一套針對(duì)微量胚胎細(xì)胞遺傳變異檢測(cè)的方案，為將來胚胎基因組選擇技術(shù)的應(yīng)用提供了重要理論依據(jù)。

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（編輯 郭云雁）