薄殼山核桃花粉LTP基因的克隆和功能分析

關(guān)鍵詞：薄殼山核桃；花粉離體萌發(fā)；脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白；植物內(nèi)生菌

中圖分類(lèi)號(hào)：S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2024）03—0001—09

山核桃屬Carya Nutt. 植物多是重要的堅(jiān)果和木本油料作物[1]，其中原產(chǎn)北美的薄殼山核桃[2]Carya illinoinensis （Wangenh.） K. Koch 和浙江山核桃Carya cathayensis Sarg 是目前山核桃屬植物中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的兩個(gè)種[3]。薄殼山核桃作為山核桃屬植物[4] 中雌雄同株異花的風(fēng)媒花異交植物，較早就有對(duì)其生殖機(jī)理的研究報(bào)道，內(nèi)容多集中在花粉萌發(fā)方面，現(xiàn)已建立了較好的花粉離體萌發(fā)體系， 是山核桃屬花粉研究中一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｕ憬胶颂译m然也是雌雄同株異花，但傾向于無(wú)融合生殖[5-6]，其花粉的發(fā)育和萌發(fā)規(guī)律尚不清楚，這也是浙江山核桃雜交育種的難點(diǎn)。從進(jìn)化角度看，雖然薄殼山核桃和浙江山核桃染色體數(shù)都是32，但是薄殼山核桃是山核桃組中較為進(jìn)化的，而浙江山核桃卻是比較原始的類(lèi)型[7]。Sparks[8] 根據(jù)分子進(jìn)化和化石方面的信息，可以將山核桃屬植物分為東北美（East North American，簡(jiǎn)稱(chēng)“ENA”）和東亞（East Asian，簡(jiǎn)稱(chēng)“EA”）2 個(gè)類(lèi)群，薄殼山核桃和浙江山核桃分別是這兩個(gè)類(lèi)群的代表。開(kāi)展這2 個(gè)種生殖機(jī)理的比較研究對(duì)于揭示山核桃屬植物的遺傳進(jìn)化規(guī)律具有重要意義。

近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在挖掘授粉有關(guān)機(jī)理方面發(fā)揮了重要作用。例如，Teixeira 等[9] 分析了蓖麻花粉成熟、水合和萌發(fā)3 個(gè)不同階段的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了40 多種在成熟花粉和萌發(fā)花粉中差異顯著的蛋白質(zhì)，并且其中的大多數(shù)與能量代謝和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。ITRAQ（Isobaric tags forrelative and absolute quantitation，同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量）是近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)之一，適合進(jìn)行不同生理狀態(tài)的蛋白質(zhì)組差異分析。例如，Shrestha 等[10] 利用ITRAQ和DGE（Digital Gene Expression Profiling， 數(shù)字基因表達(dá)）技術(shù)研究煙草Nicotiana tabacum 花粉獨(dú)特的發(fā)育過(guò)程，揭示了早期雙細(xì)胞花粉、晚期雙細(xì)胞授粉和6 h 花粉管這3 個(gè)階段的蛋白質(zhì)和基因變化特點(diǎn)，結(jié)果表明了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在煙草早期和晚期花粉發(fā)育中的重要性。Robinson 等[11] 利用ITRAQ 和轉(zhuǎn)錄組相結(jié)合，對(duì)甘藍(lán)型油菜Brassicacarinata 的成熟花粉和柱頭進(jìn)行了無(wú)凝膠鳥(niǎo)槍蛋白質(zhì)組學(xué)研究，分別鑒定出5 608 個(gè)和7 703 個(gè)蛋白，發(fā)現(xiàn)兩者既存在許多共同的功能和發(fā)育目標(biāo)，也存在與自身細(xì)胞特化有關(guān)的重要差異。Pei 等[12]利用ITRAQ 相關(guān)技術(shù)檢測(cè)雄性不育系和正常辣椒的蛋白質(zhì)組差異，篩選出1 645 個(gè)明顯豐度差異的蛋白，發(fā)現(xiàn)主要是與葉綠體和細(xì)胞質(zhì)有關(guān)的蛋白，推測(cè)可能與雄性不育辣椒的敗育有關(guān)。Robinson等[13] 利用ITRAQ 技術(shù)，從小黑麥中篩選出647個(gè)在花粉與柱頭結(jié)合時(shí)有差異變化的蛋白。上述研究說(shuō)明，ITRAQ 蛋白質(zhì)組在研究花粉和柱頭發(fā)育方面有著獨(dú)特的潛力。

在山核桃屬植物育種研究過(guò)程中，薄殼山核桃花粉離體萌發(fā)較為容易，而浙江山核桃花粉離體萌發(fā)較為困難。本研究基于ITRAQ 技術(shù)比較了薄殼山核桃和浙江山核桃花粉離體萌發(fā)前后蛋白質(zhì)組變化的差異，篩選出顯著差異蛋白，據(jù)此信息克隆了差異最為顯著的非特異脂轉(zhuǎn)移蛋白基因（Non-specific Lipid-Transfer Protein，下簡(jiǎn)稱(chēng)LTP基因），并研究了部分基因的表達(dá)規(guī)律和初步功能。

1 材料與方法

1.1 材料

供試山核桃屬Carya 葉片與花粉材料于2020年5 月分別采自浙江省林業(yè)科學(xué)研究院的薄殼山核桃資源圃和浙江省杭州市臨安區(qū)，薄殼山核桃品種為Pawnee。從樹(shù)上取下薄殼山核桃和浙江山核桃?guī)в行刍ㄐ虻闹l，在18 ℃空調(diào)室鋪開(kāi)晾過(guò)夜，然后將散出的花粉收集混合再分裝于2mL 試管，再密閉凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。用于蛋白質(zhì)組分析的樣品分為萌發(fā)前和萌發(fā)后兩個(gè)狀態(tài)，通過(guò)下述方法收集萌發(fā)前花粉樣品：從-80 ℃取出花粉樣品，置于常溫干燥箱中處理1 h，將處理后的花粉均勻分散在培養(yǎng)皿表面，然后將培養(yǎng)皿置于飽和硫酸銅上方，在16 ℃條件下水合4 ～ 6 h，收集水合后的花粉凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。收集萌發(fā)后花粉樣品的方法為：取0.01 g 水合處理后的花粉樣品，將其與50 μL 萌發(fā)液充分混合，然后將混合后的液體均勻涂布于固體萌發(fā)培養(yǎng)基的玻璃紙上，在25 ℃條件下使樣品萌發(fā)5 h 左右，隨后將萌發(fā)后的樣品置于顯微鏡下觀(guān)測(cè)，以確認(rèn)樣品的萌發(fā)程度及狀態(tài)，最后，收集部分萌發(fā)后的花粉樣品并在-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩４竽c桿菌表達(dá)載體pET32a（+），Trans1-T1（DH5α）、由本實(shí)驗(yàn)室保存；TransZol Up、DNase I、TransScript Two-Step RTPCRSuperMix、TransStart Taq DNA Polymerase、Amp （Ampicillin）、X-gal、IPTG、DNA Marker 購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Hind Ⅲ和BamHI 限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)于北京擎科生物有限公司；引物合成和測(cè)序由北京擎科生物有限公司完成。

1.2 蛋白質(zhì)組分析

蛋白質(zhì)的提取、iTRAQ 標(biāo)記和液質(zhì)聯(lián)用分析按文獻(xiàn)要求處理[14-15]，反相柱為C18 column （1.8 mm，0.15×100 mm），色譜儀器為T(mén)hermo Fisher EasynLC1000，質(zhì)譜儀器為T(mén)hermo Fisher LTQ ObitrapETD， 流動(dòng)相A 為0.1% 的甲酸水溶液， 流動(dòng)相B 為100% 乙腈溶液，流速為300 nL/min，掃描質(zhì)荷比的范圍為350 ～ 1 600。數(shù)據(jù)處理采用Maxquant1.5.8.3 軟件，胡桃juglans 屬數(shù)據(jù)庫(kù)，差異蛋白篩選基于倍數(shù)變化，大于2.0 倍的變化判定為上調(diào)，小于0.5 倍的被定義為下調(diào)。

1.3 LTP基因的克隆

取適量薄殼山核桃葉片或雄花序， 液氮冷凍研磨粉碎后， 采用參照RNA 提取試劑盒操作方法提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ 大連TaKaRa 公司） 將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA?；诒狙芯勘ど胶颂肄D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的LTP 基因序列設(shè)計(jì)引物： 上游引物F：5′-ATGGCTGGCTCCTTGGTCCTTAARC-3′；下游引物R：5′-TCATTTCACAGTTTTGCAGTTAGTG-3，以薄殼山核桃cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為20 μL：其中包括1 μL cDNA，上下游引物各1 μL （ 濃度1.0 μmol/L），10 μL Taq mixture，ddH2O 補(bǔ)足20 μL。PCR 擴(kuò)增參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，32 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳回收，連接TA 載體，進(jìn)行測(cè)序。

1.4 LTP基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)定量PCR 按照SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（大連TaKaRa 公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，相對(duì)定量的計(jì)算參照常用的2-ΔΔCT 法。采用Excel2010 軟件處理數(shù)據(jù)，萌發(fā)后相對(duì)于萌發(fā)前的基因表達(dá)（即以萌發(fā)前相對(duì)表達(dá)量為1），采用雙樣本異方差假設(shè)的t 檢驗(yàn)（雙尾）。qRT-PCR 采用SYBR Green法在BIO-RAD IQ5 上完成。為增加相對(duì)定量的客觀(guān)性，GAPDH 和EF1 2 個(gè)看家基因?yàn)閮?nèi)參，內(nèi)參基因引物如表1 所示。根據(jù)LTP 基因序列對(duì)LTP1和LTP2 各設(shè)計(jì)一對(duì)表達(dá)檢測(cè)引物：P-LTP1F7：CCTTAAACTCTCAGGCATGGTTCTG，P-LTP1R7：TTGAGTAACCGTACCCTTGAGGTAGC；P-LTP2F8：TTAAGCTCTCAGGCATGGTGCTTC，P-LTP2R8：ATTGCAGCAGTTTGGAGGGACTT。

1.5 LTP 基因分析和蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

LTP基因的序列分析采用vector NTI 10.0（Invitrogen）軟件，蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)等采用ProtParam 軟件計(jì)算，蛋白信號(hào)肽采用Signal P6.0 軟件分析，跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)采用TMHMM2.0 軟件，蛋白的疏水性和親水性采用ProtScale 軟件。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)采用PSIPRED 4.0 軟件?？臻g結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在xCREATOR 工作臺(tái)（https：//xcreator.tianrang.com/）上進(jìn)行，采用alphafold2 算法。

1.6 花粉離體萌發(fā)體系和LTP基因功能驗(yàn)證

薄殼山核桃花粉離體萌發(fā)體系見(jiàn)參考文獻(xiàn)[16-17]。利用大腸桿菌體系進(jìn)行LTP 蛋白的表達(dá)，對(duì)LTP 基因根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好和酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，采用酶切位點(diǎn)BamH Ⅰ、Hind Ⅲ將LTP 基因通過(guò)克隆載體pMD19-T 轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體pET-32a（+）中，該載體在感受態(tài)細(xì)胞OrigamiB（DE）pLySs 中通過(guò)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)LTP，表達(dá)后的LTP 蛋白為包含His-Tag 的融合蛋白，可以通過(guò)親和柱進(jìn)行純化。選取IPTG（1.0 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)后6 h 提取的LTP 蛋白，提取后加入萌發(fā)體系探究其對(duì)花粉萌發(fā)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄殼山核桃和浙江山核桃花粉離體萌發(fā)前后蛋白譜比較分析

薄殼山核桃的萌發(fā)體系較為完善，萌發(fā)率較高，而浙江山核桃只有少量萌發(fā)，比較兩個(gè)體系的蛋白差異，共鑒定出蛋白375 個(gè)，經(jīng)同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中只有20 個(gè)屬于山核桃屬植物，其余均是微生物的蛋白。從萌發(fā)后相對(duì)于萌發(fā)前的變化來(lái)看，兩種植物均未有明顯下調(diào)的蛋白出現(xiàn)，表明其蛋白變化規(guī)律在一定范圍內(nèi)存在一致性，而且萌發(fā)后兩種植物多數(shù)蛋白差異也不十分明顯（表2）。就上調(diào)的規(guī)律而言，在薄殼山核桃中，這20 個(gè)蛋白都是上調(diào)的，在浙江山核桃中，只有AP1、Putativeextensin、Glutamine synthetase、Protein Ycf2、9-cisepoxycarotenoiddioxygenase 和ATP synthase subunitbeta 這6 個(gè)是上調(diào)的。對(duì)兩種植物萌發(fā)前后蛋白比值的比較發(fā)現(xiàn)，有部分蛋白在兩種植物中花粉萌發(fā)前后的變化規(guī)律是相反的，如Non-specific lipidtransferprotein 和60S acidic ribosomal protein P2。兩種植物萌發(fā)前后的蛋白變化揭示這些蛋白在兩種植物中的活躍程度，如非特異脂蛋白（Non-specificlipid-transfer protein）比值達(dá)18.6 倍，表明其在薄殼山核桃中比在浙江山核桃中活躍很多，此篩選結(jié)果為后續(xù)分離薄殼山核桃花粉萌發(fā)有關(guān)基因并開(kāi)展功能研究提供了依據(jù)。

2.2 薄殼山核桃LTP 同源基因的克隆和表達(dá)分析

通過(guò)蛋白質(zhì)譜得到的多肽序列為AAATTADR，從Genbank 搜索現(xiàn)有的薄殼山核桃預(yù)測(cè)蛋白，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)比較相似的基因位點(diǎn)，針對(duì)其編碼區(qū)設(shè)計(jì)薄殼山核桃LTP 同源基因的引物，以薄殼山核桃cDNA 為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后得到兩個(gè)360 bp的片段，分別命名為L(zhǎng)TP1 和LTP2（圖1）。為了增加相對(duì)定量的客觀(guān)性和可靠性，本研究同時(shí)以Gapdh 和EF1-α 分別為內(nèi)參基因，通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)LTP 基因在薄殼山核桃花粉萌發(fā)前后相對(duì)表達(dá)情況，可以發(fā)現(xiàn)薄殼山核桃LTP1 和LTP2 基因的總體表達(dá)規(guī)律相似。CiLTP1 基因在以Gapdh 為內(nèi)參基因時(shí)，花粉萌發(fā)后基因表達(dá)是萌發(fā)前（即相對(duì)表達(dá)量）4.4 倍（P=0.035 ＜ 0.05），以EF1 為內(nèi)參基因時(shí)， 其相對(duì)表達(dá)量為4.3 倍（P=0.016 ＜ 0.05），兩者結(jié)果一致，均為顯著上調(diào)。而CiLTP2 雖然分別以Gapdh 和EF1 為內(nèi)參時(shí)，相對(duì)表達(dá)量分別達(dá)到2.6（P=0.075 ＜ 0.05）和2.9（P=0.176 ＜ 0.05），但統(tǒng)計(jì)表明萌發(fā)前后無(wú)顯著差異（圖2）。因此，推測(cè)CiLTP1 與花粉萌發(fā)有更高的相關(guān)性。

2.3 薄殼山核桃LTP 基因的功能分析

序列分析表明， 薄殼山核桃LTP1 和LTP2基因均編碼119 個(gè)氨基酸，相同氨基酸比例達(dá)84%，相似氨基酸高達(dá)89.9%（如圖3），且其疏水腔所在區(qū)域氨基酸位點(diǎn)基本上是相同或相似?？偟膩?lái)說(shuō)，ProtParam 預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)特征差異，主要在穩(wěn)定性方面LTP1 明顯更好一些（表3）。對(duì)CiLTP1 深入分析表明，其N(xiāo) 端存在一個(gè)27 氨基酸左右的信號(hào)肽，具有顯著的疏水性，具有跨膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（圖4）。對(duì)LTP 進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示薄殼山核桃CiLTP1 主要由α- 螺旋和不規(guī)則卷曲組成且該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)不含β- 轉(zhuǎn)角。三級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)alphafold2 進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，LTP 基因編碼的蛋白由4 個(gè)α- 螺旋和1 個(gè)C 末端構(gòu)成，其中1 個(gè)類(lèi)似口袋狀的疏水結(jié)構(gòu)位于中間，以便結(jié)合和容納脂肪酸分子相關(guān)[18]。植物L(fēng)TP 的主要特征是在高度保守的區(qū)域（C-Xn-CXn-CCXn-CXC-Xn-C-Xn-C）[19] 中存在8 個(gè)半胱氨酸殘基，形成4 個(gè)穩(wěn)定的二硫鍵。山核桃屬植物也具備此特征，由此確定此蛋白屬于Non-specificlipid-transfer protein type I 類(lèi)蛋白，不過(guò)在第16 位的氨基酸也是半胱氨酸，因此山核桃屬植物L(fēng)TP蛋白中存在9 個(gè)半胱氨酸殘基。此外，植物L(fēng)TP的晶體結(jié)構(gòu)由4 個(gè)或5 個(gè)α 螺旋組成，并在中央疏水腔中發(fā)生脂質(zhì)結(jié)合。對(duì)LTP 結(jié)構(gòu)域分析表明其存在由保守的脂質(zhì)結(jié)合基序構(gòu)成的AAL-LTSS超家族保守結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是胰蛋白酶、α– 淀粉酶抑制劑和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白所共有的特征。

2.4 CiLTP1 蛋白對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響

利用已經(jīng)建立的薄殼山核桃離體萌發(fā)體系來(lái)初步驗(yàn)證LTP 在花粉萌發(fā)中的功能。在大腸桿菌DE3 菌株中用IPTG（1.0mmol/L）誘導(dǎo)6 小時(shí)后，由于LTP 在95 ℃加熱仍具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移特性，在80 ℃加熱進(jìn)一步純化后，將LTP1 加入花粉萌發(fā)體系后發(fā)現(xiàn)LTP1 對(duì)薄殼山核桃花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度無(wú)顯著影響（表4）。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過(guò)比較薄殼山核桃和浙江山核桃兩者花粉萌發(fā)前后的蛋白質(zhì)譜的差異，篩選出在兩種山核桃屬植物花粉萌發(fā)中表達(dá)差異最大的非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白LTP，克隆了薄殼山核桃CiLTP1 和CiLTP2基因，并分析了其生物學(xué)特性和基因表達(dá)特點(diǎn)，但在薄殼山核桃花粉離體萌發(fā)體系中未發(fā)現(xiàn)體外表達(dá)的CiLTP1 蛋白有影響花粉萌發(fā)的功能。

3.2 討論

3.2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究花粉萌發(fā)的生物學(xué)意義

花粉萌發(fā)早期的研究結(jié)果表明，植物的成熟花粉與萌發(fā)花粉蛋白質(zhì)組成大體相似。例如，將玉米Zea mays L. 的成熟花粉和離體萌發(fā)花粉進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，花粉萌發(fā)前后中高豐度蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異并不明顯，萌發(fā)過(guò)程中花粉結(jié)構(gòu)和代謝的顯著變化并沒(méi)有在蛋白質(zhì)表達(dá)譜上表現(xiàn)出來(lái)[20]。本試驗(yàn)中檢測(cè)到的山核桃屬植物的蛋白不多，但在薄殼山核桃中檢測(cè)到的20 個(gè)蛋白均是上調(diào)的，表明萌發(fā)前后的差異較大，這些蛋白中主要包括參與運(yùn)輸、防御反應(yīng)、能量代謝、脅迫反應(yīng)、基因調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞壁形成有關(guān)的蛋白質(zhì)，這與以往的研究結(jié)果較為相似[21-22]。本研究萌發(fā)前后使用質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫(kù)搜索出的總蛋白數(shù)目不多，可能與可供參考的山核桃屬蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)有關(guān)。因?yàn)?，蛋白質(zhì)組學(xué)的定性、定量結(jié)果是數(shù)據(jù)庫(kù)依賴(lài)型的，數(shù)據(jù)庫(kù)質(zhì)量越高，結(jié)果越準(zhǔn)確。山核桃屬目前雖然有部分種類(lèi)完成了全基因組測(cè)序，但是由于存在較多重復(fù)序列，得到準(zhǔn)確注釋的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)比較少。另一方面，本研究所用的花粉樣品來(lái)自野外，攜帶微生物的蛋白是正常的，但是在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)高達(dá)94.7% 的微生物蛋白是令人驚訝的，而這些微生物蛋白絕大多數(shù)是來(lái)自黃單孢菌Xanthomonas campestris，我們推測(cè)該菌可能在核桃屬的花粉中廣泛存在，且影響萌發(fā)。然而，最近對(duì)該菌的分離和影響萌發(fā)試驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)有顯著影響，可能其存在其他一些相關(guān)性，值得進(jìn)一步探討。

3.2.2 研究植物L(fēng)TP基因的生物學(xué)意義

脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白lipid transfer proteins， LTPs 廣泛分布于動(dòng)植物和微生物中，是一類(lèi)小分子量堿性單體蛋白質(zhì)。在植物體中由于作用范圍廣且無(wú)專(zhuān)一性又被稱(chēng)為非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白non-specific lipidtransfer proteins， nsLTPs，占可溶性蛋白的4%，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)多種疏水性分子，一般分布于植物器官的皮細(xì)胞和外周細(xì)胞及器官脫離區(qū)[23]，該蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性較高，這與它的獨(dú)特結(jié)構(gòu)有關(guān)[24]。nsLTPs 可分為3 類(lèi)：nsLTPs Ⅰ、nsLTPs Ⅱ和nsLTPs Ⅲ，是依據(jù)其一級(jí)結(jié)構(gòu)及分子量的大小進(jìn)行分類(lèi)的。本研究發(fā)現(xiàn)的CiLTP1 和CiLTP2 都屬于Ⅰ類(lèi)。

對(duì)于脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的功能研究已有大量進(jìn)展，植物中的非特異LTP（nsLTP）在很多生物過(guò)程如角質(zhì)的合成、胚胎形成、脅迫防御、抑制半胱氨酸蛋白酶與α淀粉酶活性等方面都發(fā)揮著十分重要的作用[25]，有些甚至具有抗菌、抗真菌、抗病毒和體外抗增殖的作用[26]。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白對(duì)植物的花藥生長(zhǎng)也有重要影響，主要是涉及花藥生長(zhǎng)發(fā)育階段脂類(lèi)的運(yùn)輸過(guò)程[27-29]。比如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了部分Ⅰ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)nsLTPs 都可在花粉發(fā)育過(guò)程中（花粉母細(xì)胞到小孢子時(shí)期）有著高度選擇性地表達(dá)于絨氈層內(nèi)[30]。有對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白信號(hào)肽信息的研究，證實(shí)了nsLTPs 轉(zhuǎn)運(yùn)方式為細(xì)胞分泌，進(jìn)入花藥室并參與花藥壁的發(fā)育過(guò)程[31]。但對(duì)小麥的研究結(jié)果表明，一些Ⅲ類(lèi)nsLTPs 發(fā)揮作用的階段僅在種苗發(fā)育環(huán)節(jié)[32]。黃岳等[30] 研究擬南芥和水稻花藥發(fā)育發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白在花藥發(fā)育各個(gè)時(shí)期大量表現(xiàn)，同時(shí)在細(xì)胞凋亡途徑中也有高水平的表現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的脂類(lèi)產(chǎn)物可被運(yùn)送到其他細(xì)胞中去再次利用。裴徐梨等[33] 研究青花菜LTP 基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，LTP 基因特異表達(dá)于花蕾中，并且表達(dá)量與花蕾發(fā)育程度呈負(fù)相關(guān)。唐征等[34] 研究板栗的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)現(xiàn)，短雄花序突變體比正常雄花序中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白表達(dá)率更高，推斷LTP 可以參與胚乳中的脂質(zhì)再利用或者是充當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿﹣?lái)保護(hù)正常生長(zhǎng)的子葉。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白與花粉發(fā)育形成具有高度相關(guān)性且影響著花粉萌發(fā)，因此本試驗(yàn)開(kāi)展山核桃屬植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白與花粉萌發(fā)關(guān)系的研究，對(duì)于探明其生殖機(jī)理特別是山核桃育種問(wèn)題顯得尤為重要。

為探討上述重要問(wèn)題，下一步還需要在多方面改進(jìn)并進(jìn)行深入研究。例如，本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)LTP 基因的體外表達(dá)產(chǎn)物能影響薄殼山核桃花粉萌發(fā)，這可能有多方面的原因。首先，這可能與其未能正確進(jìn)行細(xì)胞定位有關(guān)，因?yàn)長(zhǎng)TP 蛋白通常需要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，充當(dāng)?shù)诙攀固峁┬盘?hào)通路[35]，而現(xiàn)有體外表達(dá)的蛋白很難滲透進(jìn)入細(xì)胞。其次，原核表達(dá)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，可能存在與真核生物不同的修飾，導(dǎo)致其難以參與花粉萌發(fā)有關(guān)的信號(hào)通路。還有，花粉自身的狀態(tài)可能也是影響LTP 作用的因素之一，因?yàn)樵囼?yàn)重復(fù)性的要求，往往采用冷凍保存的花粉，隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉萌發(fā)率明顯下降，如本試驗(yàn)所用的Pawnee 花粉在剛剛采集時(shí)測(cè)得萌發(fā)率達(dá)60%以上，冷凍半年以后下降到20%。另外，未來(lái)克隆山核桃屬植物其他種的LTP 同源基因也是重要的方向，這樣有助于從進(jìn)化角度分析脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白在山核桃屬內(nèi)不同物種中功能的保守性。