芍藥根腐病拮抗內(nèi)生細(xì)菌篩選及拮抗機(jī)制分析

關(guān)鍵詞：芍藥；根腐病；內(nèi)生細(xì)菌；貝萊斯芽孢桿菌；拮抗機(jī)制

中圖分類號：S685.99 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）03—0226—10

芍藥Paeonia lactiflora 是我國傳統(tǒng)名花，為芍藥科Paeoniaceae 芍藥屬Paeonia 多年生宿根花卉，其花大色艷，花型豐富，是園林與切花中常見的花卉，具有較高的觀賞價(jià)值，并且芍藥根可入藥，具有較高的藥用價(jià)值，能夠創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益。隨著芍藥種植面積的擴(kuò)大，在種植過程中，芍藥根部逐漸出現(xiàn)病害，如根腐病、白絹病等，其中根腐病危害最大。芍藥根腐病又稱“爛根病”，為土傳病害。該病危害芍藥根部，須根、主根及根頸部皆可發(fā)病，發(fā)病時(shí)根部組織變黑，影響其吸收功能，從而造成植株地上部長勢衰弱，葉片變黃，嚴(yán)重時(shí)枝條和葉片萎蔫，甚至導(dǎo)致地上部死亡[1]。有研究結(jié)果表明，引起芍藥根腐病的病原菌主要為茄腐皮鐮刀菌Fusarium solani[1-2] 與尖孢鐮刀菌F. oxysporum[3]。由于關(guān)于芍藥根腐病的研究報(bào)道較少，且芍藥與牡丹為同屬植物，可以借鑒牡丹的相關(guān)研究結(jié)果。引起牡丹根腐病的主要病原菌是茄腐皮鐮刀菌，但植物根腐病的發(fā)生一般為多種菌混合侵染引起的，土壤習(xí)居菌（尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani 等）往往與茄腐皮鐮刀菌混合侵染，使得牡丹根腐病發(fā)病原因復(fù)雜[4-5]。

關(guān)于芍藥根腐病防治主要采用化學(xué)防治方法?；瘜W(xué)藥劑的重復(fù)使用及濫用使致病菌抗性增強(qiáng)，并且導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，造成環(huán)境污染，引起一系列的生態(tài)環(huán)境問題。因?yàn)樯炙幵耘喽酁檫B作，根腐病難以被從根本上解決。目前生物防治是病害綠色防治的研究熱點(diǎn)，具有安全長效的優(yōu)點(diǎn)，尤其是內(nèi)生拮抗菌株容易占據(jù)宿主體內(nèi)的生態(tài)位點(diǎn)，抑制病原菌的生長與繁殖，且可以改良土壤和宿主根際微生物環(huán)境，可從根本上解決連作造成的根腐病。芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于植物病害的防治中，其中2005 年被首次報(bào)道的貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis 是一種新型生防菌種[6]，目前已發(fā)現(xiàn)其對多種植物病菌有較好的拮抗效果，對病害有顯著的生防效果。侯勝銘等[7] 從發(fā)病楊樹根際土壤中得到1 株貝萊斯芽孢桿菌B42，其對楊樹根腐病病原菌尖孢鐮刀菌具有顯著的拮抗作用，并對茄腐皮鐮刀菌等其他6 種病原菌具有廣譜抗性。馮寶珍等[8] 從番茄植株體內(nèi)篩選出1 株對多種植物病原菌有較好抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌FQ-G3，其對灰葡萄孢菌Botrytiscinerea 的抑制率達(dá)80.93%，并可顯著抑制灰葡萄孢菌在番茄果實(shí)上的擴(kuò)展。宗英等[9] 從感染赤霉病的麥穗上篩選到1 株高效抑制禾谷鐮刀菌F. graminearum 的貝萊斯芽孢桿菌JS25R，在溫室條件下該菌株能有效降低小麥赤霉病的發(fā)病率、發(fā)病程度和病情指數(shù)。

目前僅見關(guān)于牡丹根腐病生物防治研究的報(bào)道。楊瑞先等[10] 從健康牡丹根部組織中獲得2 株對牡丹根腐病病原菌有良好拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens md8 和md9，并推測起拮抗作用的物質(zhì)為伊枯草菌素。毛咪等[11-12]報(bào)道引起湖南牡丹根腐病的病原菌為茄腐皮鐮刀菌，并從健康牡丹根頸部篩選到1 株對其有明顯拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌MRX2-1，并優(yōu)化了發(fā)酵條件。這些研究結(jié)果豐富了拮抗茄腐皮鐮刀菌的微生物資源。但是關(guān)于芍藥根腐病生物防治的研究鮮見報(bào)道。

本研究中以健康芍藥根部組織為材料，從中分離并篩選對芍藥根腐病菌有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，研究脂肽類物質(zhì)對病原菌的抑制效果，初步探討其生防機(jī)制，以期為芍藥根腐病的生物防治提供微生物資源，為其應(yīng)用開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：健康芍藥根部組織于2022 年5—6 月采自洛陽隋唐遺址公園、洛陽國花園芍藥種植區(qū)，采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行采樣。將采集的樣品放入無菌袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

病原菌：芍藥根腐病病原菌茄腐皮鐮刀菌由本課題組前期分離、鑒定，現(xiàn)保存于洛陽理工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

試劑：OMEGA E.Z.N.A? Bacterial RNA Kit 試劑盒（Omega Bio-Tek 公司）；PrimeScript ? RTreagent Kit RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒與Premix Taq ?試劑盒（TaKaRa 公司）；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）（天根生物工程有限公司）；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；甲醇、鹽酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基：TSA 培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基、NA 培養(yǎng)基、NB 培養(yǎng)基、Landy 培養(yǎng)基，配制方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

將健康芍藥根部組織清洗干凈后，稱取2 g，采用表面消毒法和組織研磨法進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離[14]。

1.2.2 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙法篩選芍藥根腐病病原菌的內(nèi)生拮抗菌株，具體方法：在已活化5 d 的腐皮鐮刀菌邊緣打取5 mm 菌餅反接在PDA 平板中央，分別在距平板邊緣1 cm 處十字對稱點(diǎn)接內(nèi)生細(xì)菌，以僅接病原菌為對照，在28 ℃條件下倒置培養(yǎng)。7 d 后篩選出對病原菌有明顯拮抗作用的菌株，采用牛津杯法進(jìn)行復(fù)篩，具體方法：取1 環(huán)拮抗菌株接入NB 培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下170 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d 后，將發(fā)酵液用0.22 mm 無菌微孔濾膜過濾除菌，備用；將5 mm 病原菌菌餅反接在PDA 平板中央，分別在距平板邊緣1 cm 處放置4個(gè)滅菌牛津杯，牛津杯中分別加入150 mL 滅菌發(fā)酵液，在28 ℃條件下正置培養(yǎng)。每個(gè)菌株重復(fù)3次。7 d 后測量抑菌帶寬，計(jì)算抑菌率（對照組和處理組病原菌菌落直徑的差值占處理組病原菌菌落直徑的百分比）。

1.2.3 拮抗菌株的鑒定

觀察拮抗菌株的形態(tài)學(xué)特征，通過葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、碳源試驗(yàn)等對拮抗菌株的生理生化特性進(jìn)行研究[15-16]。

按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取拮抗菌株基因組DNA。16S rRNA 基因擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1429R（5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′）。反應(yīng)體系共25 mL，為PCRMix 12.5 mL，模板1 mL，引物各1 mL，ddHO 9.5 mL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。采用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并送至生工生物工程（上海）公司測序。將測序結(jié)果上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫，并與數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行Blastn 比對，并用Mega 7.0軟件中的臨近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

1.2.4 拮抗菌株脂肽類物質(zhì)合成基因的擴(kuò)增

分別利用脂肽類物質(zhì)合成功能基因fenA、srfAA和ituD 的引物對拮抗菌株的3 個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果并拍照。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）公司測序，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫的Blastn 程序檢索同源序列，并與GenBank 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析。

1.2.5 拮抗菌株脂肽類物質(zhì)提取和分析

1）脂肽類物質(zhì)的提取 將活化的拮抗菌株以1% 接種量分別接入1 L Landy 培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下170 r/min 振蕩培養(yǎng)，采用酸沉淀和甲醇抽提的方法提取脂肽類物質(zhì)[13]。

2）培養(yǎng)時(shí)間對脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的影響 將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為2、3、4、5、6、7、8、9 d，分別提取不同培養(yǎng)時(shí)間的脂肽類物質(zhì)，并稱量，觀察培養(yǎng)時(shí)間對菌株脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的影響。

3）脂肽類物質(zhì)對芍藥根腐病病原菌的拮抗效果 以拮抗菌株培養(yǎng)3 d 后提取的脂肽類物質(zhì)為材料，采用牛津杯法檢測其對芍藥根腐病菌的拮抗效果。將所提取脂肽類物質(zhì)用適量0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH=7.0）溶解，每個(gè)牛津杯中加入150 mL脂肽類物質(zhì)，具體方法同1.2.2 中復(fù)篩方法。每組處理重復(fù)3 次。在25 ℃條件下培養(yǎng)，7 d 后觀察抑菌效果，測量抑菌帶寬，計(jì)算抑菌率。在光學(xué)顯微鏡下觀察對峙組根腐病病原菌菌絲形態(tài)變化。

1.2.6 拮抗菌株脂肽類物質(zhì)合成基因熒光定量PCR分析

1）菌體收集。采用平板對峙法收集拮抗菌株樣品。在PDA 平板一側(cè)接種直徑5 mm 的病原菌菌餅，另一側(cè)劃線接種拮抗菌株，在28 ℃條件下倒置培養(yǎng)，以僅接種拮抗細(xì)菌的PDA 平板為對照。分別收集對峙培養(yǎng)2、3、4、5、6、7 d 的拮抗菌株菌體5 mg，在-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。以?0個(gè)平板為1 次生物學(xué)重復(fù)，設(shè)3 次重復(fù)。共收集7組細(xì)菌樣品。

2）RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。利用OMEGA E.Z.N.A? Bacterial RNA Kit 試劑盒提取細(xì)菌樣品RNA，利用PrimeScript ? RT reagentKit RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將細(xì)菌樣品RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體方法分別見說明書。樣品RNA 的濃度和純度使用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)測定，并用RNase-free 水將RNA 稀釋到100 mg/L。

3）熒光定量PCR 檢測。根據(jù)拮抗菌株脂肽類物質(zhì)合成基因測序獲得的序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物，引物序列見表2。以細(xì)菌rpsJ 基因作為內(nèi)參基因，利用ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 公司，USA）進(jìn)行樣品定量檢測。熒光定量PCR 的反應(yīng)體系與PCR 的反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[13]。采用2^-ΔΔCt 方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果（C 值）的相對定量[17]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19 和Excel 2010 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選的拮抗細(xì)菌

通過表面消毒法和組織研磨法從健康芍藥根部組織中共分離出48 株具有不同形態(tài)特征的內(nèi)生細(xì)菌，分別命名為H1 ～ H48。采用平板對峙法從中篩選出2 株對芍藥根腐病菌具有拮抗效果的菌株H21 與H35，平均抑菌帶寬分別為2.8、5.8 mm（圖1A）。利用2 個(gè)菌株的發(fā)酵液進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果顯示H21 與H35 的發(fā)酵液對病原菌的平均抑菌帶寬分別為2.0、6.7 mm（圖1B），抑菌率分別為24.1% 與62.5%，其中H35 的拮抗效果較好，且發(fā)酵液的拮抗效果明顯優(yōu)于菌株的拮抗效果，因此使用菌株H35 進(jìn)行鑒定分析及后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 拮抗細(xì)菌的鑒定結(jié)果

在NA 平板上，菌株H35 的菌落為乳白色，干燥，不透明，邊緣不規(guī)則，中間有皺褶。革蘭氏染色結(jié)果顯示為陽性，菌體為桿狀（圖2）。葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)和V-P 試驗(yàn)結(jié)果顯示為陽性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陰性，菌株H35 能夠利用葡萄糖、蔗糖、果糖和甘露醇（表3）。

經(jīng)測序，菌株H35 的16s RNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為1500 bp，上傳至GenBank 后獲得的登錄號為PP213449。Blastn 比對結(jié)果顯示該序列與貝萊斯芽孢桿菌的序列相似性高達(dá)100%，選取與其序列相似度較高的菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株H35 與貝萊斯芽孢桿菌聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，可將菌株H35 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

2.3 拮抗細(xì)菌的拮抗機(jī)制

2.3.1 合成脂肽類物質(zhì)功能基因的擴(kuò)增結(jié)果

采用3 對引物對菌株H35 脂肽類物質(zhì)合成基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果表明菌株H35 能夠擴(kuò)增出fenA、srfAA、ituD 3 個(gè)脂肽類物質(zhì)合成基因的片段，片段長度分別為1555、1640、1 328 bp（圖4）。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將測序所得序列在GenBank 中進(jìn)行Blastn 比對， 結(jié)果表明H35 的fenA 基因片段與貝萊斯芽孢桿菌LDSY2（CP030150）的序列同源性達(dá)到93%，srfAA 基因片段與貝萊斯芽孢桿菌BA-26（CP046918）的序列同源性達(dá)到93%，ituD 基因片段與貝萊斯芽孢桿菌UCMB5140（CP051463）的序列同源性達(dá)到90%。Blastx 比對結(jié)果表明，菌株H35 的fenA、srfAA 基因片段序列與貝萊斯芽孢桿菌豐原素合成酶蛋白序列、表面活性素合成酶蛋白序列相似性均達(dá)到93%，ituD 基因片段序列與伊枯草菌素類桿菌霉素D 合成酶蛋白序列的相似性達(dá)到90%，說明將H35 擴(kuò)增獲得的3 個(gè)基因片段分別為相應(yīng)的脂肽類物質(zhì)合成基因序列，即菌株H35 能夠合成具有抑菌性的脂肽類物質(zhì)。

2.3.2 培養(yǎng)時(shí)間對脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的影響

將拮抗菌株H35 接入1 L Landy 培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)2、3、4、5、6、7、8、9 d 后，所提取脂肽類物質(zhì)的量不同。如圖5 所示：在培養(yǎng)3 d 時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到1 個(gè)小高峰，為184.5 mg/L；在培養(yǎng)6 d時(shí)，其產(chǎn)量達(dá)到最大，為267.5 mg/L。

2.3.3 脂肽類物質(zhì)對芍藥根腐病菌菌絲的影響

采用牛津杯法驗(yàn)證菌株H35 脂肽類粗提物對芍藥根腐病病原菌的拮抗作用。每個(gè)牛津杯中加入150 mL 質(zhì)量濃度為92.25 g/L 的脂肽類物質(zhì)。結(jié)果表明，菌株H35 脂肽類粗提物對芍藥根腐病病原菌有明顯的拮抗作用，平均抑菌帶寬為7.70 mm，抑菌率為73.8%（圖6）。

顯微觀察結(jié)果表明：對照組病原菌菌絲光滑，內(nèi)容物分布均勻；對峙組菌絲出現(xiàn)畸形，大量菌絲頂端及中部出現(xiàn)囊泡化，菌絲變粗，部分菌絲折疊扭曲，并且變空。推測可能是脂肽類物質(zhì)破壞了病原菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄（圖7），表明菌株H35 產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)影響了病原菌菌絲的正常生長。

2.3.4 脂肽類物質(zhì)合成基因的熒光定量PCR分析

平板對峙試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株H35 對芍藥根腐病病原菌的拮抗效果隨培養(yǎng)時(shí)間而變化，接種3 d后的抑菌帶最寬，平均為10.50 mm，接種4 d 后為8.50 mm，接種5 d 后為7.60 mm，接種6 d 后為7.70 mm，接種7 d 后為7.70 mm，抑菌效果在接種6 ～ 7 d 時(shí)趨于穩(wěn)定（圖8）。

所提取菌株H35 的RNA OD260/280 值為2.01，質(zhì)量較好， 能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。fenA、srfAA、ituD 脂肽類物質(zhì)合成基因熒光定量PCR 結(jié)果表明，在與病原菌共培養(yǎng)期間，菌株H35 這3個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生了不同程度的變化（圖9）。與對照相比，ituD 基因與srfAA 基因的表達(dá)量均在對峙培養(yǎng)7 d 時(shí)達(dá)到最大值，分別為對照的8.9、5.1倍，且ituD 基因在對峙培養(yǎng)的2 ～ 7 d 內(nèi)穩(wěn)定保持高表達(dá)量，為對照的3.8 ～ 8.9 倍，fenA 基因的表達(dá)量在對峙培養(yǎng)5 d 時(shí)達(dá)到高峰，為對照的4.6 倍，與其他2 個(gè)基因相比，其對峙培養(yǎng)7 d 內(nèi)的表達(dá)量相對穩(wěn)定，基本為對照的2 ～ 4 倍。熒光定量PCR結(jié)果表明，與芍藥根腐病原菌平板對峙培養(yǎng)期間，菌株H35 的3 個(gè)脂肽類物質(zhì)合成基因均被誘導(dǎo)表達(dá)，其中ituD 基因的表達(dá)量顯著高于對照組，推測在對峙培養(yǎng)期間發(fā)揮主要抑制作用的脂肽類物質(zhì)為伊枯草菌素，表面活性素與豐原素次之，3 種脂肽類物質(zhì)共同作用抑制了病原菌的生長。

3 結(jié)論與討論

通過研究，從健康芍藥根部組織分離篩選出1 株對芍藥根腐病病原菌有良好拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌H35，初步探討了其生防機(jī)制，結(jié)果表明菌株H35 能夠合成非核糖體脂肽類抑菌物質(zhì)表面活性素、豐原素和伊枯草菌素，脂肽類物質(zhì)在與病原菌對峙過程中使病原菌菌絲發(fā)生了畸變，阻礙了病原菌的生長，在與病原菌對峙過程中3個(gè)脂肽類物質(zhì)合成基因srfAA、fenA、ituD 的表達(dá)量均高于對照，尤其是伊枯草菌素合成基因（ituD）的表達(dá)量顯著高于對照，推測伊枯草菌素在抑制病原菌生長過程中發(fā)揮了主要作用。

根腐病是土傳病害，危害多種植物，發(fā)病原因復(fù)雜，一旦感染難以根治，有“植物癌癥”之稱，鐮刀菌屬茄腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等多為此病致病菌。芍藥也是深受其害的植物之一，由于物理防治與化學(xué)防治具有局限性，研究其生物防治成為當(dāng)務(wù)之急。貝萊斯芽孢桿菌作為優(yōu)良的生防菌種，能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，脂肽類物質(zhì)是其中一類，對鐮刀菌屬致病菌及其他屬致病菌均有良好的抑制作用。脂肽類物質(zhì)通過非核糖體途徑合成，主要包括表面活性素、豐原素和伊枯草菌素。表面活性素主要通過破壞細(xì)胞膜，影響膜的穩(wěn)定性，而達(dá)到抑菌目的[18]。表面活性素對真菌的抑制效果不佳，但研究結(jié)果表明表面活性素可以增強(qiáng)豐原素與伊枯草菌素對真菌的抑制效果[19]。豐原素主要對病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用，使細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和滲透性發(fā)生改變，從而引起胞內(nèi)物質(zhì)外泄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。伊枯草菌素同樣對病原真菌有抑制作用，通過改變細(xì)胞膜的通透性，抑制細(xì)胞生長或?qū)е录?xì)胞死亡[21]。曾欣等[22] 從溫郁金根莖內(nèi)分離篩選出1 株對6 種不同屬的病原真菌均有抑制效果的貝萊斯芽孢桿菌B-11，并且在與病原菌的共培養(yǎng)過程中使病原菌菌絲產(chǎn)生畸形，MALDI-TOF-MS 檢測結(jié)果表明拮抗菌株B-11 能夠產(chǎn)生伊枯草菌素、豐原素和表面活性素，其中伊枯草菌素的產(chǎn)量最高。歐婷等[23]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌SWUJ1 對炭疽菌有良好的抑制作用，抑菌率達(dá)58.9%，并使部分炭疽菌菌絲扭曲、腫大且內(nèi)容物聚集，脂肽類粗提物L(fēng)C-MS 分析結(jié)果表明菌株貝萊斯芽孢桿菌SWUJ1可能通過產(chǎn)生脂肽類化合物表面活性素、豐原素和伊枯草菌素抑制病原菌生長。申云鑫等[24] 研究了貝萊斯芽孢桿菌SH-1471 對番茄枯萎病的防治效果，結(jié)果表明該菌株有srfA、fenB、ituA、ituD和bymA 等抗生素合成基因，對多種病原菌具有良好的抑制效果，可顯著降低番茄枯萎病的發(fā)病率。

本研究結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌及其脂肽類抗生物質(zhì)對鐮刀菌屬致病菌有良好的抑制作用。劉雪嬌等[25] 發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌3A3-15 產(chǎn)生的脂肽類抗生素可使尖孢鐮刀菌菌絲發(fā)生膨大、纏繞等畸形，并在其產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了表面活性素。郭蔓等[26] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌P9 發(fā)酵液中脂肽類抗生素粗提物對尖孢鐮刀菌有良好的抑制效果。本研究中篩選得到的貝萊斯芽孢桿菌H35 具有srfAA、fenA、ituD 脂肽類物質(zhì)合成基因，這些脂肽類物質(zhì)對芍藥根腐病菌菌絲有明顯的致畸作用，對病原菌的生長有良好的抑制效果。菌株H35 脂肽類物質(zhì)的產(chǎn)量并非隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而一直提高，這可能與菌株的生長特性、接種量、培養(yǎng)基等因素均有關(guān)系。為了確定菌株生長的最佳條件以及提高脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的條件，為菌株的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論參考，后續(xù)將進(jìn)一步研究菌株的生長特性，研究碳源、氮源、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度等因素對菌株的影響，以及接種量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間對菌株脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的影響。

熒光定量PCR 技術(shù)能夠準(zhǔn)確定量擴(kuò)增基因，應(yīng)用廣泛。本研究結(jié)果表明，在與病原菌FhQ0SMvbJat+IuXLHdM84TNEALbw8r/jhu3Vwhl5kYA=對峙過程中，拮抗菌株的抗生素合成基因表達(dá)量上調(diào)。鄭臻[27] 的研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌G-7 對香蕉枯萎病菌F. oxysporum 有較強(qiáng)的拮抗作用，與其對峙培養(yǎng)24 h 后，菌株G-7 的ituD-i 基因與iturinA合成所必需的lpa-14基因的表達(dá)量均上調(diào)。Li 等[28] 的研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌SQR9與腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌對峙培養(yǎng)時(shí)，脂肽類物質(zhì)合成基因fenA、bmyD、srfAA 的相對表達(dá)量均上調(diào)。楊瑞先等[10] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌md8 與dm9 與牡丹根腐病病原菌腐皮鐮刀菌共培養(yǎng)時(shí)，ituD 和fenA 基因均顯著上調(diào)表達(dá)，共培養(yǎng)前期srfAA 基因的表達(dá)量也顯著增加，表明srfAA 基因編碼的表面活性素在抑菌過程中具有協(xié)同增效作用。本研究中菌株H35 與芍藥根腐病病原菌對峙培養(yǎng)時(shí)，ituD、fenA 和srfAA 基因均顯著上調(diào)表達(dá)，其中ituD 在對峙培養(yǎng)期間保持高表達(dá)，其次是srfAA，表明伊枯草菌素為主要抑菌物質(zhì)，表面活性素與豐原素增強(qiáng)了抑菌效果。脂肽類物質(zhì)主要有三大類群，每個(gè)類群均有多種抑菌物質(zhì)，本研究中僅探究了srfAA、fenA、ituD 基因在與病原菌對峙過程中的表達(dá)量，后續(xù)將研究其他脂肽類物質(zhì)合成基因（如fenB、ituA、ituB 等基因）在對峙過程中表達(dá)量的變化情況，及其抑菌作用機(jī)制，同時(shí)將利用灌菌法研究菌株H35 對盆栽芍藥與大田芍藥根腐病的生防效果，以期為芍藥根腐病生物防治提供微生物資源。