油茶sRNA分析及其對(duì)光合油脂代謝的調(diào)控

關(guān)鍵詞：油茶；sRNA；miRNA；靶基因；調(diào)控；光合油脂代謝

中圖分類(lèi)號(hào)：S601；S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2024）03—0025—11

sRNA 是植物發(fā)育和種子形成的重要調(diào)節(jié)因子。植物中的sRNA 包括short interfering RNA（siRNA） 和microRNA（miRNA）， 其中，siRNA 包括ra-siRNA（重復(fù)相關(guān)小干擾RNA）、天然反義轉(zhuǎn)錄物衍生的小干擾RNA（naturalantisense transcript-derived small interfering RNA，natsiRNAs）、反式作用反義小分子干擾RNA（transactingantisense interfering RNAs，ta-siRNAs）、異染色質(zhì)小分子干擾RNA（heterochromatic smallinterfering RNA，hc-siRNA）、初級(jí)siRNAs（PrimarysiRNAs） 和長(zhǎng)的小分子干擾RNA（long smallinterfering RNAs，lsiRNA）[1-2]。其中，miRNA 是一類(lèi)真核生物中廣泛存在長(zhǎng)度約為20 ～ 24 個(gè)核苷酸（nucleotide，nt）的內(nèi)源非編碼單鏈RNA，它通常是由RNA 聚合酶Ⅱ合成，其最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稱初始miRNA（pri-miRNA 初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物），初始miRNA 被DCL（Dicer-like）酶切割成雙鏈premiRNA（precursor miRNA），它通過(guò)堿基互補(bǔ)直接作用于靶基因mRNA，誘導(dǎo)靶基因的特異性切割，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[3-4]。如，從馬鈴薯葉、花、根、塊莖的sRNA 表達(dá)圖譜發(fā)現(xiàn)sRNA 進(jìn)化率低并且較為保守，具有組織特異表達(dá)的特性[5]，研究還發(fā)現(xiàn)：在龍眼花發(fā)育過(guò)程中，花芽中的sRNA 富集表達(dá)，通過(guò)信號(hào)途徑參與花器官發(fā)育轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的特異調(diào)控[6]；在鵝掌楸葉和花中，miR157a-SPL 和miR160a-ARF 等miRNA差異表達(dá)[7]。因此，sRNA 在植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)[8-9]、油脂形成[10] 等發(fā)育過(guò)程和模式中發(fā)揮重要作用[11]。

高通量測(cè)序由于可以同時(shí)測(cè)序幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條RNA 分子，讀取較短序列，檢測(cè)全面、靈敏度高，因而加快了sRNA 的發(fā)現(xiàn)和功能研究[12]。目前，已經(jīng)從179 種植物中鑒定出38 186 個(gè)miRNA 和7 838 個(gè)家族[13-15]。在擬南芥中miRNA參與胚形成并且抑制靶基因的表達(dá)，調(diào)控胚成熟[16]。如，在胚缺失突變體lacking DCL1 八細(xì)胞胚期， 上調(diào)較多的是miR156 靶基因、編碼SPL10 和SPL11 的轉(zhuǎn)錄因子。在胚成熟過(guò)程中，miRNA156 誘導(dǎo)介導(dǎo)抑制zygotic SPL 轉(zhuǎn)錄， 抑制轉(zhuǎn)錄的近成熟積累[16]。Lin 等[17] 以龍眼的同步胚性培養(yǎng)物為材料，研究體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程的miRNA 和靶基因，發(fā)現(xiàn)了272 個(gè)miRNA 和2063個(gè)靶基因，其中，181 個(gè)miRNA 和862 個(gè)靶基因得到證實(shí)。這些靶基因參與植物代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和應(yīng)激響應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)：20 個(gè)保守miRNA 和4個(gè)新miRNA 參與體細(xì)胞胚狀體的發(fā)育過(guò)程。在油菜Brassica napus 中發(fā)現(xiàn)了50 個(gè)保守miRNA，其中，一些miRNA 影響油脂的形成積累[10]。然而，對(duì)多數(shù)sRNA 的表達(dá)和功能仍然了解甚少。本研究以油茶葉片和種子為材料構(gòu)建sRNA文庫(kù)，利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，確定已知miRNA 和新miRNA，篩選差異表達(dá)miRNA，預(yù)測(cè)靶基因，進(jìn)行靶基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，揭示miRNA 與光合作用、碳固定和油酯代謝過(guò)程中對(duì)應(yīng)靶基因間可能的調(diào)控關(guān)系，為利用miRNA 技術(shù)進(jìn)行油茶遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 RNA提取和構(gòu)建sRNA文庫(kù)

采集油茶‘橫沖89’的嫩葉和成熟種子，立即液氮冷凍，-70 ℃貯藏。利用CTAB 裂解法提取總RNA。以總RNA 為起始樣品，利用SmallRNA Sample Pre Kit，將Small RNA 加上接頭反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 擴(kuò)增，分離回收DNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。利用Qubit2.0 和Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size 進(jìn)行定量檢測(cè)和完整性分析，采用HiSeq/MiSeq2000測(cè)序獲得原始序列。

1.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和sRNA的結(jié)構(gòu)特征、種類(lèi)和數(shù)量、公共序列及特有序列分析

通過(guò)Phred數(shù)值，轉(zhuǎn)化獲得堿基測(cè)序錯(cuò)誤率（e），每個(gè)堿基測(cè)序錯(cuò)誤率通過(guò)公式Qphred=-10log10（e）轉(zhuǎn)化得到，以Phred 分值及對(duì)應(yīng)的Q20、Q30評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量。去除原始讀長(zhǎng)（raw reads）中低質(zhì)量、含N、5′ 接頭污染、無(wú)3′ 接頭序列、polyA/T/G/C的讀長(zhǎng)，得到凈讀長(zhǎng)（clean reads）。在18～40nt 的長(zhǎng)度區(qū)間篩選sRNA，分析sRNA 的長(zhǎng)度分布、種類(lèi)、數(shù)量以及公共及特有序列等。

1.3 已知miRNA 分析、新miRNA預(yù)測(cè)以及miRNA家族分析

用bowtie 把sRNA 定位到拼接的油茶轉(zhuǎn)錄組序列上，將mapped 到參考序列上的sRNA 序列與miRBase 序列比對(duì)，比對(duì)分析已知miRNA，分析比對(duì)上的總sRNA 種類(lèi)、數(shù)量等[18-19]。分析已知miRNA 首位堿基的偏好性。利用miREvo[15]和mirdeep2[20]miRNA 軟件，通過(guò)miRNA 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，分析比對(duì)上miRNA 前體和成熟體，預(yù)測(cè)新miRNA（novel miRNA），對(duì)miRNA 進(jìn)行家族分析，探索miRNA 家族在其他物種中的存在情況。

1.4 miRNA表達(dá)、差異分析和聚類(lèi)分析

從miRNA 表達(dá)水平分析中得到的read count數(shù)據(jù)，采用TPM對(duì)read count 數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，歸一化表達(dá)量= Mapped read count/Totalreads×1 000 000。利用DEGseq（2010）R package進(jìn)行差異分析。用q value 調(diào)整P-value，以q value ＜0.01 及|log2（fold change）| ＞ 1作為默認(rèn)閾值進(jìn)行顯著差異性分析。將差異miRNA 的TPM 值用于聚類(lèi)分析。

1.5 miRNA靶基因預(yù)測(cè)、候選靶基因GO 功能富集分析

和KEGG 通路富集分析通過(guò)psRobot_tarin psRobot 預(yù)測(cè)miRNA 靶基因。利用GO（Gene Ontology，http：//www.geneontology.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)miRNA 靶基因進(jìn)行功能富集分析，將差異表達(dá)miRNA 的候選靶基因按照生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能進(jìn)行富集條目（term）分析。通過(guò)KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）通路顯著性富集，分析差異表達(dá) miRNA 候選靶基因參與的主要代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.6 參與光合作用、油酯代謝miRNAs 的表達(dá)分析和靶基因篩選

根據(jù)miRNA 的差異表達(dá)、候選靶基因的KEGG pathway 富集分析，篩選油茶光合作用、脂肪酸油脂代謝通路的miRNA 靶基因，預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA 與靶基因可能的調(diào)控關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 提取與sRNA 文庫(kù)制備

提取油茶幼葉和成熟種子的總RNA，用DNase Ⅰ除去殘留的基因組DNA（圖1）。RNA濃度A260/A280 分別為2.119 和2.093?？俁NA 濃度達(dá)到了建庫(kù)要求，Agilent 2100 Bioanalyzer（AgilentTechnologies，USA）測(cè)定RNA 完整性，結(jié)果表明：RIN（RNA integrity number） 為8.2 和8.9， 符合建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)。分離富集葉片和種子的sRNA，構(gòu)建sRNA 文庫(kù)。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和sRNA 的結(jié)構(gòu)特征、種類(lèi)和數(shù)量

通過(guò)測(cè)序獲得油茶葉sRNA 的原始讀長(zhǎng)為15 659 389 條，測(cè)序錯(cuò)誤檢驗(yàn)的錯(cuò)誤率為0.01%，Q20、Q30 分別達(dá)到99.38% 和97.69%，堿基GC 含量為49.15%；種子sRNA 的原始讀長(zhǎng)為14 380 199條，測(cè)序檢驗(yàn)錯(cuò)誤率為0.01%，Q20 和Q30 分別達(dá)到99.34% 和97.59%，堿基GC 含量為49.72%（表1）。

在葉和種子sRNA 中，無(wú)5′ 接頭或無(wú)插入片段讀長(zhǎng)分別為261 297 條（1.67%）和405 709 條（2.82%）；低質(zhì)量讀長(zhǎng)分別為14 239 條（0.09%）和8 125 條（00.6%）、含N% ＞ 10% 的讀長(zhǎng)分別為39條和22條；含5′ 接頭的讀長(zhǎng)分別為11942 條（0.08%）和9，253 條（0.06%），含有polyA/T/G/C的讀長(zhǎng)分別為67733條（0.43%）和48174條（0.34%），除去上述讀長(zhǎng)，獲得葉和種子sRNA 的凈讀長(zhǎng)分別為15304139條和13908934條（圖2）。

在篩選獲得油茶葉和種子的sRNA 中，18 ～ 40 nt 的凈讀長(zhǎng)數(shù)量分別為14 256 189 條和10 822 313條，屬于6 138179和4980518 種sRNA。與其他植物相似，油茶sRNA 的長(zhǎng)度分布在18 ～ 40 nt，其中，24-nt sRNA 最多，在葉和種子中分別為4678323條（32.82%）和3 516 310條（32.49%）；其次是21-nt sRNA，分別為954 749條（6.7%） 和1142946 條（10.56%）；22-ntsRNA 居于第3，分別為952210條（6.68%）和941611（6.12%）條；23-nt 的居于第4，分別為872 524 條（8.7%）和749 356 條（6.92%）（圖3）。油茶葉和種子sRNA 公共序列的種類(lèi)為773647種（7.48%），特有序列的種類(lèi)分別為4206871種（40.67%） 和5364532種（51.86%）；公共序列的數(shù)量為1489104條（59.38%）。葉和種子sRNA 特有序列的數(shù)量分別為4418438條（23.0%）和5768160條（17.62%）。

2.3 已知miRNA 分析、新miRNA預(yù)測(cè)以及miRNA家族分析

用bowtie 將sRNA 定位到trinity 拼接的轉(zhuǎn)錄組上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：葉和種子中的sRNA 分別為14 256 189 條和10 822 313 條，比對(duì)到參照序列的sRNA 分別為5 855 009 條（41.07%）和4 122 070條（38.09%）。其中，與參考序列同向的分別為933 734（6.55%） 條和770 311 條（7.12%）， 與參考序列反向的分別為4 921 275（34.52%）條和3 351 759 條（30.97%）。比對(duì)分析已知miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 比對(duì)上的總sRNA（Total sRNA）為120 102 條，在葉和種子中分別為54 035 條和66 067 條；比對(duì)上的sRNA 為518 種，在葉和種子中分別245 種和273 種；比對(duì)上的miRNA 前體為118種，其中，在葉和種子中分別為112 種和109 種；比對(duì)上的miRNA 成熟體為78 個(gè)，其中，在葉和種子中分別為74 個(gè)和72 個(gè)。其中，ath-miR399d、osa-miR399e、ath-miR399f、gma-miR169v、osamiR1863a、osa-miR1863b 的成熟體僅出現(xiàn)在葉中，而ath-miR171a、ath-miR5658、gma-miR172b-5p、osa- miR1863b 的成熟體僅出現(xiàn)在種子中。

從圖4可以發(fā)現(xiàn)：18-23nt 的已知miRNA 首位堿基多偏好堿基U（uridine）， 其中，21-nt 已知miRNA 的首位堿基為U 的sRNA 數(shù)量最多，分別為45 579 條和54 137 條；22-nt 已知miRNA的次之，分別為2510條和3118條；20-nt 已知miRNA 的為第3位，分別為1707條和2775條。

利用miRDeep2軟件進(jìn)行新miRNA（novelmiRNA）預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：比對(duì)上新miRNA 前體的sRNA 種類(lèi)為1178種，總sRNA 為20653個(gè)。其中，在葉中比對(duì)上的sRNA 種類(lèi)為596種，總sRNA 為10330個(gè)；在種子中為582種，比對(duì)上前體的總sRNA 為10323個(gè)。分析發(fā)現(xiàn)了54個(gè)新miRNA，長(zhǎng)度為19-24nt，以24-nt miRNA 為主。在葉片中比對(duì)上的新miRNA 成熟體出現(xiàn)了9 411次，在種子中的出現(xiàn)了9 504 次。此外，發(fā)現(xiàn)33個(gè)新miRNA 含有miRNA*（miRNA 的隨從鏈），在葉和種子中miRNA* 分別出現(xiàn)了443 次和464次（表2）。

2.4 miRNA表達(dá)、差異分析

和層次聚類(lèi)分析統(tǒng)計(jì)分析miRNA 的讀長(zhǎng)數(shù)（read count），TPM 歸一化處理這些讀長(zhǎng)數(shù)，篩選出132 個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中，在葉中為128 個(gè)，在種子為126 個(gè)，122 個(gè)為兩者共表達(dá)，葉和種子表達(dá)的sRNA 讀長(zhǎng)129 568 條和154 492 條。其中，ath-miR166a 對(duì)應(yīng)讀長(zhǎng)最多，在葉和種子中分別出現(xiàn)了26 594 次和29 821 次。DEGseq 差異分析發(fā)現(xiàn)：在葉和種子中有26 個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA（q value ＜ 0.01，|log2（fold change）| ＞ 1），顯著上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的miRNAs 均為13 個(gè)。其中，顯著上調(diào)表達(dá)的miRNA 包含ath-miR169b、ath-miR399d、ath-miR399f、gma-miR169v、osamiR1863a、osa-miR399e 6 個(gè)已知miRNA 和novel82、novel 32、novel 54、novel 49、novel 53、novel 41、novel 83 6 個(gè)新miRNA。其中，athmiR169b、novel 82、ath-miR399d、ath-miR399f、gma-miR169v、osa-miR1863a、osa-miR399e 的log2 倍數(shù)差異表達(dá)值大于3。顯著下調(diào)表達(dá)的miRNAs 包括ath-miR172e、gma-miR172k、gmamiR396b-3p、gma-miR172c、gma- miR172d、ath-miR172c、ath-miR399b、osa-miR172c、gmamiR172b-5p、ath-miR171a、ath-miR5658、osamiR1863b12 個(gè)已知miRNA 和novel 72。其中，gma-miR172b-5p、ath-miR171a、ath-miR5658、osa-miR1863b 的log2 倍數(shù)差異表達(dá)值小于-3。

由圖5 聚類(lèi)分析可知：在葉和種子miRNA 表達(dá)模式較為相似。差異表達(dá)的miRNA 被分為2 族，一族是在葉和種子中的表達(dá)量均較低，包括athmiR5658、osa-miR1863b、ath-miR171a 等。另一族是在葉和種子中的表達(dá)量較高，包括ath-miR399b、ath-miR172c、gma-miR369b-p、novel 53、novel 32、novel 54 等。另外，novel 49、novel 41、novel 82 在僅葉中表達(dá)量高；osa-miR172c、gma-miR172c 和gma-miR172d 等在僅種子中表達(dá)量高。

2.5 miRNA靶基因預(yù)測(cè)、候選靶基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

對(duì)差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，得到67個(gè)差異表達(dá)miRNA 和它們對(duì)應(yīng)的1346個(gè)靶基因。26 個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA 對(duì)應(yīng)的靶基因?yàn)?44個(gè)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：一個(gè)miRNA 調(diào)控多個(gè)靶基因，如：ath-miR5658調(diào)控532個(gè)靶基因；同時(shí)，一個(gè)靶基因受多個(gè)miRNA 調(diào)控，如調(diào)控胚胎發(fā)育與細(xì)胞增殖的真核翻譯起始因子3類(lèi)-L- 亞基基因（comp69386_c0） 受到ath-miR156g、athmiR156j、osa-miR156k 3 個(gè)miRNA 的調(diào)控。

根據(jù)差異miRNA 候選靶基因在GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的分布特征，計(jì)算顯著富集的GO條目（term）。從圖6可以看出，葉和種子差異表達(dá)miRNA 的候選靶基因在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能中的51 個(gè)條目中富集。其中，生物學(xué)過(guò)程中的生物調(diào)控過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程等23 個(gè)條目富集較多；細(xì)胞組分中的細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞器、細(xì)胞器等17個(gè)條目富集較多；分子功能過(guò)程的結(jié)合、催化活性等11個(gè)條目顯著富集。KEGG 通路富集分析結(jié)果表明：候選靶基因在萜類(lèi)主鏈生物合成、甘油酯代謝、氨酰tRNA 生物合成、RIG-I樣受體、核黃素代謝、角質(zhì)軟木脂和蠟質(zhì)生物合成等條目中顯著富集。

2.6 參與光合作用、油酯代謝miRNAs的表達(dá)分析和靶基因篩選

從表3可以發(fā)現(xiàn)：ath-miR5658 在葉片中沒(méi)有表達(dá)，而在種子中表達(dá)量為6.47。它對(duì)應(yīng)靶基因的靶基因分別是光合碳固定、光合作用途徑中的類(lèi)NADP 依賴型蘋(píng)果酶（comp89613_c0）、果糖二磷酸醛縮酶1（comp46464_c0）、光系統(tǒng)I 反應(yīng)中心亞基ⅣB（comp71063_c0），甘油磷酸酯代謝中的甘油-3- 磷酸?；D(zhuǎn)移酶1（comp77968_c0），脂肪酸延長(zhǎng)途徑中的3- 酮?；?CoA 合成酶4（comp80917_c1），甘油脂代謝和甘油磷酸酯代謝中的1- ?；?sn- 甘油-3- 磷酸?；D(zhuǎn)移酶5comp83553_c0 等。而gma-miR169v 在葉片中的表達(dá)量為7.72，而在種子中沒(méi)有表達(dá)。它的靶基因是甘油脂代謝中的單半乳糖酰二酰基甘油合酶2（comp90506_c0）。

3 討論

3.1 sRNA的數(shù)量、長(zhǎng)度、種類(lèi)鑒定和特征分析

sRNA 是植物發(fā)育和種子形成的重要調(diào)節(jié)因子。通過(guò)長(zhǎng)度分布能夠鑒定sRNA 的種類(lèi)，如，21～24 nt 的sRNA 主要是miRNA，多數(shù)植物的siRNA（small interfering RNAs） 為24 nt [2，17，26]。研究發(fā)現(xiàn)：油茶葉和種子中sRNA 最多的是24-ntsRNA，其次是21-nt sRNA。這與油茶抗炭疽病[27]略有差別，與Brassica napus[10]、Arabidopsis thaliana、Oryza sativa[28] 的sRNA 相似，第3、4 大分布群體是22-nt 和23-nt sRNA，在葉種子中分別占6.68%和6.12%；在種子中占8.7% 和6.92%（圖3）。

3.2 miRNA 的堿基偏好特征分析

植物miRNA 的5′ 端首個(gè)堿基偏好U 而抵抗G。可以通過(guò)miRNA 的U 堿基偏好性分析，獲得典型性miRNA 序列比例。從圖4 可以發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)度在18-23 nt 的已知miRNA 首位堿基偏好U，這與中國(guó)甜柿[29] 中的miRNA 有一定的相似性，因此，增強(qiáng)了研究鑒定結(jié)果的可信度。

3.3 已知miRNAs家族分析、新miRNA 鑒定和靶基因分析

本研究從油茶葉和種子sRNA 中鑒定出22 個(gè)已知miRNAs 家族，105 個(gè)miRNAs 家族成員。其中，多數(shù)已知miRNA 與其他物種保守miRNA 具有高度相似性[27]。在鑒定出的miRNA 家族中，以多家族成員形式存在多個(gè)物種，這與相關(guān)研究結(jié)果[27] 相一致。本研究初步發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了“一個(gè)miRNA 可能存在多個(gè)靶基因，而多個(gè)miRNA 可能均調(diào)控同一靶基因”的現(xiàn)象[27]。其中，67 個(gè)表達(dá)差異miRNA 調(diào)控1 346 個(gè)靶基因。在油茶中發(fā)現(xiàn)54 個(gè)油茶新miRNA，其長(zhǎng)度以24 nt 為主，新miRNA 的數(shù)量和長(zhǎng)度與楊利利[27] 對(duì)油茶的研究結(jié)果相一致，但與中國(guó)甜柿新miRNA 的長(zhǎng)度分布（以21 nt 為主）略有差異[29]。篩選出的miRNAs 及其候選靶基因還有待進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和特殊莖環(huán)qRT-PCR 進(jìn)行驗(yàn)證。由于缺少油茶的基因組序列，本研究無(wú)法進(jìn)行莖環(huán)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，導(dǎo)致所得的miRNA 可能是其他類(lèi)型的sRNA。此外，由于缺少基因組注釋，可能會(huì)導(dǎo)致靶基因注釋不全。但是，隨著油茶的核基因組、葉綠體基因組、線粒體基因組等基因組組裝和測(cè)序解析研究的深入[30]，sRNA 種類(lèi)的預(yù)測(cè)，特別miRNA 會(huì)更加準(zhǔn)確。

3.4 調(diào)控光合作用和油酯代謝miRNA靶基因的表達(dá)分析

從表3 可以發(fā)現(xiàn)：ath-miR5658 在葉片中沒(méi)有表達(dá)，而在種子大量表達(dá)。而gma-miR169v 在葉片中大量表達(dá)，而在種子中沒(méi)有表達(dá)。前期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究結(jié)果[19] 顯示：類(lèi)NADP依賴型蘋(píng)果酶（comp89613_c0）、果糖二磷酸醛縮酶1（comp46464_c0）、光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基ⅣB（comp71063_c0）、單半乳糖基二?；视秃厦?（comp90506_c0）等基因在油茶葉中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)較種子中均上調(diào)表達(dá)。這表明：ath-miR5658 沒(méi)有顯著抑制這些靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)油茶葉片光合產(chǎn)物碳固定、光合作用的影響較小。而靶基因甘油磷脂代謝1- ?；?sn- 甘油-3- 磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶5（comp83553_c0）、甘油-3- 磷酸?；D(zhuǎn)移酶1（comp77968_c0）、3- 酮?；?CoA 合成酶4（comp80917_c1）在葉和種子中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒(méi)有明顯差異，ath-miR5658 可能調(diào)控了這些靶基因在種子中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。據(jù)此我們推測(cè)：ath-miR5658既可能調(diào)控葉片中光合作用基因的表達(dá)[20]，但也會(huì)對(duì)種子中的甘油磷酸酯代謝、脂肪酸延長(zhǎng)和甘油酯代謝產(chǎn)生影響。而gma-miR169v 盡管在葉片中表達(dá)，但是，其靶基因半乳糖基二?；视秃厦?（comp90506_c0）在葉片中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)仍然遠(yuǎn)高于種子中的表達(dá)。由此可見(jiàn)，它的調(diào)控作用局限在一定范圍內(nèi)。

在前期油茶轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析研究[19] 的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行miRNA 靶基因篩選， 初步確定了mRNA 和靶基因的調(diào)控關(guān)系。下一步研究將是利用基因組測(cè)序組裝序列，stem loop qRT-PCR 和靶轉(zhuǎn)錄表達(dá)方法，一是驗(yàn)證ath-miR5658 及其靶基因類(lèi)NADP 依賴型蘋(píng)果酶（comp89613_c0）、果糖二磷酸醛縮酶1（comp46464_c0）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的相關(guān)性，從而確認(rèn)miRNA 對(duì)靶基因的調(diào)控程度。二是在油茶果實(shí)發(fā)育和茶油形成不同階段，檢測(cè)gma-miR169v 及其靶基因的表達(dá)模式，串聯(lián)分析揭示miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系。探討油脂合成是否直接或間接地受到多種miRNA 家族的調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了油茶葉和種子的sRNA 文庫(kù)，鑒定出54個(gè)新miRNA，22 個(gè)已知miRNA 家族，包括105 個(gè)miRNA 家族成員；67個(gè)差異表達(dá)miRNA， 調(diào)控1346個(gè)靶基因， 其中，26個(gè)miRNAs 為顯著差異表達(dá)，調(diào)控644 個(gè)靶基因。初步證實(shí)了“一個(gè)mi RNA 調(diào)控多個(gè)靶基因，以及多個(gè)miRNA 調(diào)控一個(gè)靶基因的現(xiàn)象”；發(fā)現(xiàn)了athmiR5658可能調(diào)控碳固定代謝、光合作用、甘油磷酯代謝、甘油酯代謝、脂肪酸延長(zhǎng)等途徑中靶基因的表達(dá)，gma-miR169v 可能調(diào)控甘油酯代謝中靶基因的表達(dá)。