采收期對核桃貯藏期間內種皮褐變的影響

關鍵詞：采收期；核桃；內種皮；褐變

中圖分類號：S664.1 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）03—0255—09

核桃別名胡桃、羌桃，是世界四大干果樹種之一[1]。核桃果實的核仁富含脂肪和蛋白質，尤其是含有大量不飽和脂肪酸，營養(yǎng)價值極高[2]，而且亞麻酸、亞油酸等人體必需脂肪酸含量極高，具有降低血液中膽固醇含量、抗動脈硬化以及維持大腦和神經系統(tǒng)功能等藥用價值[3]。核仁還含有大量礦物質、維生素、肌醇、褪黑素等物質，具有較好的美容保健功效[4]。

近年來，隨著生活水平的提高，營養(yǎng)健康飲食日益受到關注，核桃已成為人們日常膳食中的必備食品[5]，核桃種植面積和堅果產量更是年年攀升，產量的迅速提升對核桃的采后商品化處理和貯藏提出了新的要求。在采后加工貯藏過程中核桃內種皮極易發(fā)生褐變，褐變預示著果實開始走向成熟及老化衰退，是影響果實品質及其商品價值的重要因素之一，已成為果實采后商品化處理和貯藏的主要障礙[6-7]。果實采后褐變造成了極大的經濟損失，因此，核桃內種皮褐變的控制已成為核桃采后處理和貯藏的關鍵技術。

采后褐變是果實發(fā)生的一種生理代謝失調現(xiàn)象。引起核桃果實褐變的原因眾多，如采后失水、機械損傷、遭遇冷害、酶促反應、膜脂氧化、能量匱乏等，而且往往是多種因素共同作用的結果[8]。目前，學界普遍認為多酚氧化酶（PPO）是引起果實酶促褐變的主要酶類，PPO 可以催化酚類等物質氧化，從而引起果實褐變[9]。有研究結果表明，PPO可影響果實褐變速率和發(fā)生時間，因此其活性可以反映果實貯藏效果[10]。果實褐變與其成熟度密切相關，過早或過晚采收均會導致果實褐變的加重[11-12]。有研究結果表明，提早采收會影響果實的生長及成熟進程，引起褐變及風味變差，推遲采收因果實成熟度較高、細胞衰老快，同樣會加重果實褐變[8]。王志華等[13] 對圓黃梨的研究結果表明，在盛花期后128 ～ 142 d 內，采收越早，果心褐變程度越低；李麗梅等[14] 對‘大久?！夜难芯拷Y果表明，采收越早，果肉褐變越嚴重。核桃果實采收過早，不但因為青皮不易剝離而造成污染，而且會影響核仁的飽滿度，造成出仁率和粗脂肪含量降低，導致可貯藏時間縮短；采收過晚，會造成大量落果，青皮開裂程度高導致霉菌感染率上升，進而造成果實品質降低[15]。弓弼等[16] 的研究結果表明，適當晚采可以延緩核桃青皮的褐變進程，延長青皮核桃的貯藏期。然而，目前關于采收期對核桃褐變影響的研究報道主要集中在青皮核桃和鮮核桃的保鮮方面，且主要研究采收期對青皮褐變及堅果品質的影響，關于采收期對核桃堅果貯藏期間內種皮褐變影響的研究鮮有報道。本研究中以核桃‘香玲’為試驗材料，對3 個采收期的核桃堅果進行加速貯藏（加速褐變），定期測定不同采收期核桃內種皮褐變度及褐變相關生理指標，研究采收期對核桃內種皮褐變度及相關指標的影響，分析貯藏過程中不同采收期核桃的內種皮褐變度與生理指標的相關性，以期為核桃生產中適宜采收期的確定、褐變調控及核桃采后處理和高品質貯藏提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料采自甘肅省成縣大路溝國家核桃良種基地，為‘香玲’嫁接苗。核桃園管理水平一致，樹體健壯，無明顯病蟲害。

1.2 樣品采摘及處理

選擇樹齡相同，長勢相似，健康無病蟲害的9株核桃樹作為采樣樹。每3 株為1 組，作為1 次重復，共設3 次重復，并對各采樣樹掛牌標記。參考前人研究基礎[16]，結合當?shù)亍懔帷颂夜麑嵃l(fā)育狀況，分別于2023 年的8 月25 日（果實發(fā)育120 d左右）、9 月2 日（果實發(fā)育128 d 左右）、9 月10 日（果實發(fā)育136 d 左右）采摘果實。每次采摘時，各重復按每株樹分上、中、下3 層及東、西、南、北4 個方向隨機采摘果實60 粒，共180 粒，混合后迅速帶回實驗室備用。

將所采核桃果實脫青皮，獲得堅果，于采收當天每重復各取50 粒堅果作為初始樣品（0 d）。剩余的樣品置人工氣候箱中加速貯藏，貯藏溫度25 ℃，相對濕度60%～70%，光照周期為白天16 h、黑夜8 h。每隔15 d 取1 次樣，直至貯藏60 d。每次取樣后，脫去果殼，取出核仁，用蒸餾水浸泡40 min，剝離內種皮，將內種皮用液氮研成粉末，置-80 ℃冰箱中，備用。

1.3 指標測定

1.3.1 褐變度、相對電導率及丙二醛（MDA）含量參照陳佳妮等[17] 的方法，稱取核桃內種皮粉末2 g，加10 mL 95% 乙醇，4000×g 離心20 min，取上清液，在420 nm 波長下測定吸光度（A），以A×10 表示褐變度。參照何小三等[18] 的方法測定相對電導率和丙二醛含量。

1.3.2 總酚含量

總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu 法[19]，略修改。準確稱取0.250 g 核仁內種皮粉末樣品，置于10 mL 離心管中，加入5 mL 80% 乙醇，60 ℃條件下超聲提取30 min，12000 r/min 離心10 min，收集上清液，即為總酚提取液。吸取0.1 mL 總酚提取液，置于10 mL 離心管中，加入2.5 mL 10%福林試劑，搖勻后，室溫靜置2 min，再加入2 mL7.5% NaCO 溶液充分混勻后，于黑暗環(huán)境中反應1 h，在760 nm 波長下測定吸光度。以加入80%乙醇代替提取液作為對照組，以沒食子酸繪制標準曲線?？偡雍浚╔）的計算公式：

X=（C-C）×V×f /m。

式中：C 為樣品中多酚質量濃度；C0 為對照中總酚質量濃度；m 為樣品質量；V 為提取液的體積；f 為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.3 酶活性

準確稱取0.1 g 核仁內種皮粉末樣品，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液，4 ℃條件下以12 000 r/min 離心10 min。收集上清液，即酶活性待測液。

1）多酚氧化酶（PPO）活性。分別吸取0.7 mL磷酸鹽緩沖液、0.2 mL 鄰苯二酚，置于離心管中，混勻，25 ℃條件下孵育10 min 后，加入0.1 mL 待測液（對照加入0.1 mL 煮沸5 min 處理后的待測液），混勻后于25 ℃條件下反應10 min，然后立即置于沸水浴中5 min。待冷卻后，以5 000 r/min離心10 min，測定410 nm 波長下的吸光度。以1 min內1 g 組織在1 mL 體系中使吸光度變化0.01 為1 個酶活力單位。

2）超氧化物歧化酶（SOD）活性。反應體系：0.9 mL 酶提取緩沖液，0.15 mL 甲硫氨酸溶液，0.15 mL NBT，0.15 mL 核黃素，0.15 mL 酶活性待測液。其中對照組加緩沖液代替酶液，做2 個對照管?；靹蚝?，將其中1 個對照管用雙層黑色硬紙?zhí)渍诠?，? 個對照管不進行任何處理并與其他試管同時置于4 000 lx 日光燈下反應10 ～20 min，當未處理的對照管中液體呈藍色，而遮光的對照管中液體仍為黃色時，結束反應，測定各管中液體在560 nm 波長下的吸光度。將NBT 還原抑制到對照的50% 時所需要的酶量定義為1 個酶活力單位。

3）過氧化物酶活性（POD）活性。在離心管中依次加入0.58 mL 磷酸鹽緩沖液、0.2 mL0.5 mol/L H2O2、0.2 mL 25 mmol/L 愈創(chuàng)木酚和0.02 mL 待測液，渦旋混勻，測定470 nm 波長下的吸光度。以每分鐘內吸光度變化0.01 為1 個過氧化物酶活性單位。

4）過氧化氫酶活性（CAT）活性。在離心管中依次加入1.6 mL 磷酸鹽緩沖液、0.2 mL 待測液和0.2 mL HO，立即在240 nm 波長下測定吸光度，以1 min 內吸光度減少0.1 的酶量為1 個酶活單位。

1.4 數(shù)據分析

所有指標數(shù)據均重復測定3 次。用SPSS 23.0軟件進行多重比較、Pearson 相關性分析和主成分分析，用Origin 2022 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 采收期對核桃內種皮褐變度的影響

由圖1 可知：貯藏0 d 時，8 月25 日采收的核桃內種皮的褐變度最?。?.14），且與其他采收期差異顯著（P ＜ 0.05），8 月25 日和9 月2 日采收的核桃間差異不顯著（P＞0.05）；隨著貯藏時間的延長，3 個采收期的核桃內種皮褐變度均表現(xiàn)為上升趨勢，在貯藏15 d 前上升幅度較?。ㄆ骄仙?2.26%），貯藏15 ～ 30 d 時褐變度上升幅度最大（244.07%）；貯藏45 d 后，9 月2 日采收的核桃內種皮褐變度上升幅度小于其他2 個采收時期；貯藏結束（60 d）時，不同采收時期的核桃內種皮褐變度差異顯著（P＜0.05），其中8 月25 日采收的核桃內種皮褐變度最大（22.35），其次是9 月10 日采收（21.68），9 月2 日采收的褐變度最?。?9.78）。

2.2 采收期對核桃內種皮相對電導率的影響

由圖2 可知： 貯藏前（ 貯藏0 d）， 不同采收期核桃內種皮的相對電導率均較?。ㄆ骄鶠?.17%）；隨著貯藏時間的延長，各采收期核桃內種皮的相對電導率均表現(xiàn)為上升趨勢，且在貯藏0 ～ 15 d 時上升最快，貯藏15 d 時平均為61.28%；貯藏30 d 后上升有所減慢，且9 月2 日采收的核桃內種皮的相對電導率總體表現(xiàn)為小于其他采收時期；貯藏結束（貯藏60 d）時，9 月10 日采摘的核桃內種皮的相對電導率最高（94.01%），9 月2 日采收的核桃內種皮的相對電導率最?。?6.11%）。

2.3 采收期對核桃內種皮MDA 含量的影響

由圖3 可知，隨著貯藏時間的延長，不同采收期的核桃內種皮的MDA 含量總體呈上升趨勢，但不同采收期核桃內種皮MDA 含量的上升速率不同。其中：8 月25 日和9 月10 日采收的核桃內種皮MDA 含量在貯藏0 ～ 30 d 時上升速率較快，貯藏30 d 后開始減慢；9 月2 日采收的核桃內種皮MDA 含量在貯藏0 ～ 15 d 時上升較快，貯藏15 ～ 45 d 時開始減慢，貯藏45 d 后又迅速上升。在貯藏30 d 后，9 月2 日采收的核桃內種皮MDA含量小于其他采收時期，且在貯藏30 ～ 45 d 時與其他采收期樣品間的差異顯著（P ＜ 0.05）。

2.4 采收期對核桃內種皮總酚含量的影響

如圖4 所示，隨著貯藏時間的延長，不同采收期的核桃內種皮總酚含量總體表現(xiàn)為下降趨勢。貯藏初期（貯藏0 d），9 月10 日采收的核桃內種皮總酚含量最高（175.79 mg/g），其次是9 月2 日采收的核桃（172.41 mg/g），8 月25 日采收的核桃內種皮總酚含量最低（164.64 mg/g）；貯藏0 ～ 15 d 時，各采收期核桃內種皮的總酚含量迅速降低，貯藏15 ～ 30 d 時均迅速升高，貯藏30 d 時9 月2 日采收核桃內種皮的總酚含量最高（162.03 mg/g）， 其次為9月10采收的核桃（158.08 mg/g），8 月25 日采收核桃的內種皮總酚含量最低（153.37 mg/g）。貯藏30d后，各采收期核桃內種皮的總酚含量再次降低，但貯藏結束（60 d）時，各采收期的核桃內種皮仍然保持較高的總酚含量，其中9 月2 日采收的核桃內種皮總酚含量最高（147.79 mg/g），其次是8 月25 日采收的核桃（143.25 mg/g），9 月10 日采收的核桃內種皮總酚含量最低（140.86 mg/g）。

2.5 采收期對核桃內種皮酶活性的影響

2.5.1 對PPO活性的影響

由圖5 可知，隨著貯藏時間的延長，各采收期核桃內種皮的PPO 活性均呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢，且在貯藏15 d 內PPO 活性上升較慢，在貯藏15 ～ 30 d 時快速上升，貯藏30 d 后所有核桃內種皮的PPO 活性開始迅速下降。貯藏初期（貯藏0 d），8 月25 日采收的核桃內種皮PPO 活性為105.97 U/（g·min），9 月2 日采收的核桃內種皮PPO 活性為107.45 U/（g·min），9 月10 日采收的核桃內種皮PPO 活性為109.03 U/（g·min）；貯藏15 d后，不同采收期核桃的PPO 活性開始出現(xiàn)差異，30 d 后，9 月2 日采收的核桃內種皮PPO 活性均小于其他2個采收期的樣品；貯藏30 d 時所有采收期的核桃內種皮PPO 活性均達到峰值，其中8 月25 日采收的核桃內種皮PPO 活性最高，達199.46 U/（g·min）；其次為9 月10 日采收的核桃，其內種皮PPO 活性為194.10 U/（g·min）；9月2日采收的核桃內種皮PPO 活性最低，為182.87 U/（g·min）。

2.5.2 對SOD活性的影響

由圖6 可知， 貯藏0 ～ 15 d 時， 各采收期核桃內種皮的SOD 活性迅速升高， 且在貯藏15 d 時達到峰值，其中8 月25 日采收核桃內種皮的SOD 活性為532.25 U/（g·min），9 月2 日采收的為539.52 U/（g·min），9 月10 日采收的為531.49 U/（g·min）。貯藏15 ～ 30 d 時，各采收期核桃內種皮的SOD 活性均有所下降，但下降幅度不大；貯藏30 d 后，所有采收期核桃內種皮的SOD 活性又開始緩慢上升，9 月2 日采收核桃內種皮的SOD 活性顯著高于其他采收時期的樣品（P ＜ 0.05）。

2.5.3 對CAT 活性的影響

由圖7 可知，各采收期核桃內種皮的CAT 活性總體呈現(xiàn)上升趨勢。貯藏0 ～ 15 d 時CAT 活性上升緩慢； 貯藏15 ～ 30 d 上升較快； 貯藏30 ～ 45 d 時CAT 活性有所下降，但下降幅度不大；貯藏45 d 后又開始迅速上升。貯藏30 d 后，9月2日采收核桃內種皮的CAT 活性始終高于其他采收時期的樣品。貯藏結束時，9 月2 日采收的核桃內種皮CAT 活性最高，達246.18 U/（g·min）；其次是9 月10 日采收的核桃，其內種皮CAT 活性為237.44 U/（g·min）；8 月25 日采收的核桃內種皮CAT 活性最低，為228.32 U/（g·min）。

2.5.4 對POD活性的影響

由圖8 可知， 貯藏初期（ 貯藏0 d），各處理組核桃內種皮的POD 活性均較高， 其中8 月25 日采收核桃內種皮的POD 活性為411.66 U/（g·min），9月2日采收核桃內種皮的POD 活性為417.01 U/（g·min），9 月10 日采收核桃內種皮的POD 活性為412.39 U/（g·min）。貯藏0 ～45 d 時，各采收期核桃內種皮的POD 活性均迅速下降，且表現(xiàn)為9 月2 日采收的核桃內種皮POD活性始終大于其他采收期核桃；貯藏45 d 后各采收期核桃內種皮的POD 活性有所升高。貯藏結束（貯藏60 d）時，9 月2 日采收核桃內種皮的POD 活性最高，為332.19 U/（g·min）；其次是8 月25 日采收的核桃，內種皮POD 活性為325.25 U/（g·min）；9 月10 日采收核桃內種皮的POD 活性最低，為324.56 U/（g·min）。

2.6 核桃內種皮褐變度及相關生理指標的相關性

‘香玲’核桃貯藏期間內種皮褐變度及7 個生理指標間的相關性分析結果如表1 所示。由表1可見，各指標間存在不同程度的相關性。其中褐變度與MDA 含量、相對電導率、PPO 活性、SOD活性、CAT 活性呈現(xiàn)顯著正相關（P ＜ 0.05）；褐變度與POD 活性呈現(xiàn)顯著負相關（P ＜ 0.05）；褐變度與總酚含量呈現(xiàn)負相關，但相關性不顯著。

以2 個主成分對應的方差貢獻率a1、a2 作為權數(shù)，結合主成分得分，建立不同采收期核桃內種皮褐變程度的綜合評價數(shù)學模型：F=aZ+aZ。將不同采收期核桃內種皮褐變相關指標數(shù)據標準化后分別代入Z、Z，得到不同采收期核桃內種皮褐變的主成分綜合得分（F），結果如圖9 所示。由圖9 可知：在貯藏前期（貯藏15 d 內），3 個采收期核桃內種皮褐變的主成分綜合得分均較小，表明此階段各采收期核桃內種皮的褐變程度較低；貯藏30 d 后，8 月25 日和9 月10 日采收核桃內種皮褐變的主成分綜合得分均高于9 月2 日采收的核桃，表明在貯藏后期，8 月25 日和9 月10 日采收核桃內種皮的褐變程度高于9 月2 日采收的核桃。

3 結論與討論

本研究結果表明，采收期對貯藏期間核桃內種皮褐變相關生理指標有一定影響。由褐變指標的主成分綜合得分可知，貯藏前期，3 種采收期核桃內種皮的褐變程度較小，且差異不明顯，但在貯藏30 d 后，所有采收期核桃內種皮的褐變程度均有所加重，其中，9 月2 日采收的核桃內種皮褐變程度顯著低于其他2 個采收期的核桃。說明過早或過遲采收，均會加速貯藏期間堅果內種皮的褐變，進而影響核仁品質。因此，在核桃生產中，選擇適宜的采收期并及時采收，能延長核桃堅果的貯藏期，提高貯藏過程中核桃堅果的品質。

果實在采后，隨著組織的衰老代謝，產生大量活性氧，造成膜脂過氧化，最終產生大量MDA。相對電導率可以衡量細胞膜的完整程度，間接反映膜脂的過氧化程度[20]。因此，MDA 含量和相對電導率可被作為評價植物細胞膜脂過氧化程度的重要指標[21]，同時也是評價植物衰老進程的重要參數(shù)[22]。本研究結果表明，在貯藏過程中核桃內種皮的MDA 含量和相對電導率均呈現(xiàn)上升趨勢，且兩者呈現(xiàn)顯著正相關，說明在貯藏過程中不同采收期的核桃內種皮均發(fā)生了膜脂過氧化反應，且隨著貯藏時間的延長，衰老和過氧化程度增加，其中，在貯藏后期9 月2 日采收核桃內種皮的MDA 含量和相對電導率均顯著低于其他采收期的核桃，說明9 月2 日采收的核桃在采后貯藏期間膜脂過氧化程度較輕。

核桃內種皮含有豐富的酚類物質（其含量遠高于核仁）[23]。一方面，酚類物質具有較強的抗氧化活性，能夠保護核仁免受脂肪酸的氧化作用；另一方面，酚類物質會作為酶促褐變的底物，在PPO 的催化下被氧化，進而引起褐變[24]。本研究結果表明：在貯藏15 d 內，所有采收期核桃內種皮的總酚含量呈現(xiàn)下降趨勢，但PPO 活性和褐變度增加幅度不大；在貯藏15 ～ 30 d 時，總酚含量、PPO 活性及褐變度均迅速上升。可能是因為貯藏初期主要發(fā)生的是膜脂氧化過程，因此褐變程度較輕，貯藏15 ～ 30 d 時隨著膜脂過氧化程度的加深，膜結構被破壞，區(qū)室解離，導致PPO 與酚類充分接觸，從而導致褐變度增加[25]。在貯藏后期，9 月2 日采收核桃內種皮的總酚含量高于其他2 個采收期的核桃，說明適時采收能使核桃在貯藏期間保持較高的總酚含量，延緩膜脂過氧化程度。

SOD、CAT 及POD 是植物組織膜保護系統(tǒng)十分重要的酶，與組織褐變有密切的聯(lián)系[8]。SOD作為抗氧化系統(tǒng)的第一道屏障，會首先清除自由基，同時會產生HO的積累，再由CAT、APX 等酶清除HO，從而減少活性氧的積累[26]。本研究中：貯藏前期（貯藏15 d 內），SOD 活性迅速增加，CAT 活性上升較慢，表明在貯藏前期，SOD是清除活性氧的主要酶類；隨著貯藏時間的延長，SOD 活性上升變慢，甚至出現(xiàn)下降，可能是由于隨著貯藏時間的延長，細胞老化和破壞嚴重，影響了SOD 相關蛋白的合成[27]。POD 廣泛存在于植物組織中，且活性較強，是一種含血紅素的氧化還原酶，能夠清除細胞過氧化產生的HO，在植物生長發(fā)育和抗逆防御中產生重要影響，同時，在HO 存在條件下，POD 可催化酚類物質氧化，造成組織的褐變[28]。本研究中，貯藏0 ～ 45 d 內，不同采收期核桃內種皮的POD 活性呈現(xiàn)下降趨勢，貯藏45d后POD 活性有所上升。可能是由于在貯藏前期POD 作為主要氧化酶類，和PPO 一起參與了催化酚類物質的氧化功能；隨著貯藏時間的延長，氧化底物總酚含量下降，導致POD 活性降低，隨著膜脂過氧化程度的加深，產生了更多的自由基和HO，POD 又參與了HO 的清除，導致其活性升高。也有研究結果表明POD在核桃青皮抗氧化體系的作用不大[8]，還有研究結果表明POD 活性和褐變的關系與植物品種有關[28]，因此，POD與核桃內種皮褐變的關系有待深入研究。

本研究中主要是根據當?shù)毓r歷年的采收經驗，選定8 月25 日、9 月2 日、9 月10 日3 個采收期，對8 月25 日前和9 月10 日后采收的情況未進行研究，后續(xù)試驗中將增加采收期，深入研究采收期對核桃貯藏期間內種皮褐變的影響。