核桃焦葉病誘導(dǎo)的形態(tài)響應(yīng)

關(guān)鍵詞：核桃焦葉??；生長；木質(zhì)部莖比導(dǎo)水率；葉片結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S664.1；S718.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2024）03—0188—09

新疆是我國核桃Juglans regia L. 的重要發(fā)源地之一，擁有悠久的栽培歷史[1]。得益于新疆塔里木盆地綠洲的充足光照、熱量資源和適宜的土壤條件，以及當(dāng)?shù)乜萍脊ぷ髡咴诤颂以耘嗪推贩N選育方面的不懈努力，新疆干旱區(qū)的綠洲已經(jīng)成為中國主要的核桃生產(chǎn)區(qū)之一。截至2022 年底，新疆核桃的種植面積達(dá)到42 241.53 hm²，位居新疆林果業(yè)之首、全國第六，產(chǎn)量達(dá)到113.2×10⁴ t，占全國核桃總產(chǎn)量的1/4。核桃種植業(yè)已成為新疆南疆盆地核桃主產(chǎn)縣（市）農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)民可持續(xù)增收的關(guān)鍵產(chǎn)業(yè)。隨著核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，核桃病蟲害也隨之發(fā)生[2]，其中核桃焦葉病于2012 年在新疆和田地區(qū)被首次報(bào)道[3]。截至目前，核桃焦葉病已在阿克蘇、喀什、和田等新疆南疆核桃主產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生。發(fā)病核桃樹光合作用受阻[4-5]，商品率僅為健康核桃樹的50% ～ 70%[3]。

研究表明，葉部病害會(huì)對(duì)林木形態(tài)造成不利影響。在外部形態(tài)結(jié)構(gòu)研究中，紫韌革菌Stereumpurpureum （P.） Fr. 侵染蘋果Malus domestica L. 葉片后通過釋放毒素影響樹體生理代謝活動(dòng)，導(dǎo)致蘋果樹生長減緩、葉片縮小、產(chǎn)量降低，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致樹木死亡，并在枯死樹木的枝干上形成特有的真菌結(jié)構(gòu)[6]。梨Pyrus communis L. 在不同品種、生產(chǎn)園、果實(shí)發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出的黑斑病[7]、褐斑病[8]、斑點(diǎn)病[9] 病害嚴(yán)重程度與早期落葉率呈正相關(guān)，對(duì)落葉率的影響在不同品種、果園和時(shí)間段內(nèi)普遍存在[10]。烏拉圭的藍(lán)桉Eucalyptus globulus L.種植園受到球腔菌Mycosphaerella 影響時(shí)生長減緩、落葉率上升，存活率受到影響[11]。

在內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究中，以桃樹Prunus persica （L.） B.縮葉病為例，感病葉片的柵欄組織細(xì)胞層數(shù)和細(xì)胞直徑均大于健康葉片；隨著癥狀的發(fā)展，感病葉片的柵欄組織逐漸消失，同時(shí)葉肉細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)量明顯減少，甚至在部分細(xì)胞中觀察不到葉綠體，這種情況顯著減弱了樹體的活力，直接影響當(dāng)年的果實(shí)產(chǎn)量和次年的花芽發(fā)育[12]。此外，葡萄扇葉病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)特定排列，對(duì)線粒體和葉綠體的結(jié)構(gòu)造成破壞，進(jìn)而影響細(xì)胞功能[13]。臍橙Citrus sinensis （L.） O. 在感染黃龍病后，葉片變薄，氣孔受損，柵欄組織細(xì)胞形態(tài)由長條形變?yōu)闄E圓形，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞排列疏松，果蒂韌皮部的部分維管束發(fā)生堵塞[14]。截至目前，關(guān)于核桃的生長指標(biāo)及電鏡觀察研究尚未涉及核桃焦葉病發(fā)病后的具體變化情況。

鑒于此，本研究基于生長參數(shù)測(cè)量和顯微觀察技術(shù)，定量分析核桃焦葉病發(fā)生進(jìn)程中1 年生結(jié)果枝長度、基徑生長速率以及木質(zhì)部莖比導(dǎo)水率變化情況，定性分析核桃焦葉病發(fā)生進(jìn)程中葉片、葉柄、枝條結(jié)構(gòu)的變化特征，明確焦葉病發(fā)生進(jìn)程中核桃形態(tài)學(xué)變化，為深入了解核桃焦葉病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本研究田間試驗(yàn)地點(diǎn)位于阿克蘇地區(qū)阿瓦提縣（41°11′06.31′′ ～ 41°12′47.74′′N，79°12′ 12.76′′ ～79°13′57.87′′E）。該地區(qū)屬暖溫帶大陸性干旱氣候，年平均氣溫9.4 ℃，平均降水量91.5 mm。主要栽培核桃品種‘溫185’、授粉品種‘新新2 號(hào)’，樹齡為7～11年生，行間距5 m，株間距3 m。

1.2 試驗(yàn)材料

2021年，選取試驗(yàn)園中10年生‘溫185’核桃樹30 株，于每株樣株樹冠外圍東西南北4 個(gè)方向共選取健康（未感染焦葉?。┑? 年生結(jié)果枝10 個(gè)，掛牌標(biāo)記，依次編號(hào)1～300，以便后期測(cè)量及采樣。其中1～200號(hào)1年生結(jié)果枝（A 組）用于枝條長度、基徑測(cè)定；201～300號(hào)1年生結(jié)果枝（B 組）用于電鏡觀察。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃1年生結(jié)果枝長度、基徑測(cè)定

分別于2021年、2022年、2023年5月中旬和8 月下旬（100 d）測(cè)定‘溫185’1年生結(jié)果枝健康和感病枝條（感病枝條：帶有感病葉片的枝條）的長度、基徑（基部1 cm 處測(cè)量），精度0.01 mm，計(jì)算1 年生結(jié)果枝長度增量及基徑增量[15]。2021、2022、2023年測(cè)量時(shí)掛牌標(biāo)記的枝條剩余數(shù)量分別為184 根（健康127 根，感病57根）、179根（健康103根，感病76 根）、181根（健康114根，感病67 根）。

1.3.2 核桃木質(zhì)部莖比導(dǎo)水率測(cè)定

分別于2021年、2022年、2023年8月下旬采集‘溫185’0.1 m 長1年生結(jié)果枝健康和感病枝條各10根。將采集的枝條完全浸沒在水中，防止干燥。然后將枝條放入植物導(dǎo)水率高壓測(cè)試儀的壓力室內(nèi)，確保密封良好，避免空氣泡影響測(cè)量。

設(shè)定壓強(qiáng)為4.9×10^-3 MPa，時(shí)間300 s，通過過濾器使用CaCl 溶液測(cè)定枝條的初始導(dǎo)水率K0 和樣品莖比導(dǎo)水率Ks[16]。X 為通過枝條CaCl 溶液重量（kg），S 為枝條木質(zhì)部橫截面積（m²）。計(jì)算公式如下：

K=X÷300÷（4.9×10^-3）。 （1）

K=K×0.1÷S。 （2）

1.3.3 核桃1年生結(jié)果枝顯微結(jié)構(gòu)觀察

2023年8月中旬采集1年生結(jié)果枝的枝條、葉柄、葉片（病葉樣品按照核桃焦葉病病葉分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采集，均取未發(fā)病部位葉肉部分），進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)觀察。樣品置于FAA 固定液中[17] 初步固定。

1）葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察

所采集樣品經(jīng)過以下步驟處理：首先，依次在30%、50%、70%、80%、95%、100% 乙醇中各脫水2 h；然后，依次在50%、100% 二甲苯溶液中各透明處理3 h；最后，依次在37 ℃的50%和60 ℃的70%、100% 石蠟溶液中浸蠟，每個(gè)步驟持續(xù)3 d。完成包埋、修塊、切片和烤片后，采用番紅- 固綠染色法進(jìn)行染色。染色后的樣本經(jīng)中性膠封片后，在40℃的干燥箱中干燥[18]。使用Leica DM6000B顯微鏡系統(tǒng)觀察并測(cè)量葉片的總體厚度、柵欄和海綿組織厚度，以及上表皮的厚度。

2）枝條葉柄顯微結(jié)構(gòu)觀察

將葉柄縱切、枝條橫切后使用凍干機(jī)去除樣品中的水分。凍干處理后，使用鑷子將樣品粘至有雙面膠的樣品臺(tái)上，轉(zhuǎn)移至日立E-1045 離子濺射儀，對(duì)樣品表面進(jìn)行噴金處理[19]，以增強(qiáng)樣品的電導(dǎo)性和提高圖像質(zhì)量。將噴金后的樣品固定在顯微鏡的樣品臺(tái)上，使用SUPRA 55VP 掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 焦葉病對(duì)核桃1年生結(jié)果枝長度及基徑增量的影響

對(duì)2021年、2022年、2023年5月上旬至8月中旬（100d）‘ 溫185’1年生結(jié)果枝健康枝條及感病枝條長度及基徑增量進(jìn)行多重比較（圖3）。結(jié)果顯示，2021年、2022年、2023年‘溫185’1年生結(jié)果枝健康枝條長度增量、基徑增量均顯著高于感病枝條（P＜0.05）。2021年， 與健康枝條（60.54 mm） 相比， 感病枝條（50.46 mm）1 年生結(jié)果枝長度增量下降16.65%；2022年，與健康枝條（64.28 mm）相比，感病枝條（43.84 mm）1 年生結(jié)果枝長度增量下降31.80%；2023 年，與健康枝條（65.46 mm）相比，感病枝條（51.75 mm）1 年生結(jié)果枝長度增量下降20.94%。2021 年，與健康枝條（2.94 mm）相比，感病枝條（2.24 mm）1 年生結(jié)果枝基徑增量下降23.80%；2022 年，與健康枝條（3.03 mm）相比，感病枝條（2.11 mm）1 年生結(jié)果枝基徑增量下降30.36%；2023 年，與健康枝條（2.97 mm）相比，感病枝條（2.18 mm）1 年生結(jié)果枝基徑增量下降26.60%。

2.3 焦葉病對(duì)枝條、葉片結(jié)構(gòu)的影響

隨著葉片焦葉病病級(jí)的升高，葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度逐漸下降。多重比較結(jié)果（表2）顯示，Ⅰ級(jí)葉片厚度最大，為（201.44±9.89）μm，顯著大于其他病級(jí)（P＜ 0.05）；Ⅱ級(jí)葉片厚度為（188.04±4.31）μm，與Ⅰ級(jí)葉片相比有所下降，但仍然顯著大于Ⅲ級(jí)葉片和Ⅳ級(jí)葉片（P ＜ 0.05）；Ⅲ級(jí)葉片和Ⅳ級(jí)葉片的葉片厚度分別為（176.53±6.95）μm 和（162.05±5.88）μm，兩者之間存在顯著差異（P ＜ 0.05）。隨著病級(jí)的增加，柵欄組織厚度顯著減少（P ＜ 0.05）；Ⅰ級(jí)葉片的柵欄組織厚度為（104.42±4.30）μm，顯著大于其他病級(jí)（P ＜ 0.05）；Ⅱ級(jí)葉片的柵欄組織厚度為（95.44±3.10）μm，與Ⅰ級(jí)葉片相比有所減少，但仍然顯著大于Ⅲ級(jí)葉片和Ⅳ級(jí)葉片（P ＜0.05）；Ⅲ級(jí)葉片和Ⅳ級(jí)葉片柵欄組織厚度分別為（82.97±6.64）μm 和（72.20±4.70）μm。隨著病級(jí)的增加，海綿組織厚度顯著減少（P ＜ 0.05）；Ⅰ級(jí)葉片的海綿組織厚度為（79.02±4.32）μm，顯著大于其他病級(jí)葉片（P ＜ 0.05）；Ⅱ級(jí)葉片的海綿組織厚度為（70.44±2.51）μm，與Ⅰ級(jí)葉片相比有所減少，但仍然顯著大于Ⅲ級(jí)葉片和Ⅳ級(jí)葉片（P ＜ 0.05）；Ⅲ級(jí)葉片和Ⅳ級(jí)葉片的海綿組織厚度分別為（63.20±5.93）μm 和（58.39±3.52）μm。隨著病級(jí)的增加，上表皮厚度顯著減少（P＜ 0.05）；Ⅰ級(jí)葉片上表皮厚度為（19.32±2.05）μm，顯著大于其他病級(jí)（P ＜ 0.05）；Ⅱ級(jí)葉片的上表皮厚度為（18.76±1.66）μm，與Ⅰ級(jí)葉片相比略有減少， 無顯著差異（P ＞ 0.05）； Ⅲ 級(jí)葉片和Ⅳ級(jí)葉片的上表皮厚度分別為（16.60±1.78）μm 和（14.63±1.70）μm。

由圖3 可知，健康葉片與發(fā)病葉片在細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。在Ⅰ級(jí)健康葉片中，海綿組織區(qū)域沒有觀察到明顯的空洞，表皮細(xì)胞也沒有明顯的突起或斷裂。Ⅱ級(jí)感病葉片的部分葉肉細(xì)胞開始破裂，海綿組織區(qū)域出現(xiàn)了少許空洞，葉肉細(xì)胞內(nèi)部有破損的游離細(xì)胞。隨著病情的惡化，Ⅲ級(jí)葉片的上下表皮細(xì)胞出現(xiàn)扭曲變形，但未觀察到明顯的凸起或斷裂。在病情極為嚴(yán)重的Ⅳ級(jí)葉片中，上表皮細(xì)胞進(jìn)一步扭曲變形，海綿組織區(qū)域出現(xiàn)大量空洞，葉肉細(xì)胞內(nèi)部的破損細(xì)胞數(shù)量增多，下表皮細(xì)胞也開始解體，并出現(xiàn)了凸起和斷裂的現(xiàn)象。

圖4顯示，Ⅰ級(jí)健康葉片葉柄區(qū)域的紋孔膜結(jié)構(gòu)完整，表面光滑無異常。Ⅱ級(jí)感病葉片的葉柄紋孔膜表面變得粗糙。隨著病情的加劇，Ⅲ級(jí)葉片葉柄紋孔膜上開始出現(xiàn)白色顆粒物。在病情極為嚴(yán)重的Ⅳ級(jí)葉片中，葉柄紋孔膜部分破裂，形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖5顯示，健康1 年生結(jié)果枝木質(zhì)部的螺紋導(dǎo)管保持暢通，沒有發(fā)現(xiàn)任何堵塞現(xiàn)象。相比之下，在Ⅱ級(jí)感病枝條木質(zhì)部螺紋導(dǎo)管內(nèi)觀察到了白色顆粒物。隨著病害的進(jìn)一步發(fā)展，Ⅲ級(jí)感病枝條木質(zhì)部螺紋導(dǎo)管內(nèi)出現(xiàn)絮狀結(jié)構(gòu)，螺紋導(dǎo)管局部堵塞。在病情極為嚴(yán)重的Ⅳ級(jí)枝條螺紋導(dǎo)管中出現(xiàn)塊狀物，螺紋導(dǎo)管被大面積堵塞。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，焦葉病抑制‘溫185’核桃1 年生結(jié)果枝的生長，減少了枝條長度和基徑增長量。從觀察葉片解剖結(jié)構(gòu)可知，隨著焦葉病病級(jí)的升高，葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度及上表皮厚度均呈下降趨勢(shì)，并且海綿組織細(xì)胞逐步降解、出現(xiàn)大量空洞，感病枝條葉片功能受損。葉片受損后，光合作用效率降低[4-5]，從而導(dǎo)致能量和碳源供應(yīng)不足，進(jìn)而影響了枝條細(xì)胞分裂和生長所需的物質(zhì)基礎(chǔ)和能量物質(zhì)。有研究顯示鉻脅迫也會(huì)導(dǎo)致葉片厚度變薄[20]。

本研究還發(fā)現(xiàn)在感病枝條中，木質(zhì)部螺紋導(dǎo)管內(nèi)出現(xiàn)的白色顆粒物和絮狀結(jié)構(gòu)引起了導(dǎo)管的堵塞。這種堵塞不僅擾亂了植物的水分平衡，還可能加快病害進(jìn)程，形成負(fù)面循環(huán)[21]。此外，紋孔膜是細(xì)胞間交換水分和養(yǎng)分的關(guān)鍵通道，葉柄處的紋孔膜損傷加劇了水分和養(yǎng)分運(yùn)輸?shù)膯栴}[22]，進(jìn)一步削弱了植物的生長狀況[23]。因此，木質(zhì)部螺紋導(dǎo)管的堵塞和紋孔膜的破壞是導(dǎo)致核桃植株生長發(fā)育受阻的因素。這些病理變化共同作用，導(dǎo)致了枝條生長減弱。這種現(xiàn)象可能與干旱脅迫有關(guān)[24]。

盡管多數(shù)學(xué)者將核桃焦葉病歸類為生理性病害，但大量研究指出，木質(zhì)部導(dǎo)管的堵塞往往與特定病原物的參與密切相關(guān)。這些病原物通過不同的機(jī)制導(dǎo)致導(dǎo)管堵塞，進(jìn)而影響植物的正常生長和發(fā)育。例如，大麗輪枝菌Verticillium dahliaeK. 能夠引起黃櫨Cotinus coggygria S. 導(dǎo)管內(nèi)部產(chǎn)生膠狀物和侵填體，這些物質(zhì)的形成直接導(dǎo)致了導(dǎo)管的堵塞[25]；鐮刀菌Fusarium pseudograminearumT. Ito & Kurata 的菌絲和分生孢子可以在導(dǎo)管內(nèi)繁殖，產(chǎn)生填充物，也是導(dǎo)管堵塞的重要原因[26]。此外，木質(zhì)部難養(yǎng)菌Xylella fastidiosa 在附著于柑橘Citrus reticulata B. 木質(zhì)部壁后，其細(xì)胞數(shù)量增加并產(chǎn)生纖維素物質(zhì)，形成由無定形物質(zhì)、纖維和細(xì)菌細(xì)胞組成的生物膜，這一過程同樣導(dǎo)致了導(dǎo)管的阻塞[27]。受感染的植株葉片中出現(xiàn)含膠質(zhì)物質(zhì)和酚類物質(zhì)，并且有過度增生和肥大的癥狀。掃描電子顯微鏡圖像顯示，X. fastidiosa 感染的葡萄莖節(jié)橫斷面與核桃焦葉病中木質(zhì)部螺紋導(dǎo)管的堵塞情況高度相似[28]。有研究表明，在紋孔膜受損的情況下，細(xì)菌和空氣能夠暢通無阻地通過單個(gè)或多個(gè)相連的木質(zhì)部導(dǎo)管[29]，在植株體內(nèi)移動(dòng)。這種連通性可能是由于紋孔膜的破損，使得莖的木質(zhì)部與葉片之間建立了直接的聯(lián)系。研究人員針對(duì)X. fastidiosa 產(chǎn)生的兩種酶類進(jìn)行了測(cè)試，并觀察到這些細(xì)胞壁降解酶[30]（聚半乳糖醛酸酶和β-1，4- 內(nèi)切葡聚糖酶）能夠改變紋孔膜的孔隙度，形成孔洞[31]。

盡管本研究已經(jīng)揭示了焦葉病對(duì)核桃生長及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，但關(guān)于病原體的深入研究尚顯不足。我們懷疑核桃焦葉病與特定病原物相關(guān)。為了深入了解核桃焦葉病的成因，未來的研究應(yīng)當(dāng)聚焦于病原菌的生物學(xué)特性、致病機(jī)理及其與宿主植物的互作關(guān)系。特別是，通過分離和純化病原菌，詳細(xì)研究其生活周期、傳播途徑和侵染的臨界條件，將有助于揭示焦葉病發(fā)生的具體原因。

4 結(jié)論

本研究主要對(duì)‘溫185’1年生結(jié)果枝健康枝條與感病枝條的長度增量、基徑增量以及木質(zhì)部莖比導(dǎo)水率進(jìn)行了差異分析，并對(duì)感病枝條與健康枝條及其葉片進(jìn)行了顯微結(jié)構(gòu)觀察。主要研究結(jié)果如下：

與健康枝條相比，‘溫185’1年生結(jié)果枝感病枝條的長度增量、基徑增量及木質(zhì)部莖比導(dǎo)水率顯著低于健康枝條（P＜0.05）。長度增量：健康枝條63.42 mm，感病枝條48.68 mm；基徑增量：健康枝條2.98 mm，感病枝條2.17 mm；木質(zhì)部莖比導(dǎo)水率：健康枝條9.00 kg·m^-1·s^-1·MPa^-1、感病枝條2.55 kg·m^-1·s^-1·MPa^-1。

葉片解剖結(jié)構(gòu)的多重比較結(jié)果顯示，隨著焦葉病病級(jí)的升高，葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度以及上表皮厚度均呈下降趨勢(shì)。健康葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，無空洞和表皮損傷。而感病葉片葉肉細(xì)胞破裂、海綿組織出現(xiàn)空洞、游離細(xì)胞破損。隨病情加劇，表皮細(xì)胞扭曲變形，嚴(yán)重時(shí)上表皮嚴(yán)重扭曲，海綿組織空洞增多，葉肉細(xì)胞破損加劇，下表皮出現(xiàn)斷裂。發(fā)病葉片的葉柄紋孔膜表面變得粗糙，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)破裂，影響了水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸。同時(shí)，在感病枝條的木質(zhì)部螺紋導(dǎo)管內(nèi)觀察到白色顆粒物和絮狀結(jié)構(gòu)，螺紋導(dǎo)管堵塞。

綜上所述，焦葉病破壞葉片結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致木質(zhì)部導(dǎo)管堵塞，降低木質(zhì)部莖比導(dǎo)水率，最終抑制了‘溫185’核桃1 年生結(jié)果枝枝條生長。