基于電子鼻技術(shù)的櫻花花香測定方法的建立

關(guān)鍵詞：櫻花；電子鼻；花香；正交試驗(yàn)；種質(zhì)鑒定

中圖分類號：S685.99 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）03—0281—08

植物花香是園林植物的重要性狀之一，也是植物吸引昆蟲授粉的重要表現(xiàn)信號，更是評價(jià)觀賞植物和鮮花的重要質(zhì)量指標(biāo)[1-2]。通常，人們對植物香型的研究主要通過頂空固相微萃取、氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和感官評價(jià)法。這些方法已經(jīng)被運(yùn)用于矮牽牛Petunia hybrida[3]、柚Citrusmaxima（Burm.）Merr[4] 和野茉莉Styrax japonicus[5]等芳香植物的鑒定和分析。但是大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)在花朵中含量極低，不能被人們的嗅覺所感知，因此感官評價(jià)法具有主觀性極強(qiáng)的缺點(diǎn)。氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對花成分的定性和定量分析精度高，但也存在儀器維護(hù)費(fèi)用高、運(yùn)行成本高、樣品預(yù)處理分析時(shí)間長等局限性[6]。

電子鼻是一種嗅覺模擬測試工具，通常由一系列非特異性、交叉反應(yīng)的化學(xué)傳感器組成，能對氣味進(jìn)行客觀的感知、分析和判斷。電子鼻技術(shù)具有不需要有機(jī)溶劑、測量時(shí)間短、靈敏度高、易于維護(hù)和檢測費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)[7]。張正武等[8] 利用電子鼻對隴南34 個(gè)花椒Zanthoxylum bungeanum品種進(jìn)行了區(qū)分。潘雁紅等[9] 通過研究發(fā)現(xiàn)8 種竹筍Bambuseae species 能夠通過電子鼻被準(zhǔn)確地區(qū)分開來。此外，電子鼻技術(shù)在花香[10-11]、茶葉[12]、果實(shí)品質(zhì)[13-14]、肉制品[15] 等方面均有應(yīng)用。

櫻花是櫻屬Cerasus Mill. 植物的總稱，屬于薔薇科Rosaceae 李亞科Prunoideae。櫻花作為聞名世界的觀賞植物，種類豐富、分布廣泛、花期集中、觀賞價(jià)值高。目前國內(nèi)學(xué)者對櫻花的研究報(bào)道主要集中在育種[16-17]、脅迫[18]、抗氧化能力[19]及其致病性研究[20]，而對于花香的研究暫無報(bào)道。

因此，本研究以山櫻花Cerasus serrulate 為試材，采用正交設(shè)計(jì)，分析不同頂空平衡時(shí)間、樣品量、花期和采樣時(shí)間對電子鼻測定櫻花花香的影響，篩選最佳測定參數(shù)?；谧罴褏?shù)，開展基于電子鼻技術(shù)的不同櫻花的種質(zhì)鑒定分析。以期建立基于電子鼻技術(shù)的櫻花花香氣味快速測定方法應(yīng)用于櫻花種質(zhì)鑒定，也為其他香源植物的香型分析提供共性技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于江蘇省南京市南京林業(yè)大學(xué)（31°52′11.10″N，118°46′5.53″E），屬北亞熱帶濕潤氣候，四季分明，雨量充沛，土壤肥沃。年均降水日數(shù)為117 d，年均降水量1 106 mm，相對濕度76%，無霜期237 d。

1.2 植物材料

試驗(yàn)材料為3 種具有不同表型性狀的櫻花，均采自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)多年生栽培群體。其中東京櫻花Cerasus9963260f3673d25c3c8b426d4ba9105e yedoensis 為傘形總狀花序，有花3 ～ 4 朵，先葉開放，花瓣數(shù)5，花色為粉紅色；山櫻花為傘房總狀花序，有花2 ～ 3 朵，花葉同放，花瓣數(shù)5，花色為白色；日本晚櫻Cerasusserrulata var.lannesiana 為傘形花序，有花3 ～ 5 朵，花葉同放，花瓣數(shù)20 ～ 45，花色為紫紅色。于2023 年3 ～ 4 月選擇晴天進(jìn)行采樣。選擇生長健壯、無機(jī)械損害和病蟲害、樹形大小基本一致的植株。采摘著色均勻的花朵立即放置聚乙烯密封袋內(nèi)混勻花樣后帶至實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，在室溫條件下進(jìn)行檢測。

1.3 試驗(yàn)儀器

PEN3 型便攜式電子鼻（德國AIRSENSE 公司），該電子鼻含有10個(gè)金屬氧化物傳感器，不同的傳感器對不同的化學(xué)成分有不同的響應(yīng)值。各傳感器的類型及性能如表1所示。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 電子鼻分析條件

電子鼻檢測采用頂空抽樣的方法[8]。電子鼻測定參數(shù)設(shè)置為內(nèi)部流量180 mL/min， 進(jìn)樣流量180 mL/min，樣品間隔1 s，清洗時(shí)間60 s，自動調(diào)零時(shí)間5 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s，測量時(shí)間70 s。

1.4.3 基于電子鼻技術(shù)的櫻花種質(zhì)鑒定

以東京櫻花、山櫻花和日本晚櫻為研究對象，基于電子鼻檢測櫻花花香的最佳測定參數(shù)，利用電子鼻技術(shù)對不同櫻花花香的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

在使用電子鼻檢測櫻花樣品時(shí)，取響應(yīng)曲線平穩(wěn)階段（65 ～ 67 s）的平均值作為樣品分析的時(shí)間點(diǎn)。使用PEN3 自帶的Winmuster 數(shù)據(jù)處理軟件、SPSS26 軟件和Origin2021 軟件進(jìn)行方差分析、主成分分析（PCA）、載荷分析（Loadings）及線性判別分析（LDA），利用Excel 軟件進(jìn)行其他分析，采用Origin2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于電子鼻技術(shù)的櫻花花香測定條件篩選

2.1.1 不同處理櫻花花香的電子鼻雷達(dá)圖分析

圖1 是基于電子鼻技術(shù)對山櫻花16 個(gè)處理的櫻花香氣組成成分響應(yīng)值構(gòu)建的雷達(dá)圖。從圖1 可以看出，10 個(gè)傳感器對櫻花香氣組分的響應(yīng)存在顯著差異（P＜0.01），響應(yīng)值‘G/G0 值’分布于0.9 ～ 29 之間。W1C、W5S、W1S、W1W、W2W和W3S 傳感器對櫻花香氣組分響應(yīng)值較大，響應(yīng)值從高到低依次為W1W、W2W、W5S、W1S、W3S、W1C，其余傳感器對櫻花香氣組分響應(yīng)值較小（G/G值≈ 1）。因此，優(yōu)選出W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 傳感器進(jìn)行數(shù)據(jù)提取與分析。

2.1.2 不同因素對電子鼻響應(yīng)特性的影響

不同因素對電子鼻各傳感器（W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 傳感器）的影響見表3。從表3 可知，不同因素對電子鼻測定櫻花花香的影響差異顯著，對電子鼻傳感器的響應(yīng)影響從大到小依次是不同花期、樣品量、采樣時(shí)間，在不同頂空平衡時(shí)間因素下電子鼻各傳感器響應(yīng)值極差均最小。從各因素的不同水平看，在不同頂空平衡時(shí)間因素中，水平1、4 高于水平2、3；樣品量中水平4 的電子鼻各傳感器響應(yīng)值顯著高于其他水平，水平1、2、3 差異不顯著；在不同花期因素下，除了W1S 傳感器之外，其余傳感器在水平3 時(shí)的響應(yīng)值高于其他水平，且與其他水平差異極顯著；采樣時(shí)間中各水平差異不顯著。說明電子鼻對盛開時(shí)期的櫻花花朵且樣品量為4 g 時(shí)響應(yīng)較大。

2.1.3 不同處理櫻花花香主成分分析

圖2 是基于山櫻花香氣的電子鼻數(shù)據(jù)（W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 傳感器響應(yīng)值G/G）構(gòu)建的主成分分析圖（PCA）。第一主成分PC1 的貢獻(xiàn)率為71.7%，第二主成分PC2 的貢獻(xiàn)率為20.8%，總貢獻(xiàn)率達(dá)到92.5%，說明第一、第二主成分能很好地反映供試樣品的整體信息。從圖2 可以看出，3、6、8 和14 號處理組合與其他處理組合的樣本點(diǎn)沒有重疊，由此可以區(qū)分出3、6、8 和14 號處理。結(jié)合圖1 可知8 號處理各傳感器的響應(yīng)值顯著高于其他處理，且與其他處理差異極顯著。因此，8 號處理，即ABCD 處理組合（在12：00 采集盛開時(shí)期的櫻花花朵4 g，在頂空平衡30 min 后進(jìn)行電子鼻測定）的表現(xiàn)最優(yōu)，為電子鼻快速測定櫻花香氣的最優(yōu)組合。

2.2 基于電子鼻技術(shù)的櫻花種質(zhì)區(qū)分

2.2.1 基于主成分分析和線性判別分析法的櫻花種質(zhì)區(qū)分

采用PCA 和LDA 法對3 種櫻花進(jìn)行分析（圖3），從圖3 可以看出，不同種櫻花的樣本點(diǎn)沒有重疊，每種櫻花樣本點(diǎn)均有特定的分布區(qū)域。PCA結(jié)果顯示第一主成分PC1 的貢獻(xiàn)率為99.33%，第二主成分PC2 的貢獻(xiàn)率為0.49%，這兩個(gè)主要成分解釋了總方差的99.82%（圖3A），不同種質(zhì)區(qū)分度達(dá)到0.677 ～ 0.974。從LDA 分析結(jié)果可以看出（圖3B），判別式LD1 和判別式LD2 的貢獻(xiàn)率分別為75.30% 和23.95%，總貢獻(xiàn)率達(dá)到99.25%，稍低于PCA 的總貢獻(xiàn)率（99.82%），但不同種質(zhì)區(qū)分度為1 高于PCA 分析的區(qū)分度，并且從LDA 分析圖中發(fā)現(xiàn)，每種櫻花樣本點(diǎn)相比于PCA 樣本點(diǎn)更為集中。

2.2.2 載荷分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)電子鼻傳感器對櫻花花香揮發(fā)性成分響應(yīng)值的貢獻(xiàn)大小，利用載荷分析（Loadings） 分析傳感器在當(dāng)前條件下的相對重要性。從圖4 可以看出，第一主成分PC1 的貢獻(xiàn)率為82.4%，第二主成分PC2 的貢獻(xiàn)率為11.0%，總貢獻(xiàn)率為93.4%。傳感器W1W、W2W、W5S、W1S、W2S 和W3S 對第一主成分起正向貢獻(xiàn)作用，W6S 對第二主成分起主要正向貢獻(xiàn)作用。W1C、W3C、W5C 傳感器在第一主成分和第二主成分上均起負(fù)向貢獻(xiàn)作用。W1S 和W3S 主要是對烷烴類的物質(zhì)有較強(qiáng)的敏感度，W5S、W1W 和W2W 主要是對氮氧化合物及硫化物有主要的貢獻(xiàn)力度（表1）。這表明烷烴類、氮氧化合物及硫化物類可能是區(qū)分櫻花種與品種香型的主要成分。

3 結(jié)論與討論

本研究基于電子鼻技術(shù)，以山櫻花為試材，采用雷達(dá)圖對電子鼻傳感器響應(yīng)值進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 傳感器對櫻花香氣組分響應(yīng)值較大，其他傳感器響應(yīng)值較小，G/G 值≈ 1，并依此對傳感器陣列進(jìn)行了優(yōu)化。通過正交試驗(yàn)極差分析和方差分析發(fā)現(xiàn)，不同因素對電子鼻測定櫻花花香的影響是差異顯著的，各因素對電子鼻傳感器響應(yīng)影響大小依次為：花期＞樣品量＞采樣時(shí)間＞頂空平衡時(shí)間；從各因素的不同水平來看，頂空平衡時(shí)間和樣品量在水平4 時(shí)顯著高于其他水平（頂空平衡時(shí)間=60 min；樣品量=4 g），在花期中除W1S 傳感器外均在水平3 時(shí)響應(yīng)值顯著高于其他水平（花期=盛花期），采樣時(shí)間中各水平差異不顯著；根據(jù)高響應(yīng)值確定電子鼻測定櫻花花香的最佳組合為A2B4C3D2，即在12：00 采集盛開時(shí)期的花朵4 g，在頂空平衡30 min 后進(jìn)行電子鼻測定。

基于最佳測定參數(shù)，利用山櫻花、東京櫻花和日本晚櫻等三種櫻花種質(zhì)進(jìn)行效果驗(yàn)證?；陔娮颖羌夹g(shù)對不同櫻花揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，大多數(shù)傳感器對高濃度的揮發(fā)性成分的反應(yīng)值有明顯的線性對應(yīng)關(guān)系。通過PCA 分析和LDA 分析發(fā)現(xiàn)基于最佳測定參數(shù)利用電子鼻技術(shù)進(jìn)行櫻花種質(zhì)區(qū)分是可行的，3 種櫻花區(qū)分均顯著，且LDA 的區(qū)分度為1 高于PCA 分析的區(qū)分度（0.677 ～ 0.974）。LDA 分析的總貢獻(xiàn)率為99.25% 稍低于PCA 分析的總貢獻(xiàn)率99.82%，但從LDA 分析圖中發(fā)現(xiàn)，每種櫻花樣本點(diǎn)相比于PCA 樣本點(diǎn)更為集中，并且樣本點(diǎn)間并無重疊部分，說明LDA 分析法更適用于櫻花種質(zhì)的區(qū)分，與曾輝[21] 使用電子鼻區(qū)分不同品種蘋果的結(jié)果一致。通過Loadings 分析發(fā)現(xiàn)，傳感器W1W、W2W、W5S、W1S、W2S 和W3S對第一主成分起正向貢獻(xiàn)作用，W6S 對第二主成分起主要正向貢獻(xiàn)作用，表明烷烴類、氮氧化合物及硫化物類可能是區(qū)分櫻花種質(zhì)香型的主要成分。范俊俊[22] 采用電子鼻技術(shù)對108 份海棠種質(zhì)開展海棠香型成分研究，分析發(fā)現(xiàn)烷烴類與氮氧化合物及硫化物類可能是區(qū)分海棠種與品種兩群體的香氣的主要作用成分，與本研究結(jié)果一致。

隨著櫻花新品種選育工作的不斷深入，櫻花新品種的數(shù)量不斷增加，櫻花的表型性狀存在豐富變異[23]。傳統(tǒng)的根據(jù)形態(tài)特征來進(jìn)行櫻花種質(zhì)鑒定難度越來越大。花香被譽(yù)為花卉的“靈魂”，是花卉“形、色、香”三要素之一，是評價(jià)花卉品質(zhì)的重要依據(jù)，并有可能在花卉植物的抗逆性中起著關(guān)鍵作用[24]?；ㄏ銚]發(fā)性成分主要由烷烴類、烯類、醇類、酮類、醛類、醚類、酯類及芳香族化合物等組成[25]。每一種花香揮發(fā)物都具有其獨(dú)特的氣味，它們以不同的結(jié)合方式、濃度以及比例使每一種櫻花具有獨(dú)特的香味，因此花香也被認(rèn)為是種質(zhì)區(qū)分的重要依據(jù)[26]。但香氣成分鑒定的技術(shù)還不夠成熟，目前氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在花香測定上比較廣泛[27]。氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對花成分的定性和定量分析精度高，但也存在儀器維護(hù)費(fèi)用高、運(yùn)行成本高、樣品預(yù)處理分析時(shí)間長等局限性，而電子鼻正好克服了這個(gè)缺點(diǎn)。電子鼻是一種嗅覺模擬測試工具，可以對氣味進(jìn)行客觀地感知、分析和判斷。電子鼻技術(shù)具有不需要有機(jī)溶劑、測量時(shí)間短、靈敏度高、易于維護(hù)和檢測費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)[7]。該技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于區(qū)分不同的花椒品種[8] 和竹筍品種[9]，鑒定果實(shí)品質(zhì)[14]，鑒別綠茶成分[12] 和花香成分[10] 以及區(qū)分具有不同氣味強(qiáng)度的海棠類群[22]。這表明，該技術(shù)在花香分類和鑒定領(lǐng)域是可行的。

由于試驗(yàn)種質(zhì)收集數(shù)量有限，本研究僅選用了3 種櫻花作為研究對象，樣本量較少，在后續(xù)的研究中將其作為重點(diǎn)改進(jìn)部分，擴(kuò)大櫻花品種檢測數(shù)量，構(gòu)建基于電子鼻技術(shù)的櫻花花香“指紋圖譜”，以期為櫻花種質(zhì)鑒定提供參考，也為其他香源植物的香型分析提供共性技術(shù)參考。