基于PI3K/Akt/mTOR信號通路的miR-24調(diào)控ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬機(jī)制研究

【摘要】 目的 探討miR-24對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)下的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）自噬的影響及其相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步闡明miR-24在動脈粥樣硬化（AS）中的作用提供理論依據(jù)。

方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-24的表達(dá)；應(yīng)用蛋白免疫印跡法（western blot）和qRT-PCR法檢測Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、p-mTOR、p-PI3K、p-Akt的蛋白和mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用透射電子顯微鏡技術(shù)檢測細(xì)胞的自噬小體生成情況；應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、細(xì)胞劃痕法、Caspase-3比色法和Hoechst 33258染色法分別檢測細(xì)胞活性、遷移和凋亡情況。

結(jié)果 應(yīng)用ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs后，發(fā)現(xiàn)HUVECs中miR-24的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。miR-24過表達(dá)可明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬（P＜0.05），而miR-24低表達(dá)則會增加ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬（P＜0.05）。miR-24過表達(dá)可顯著降低Beclin-1的表達(dá)水平，上調(diào)LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的水平（P＜0.05），同時(shí)，miR-24過表達(dá)可顯著促進(jìn)p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表達(dá)（P＜0.05）。此外，miR-24過表達(dá)顯著抑制HUVECs的活力和遷移，增加Caspase-3活性并促進(jìn)其凋亡（P＜0.05）。

結(jié)論 miR-24的過表達(dá)可激活PI3K/Akt/mTOR信號通路而降低ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs的自噬水平并促進(jìn)其凋亡，miR-24可能成為AS的潛在治療新靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 氧化低密度脂蛋白；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；PI3K/Akt/mTOR信號通路；miR-24；自噬；凋亡

中圖分類號：R36.1+2；R544 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.09.002

Study on the regulation of ox-LDL induced autophagy mechanism in HUVECs by miR-24 based on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

YANG Peng， YANG Zengyan， ZHAI Yang， ZHOU Weiqian， LUO Xuelan， OU Hesheng▲

（Department of Science and Technology， Guangxi International Zhuang Medical Hospital， Nanning 530201， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the effect of miR-24 on autophagy in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） induced by oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL） and its related mechanism， so as to provide a theoretical basis for further elucidating the role of miR-24 in atherosclerosis （AS）.

Methods Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of miR-24; western blot and qRT-PCR were applied to detect the protein and mRNA expression levels of Beclin-1， LC3Ⅰ/LC3Ⅱ， p-mTOR， p-PI3K， and p-Akt; transmission electron microscopy was used to measure the formation of autophagosomes in cells; MTT assay， cell scratch assay， Caspase-3 colorimetric assay， and Hoechst 33258 staining were used to assess cell viability， migration， and apoptosis， respectively.

Results After inducing HUVECs with ox-LDL， it was found that the expression of miR-24 in HUVECs was significantly reduced （P<0.05）. Overexpression of miR-24 significantly inhibited autophagy induced by ox-LDL in HUVECs （P<0.05）， while downregulation of miR-24 increased autophagy induced by ox-LDL in it （P<0.05）. The overexpression of miR-24 could significantly reduce the expression levels of Beclin-1 and upregulate the levels of LC3Ⅰ/LC3Ⅱ（P<0.05）. At the same time， the overexpression of miR-24 could significantly promote the expressions of p-PI3K， p-Akt， and p-mTOR （P<0.05）. Furthermore， overexpression of miR-24 significantly inhibited the viability and migration of HUVECs， increased the activity of Caspase-3， and promoted apoptosis （P<0.05）.

Conclusion Overexpression of miR-24 can activate PI3K/Akt/mTOR signaling pathway， reduce the level of autophagy induced by ox-LDL in HUVECs， and promote apoptosis， which miR-24 may become a potential new therapeutic target for AS.

【Keywords】 oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL）; human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; miR-24; autophagy; apoptosis

動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）的病理過程十分復(fù)雜，血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells， VECs）損傷、自噬功能障礙和miRNA的異常表達(dá)等多種因素都參與了AS的發(fā)生發(fā)展過程［1-2］。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL）是一種促AS發(fā)展的關(guān)鍵因子［3］，其可導(dǎo)致VECs損傷、內(nèi)皮細(xì)胞自噬功能障礙和凋亡，這有助于促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展［4］。

自噬是一種維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和組織穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。在某些應(yīng)激條件下，細(xì)胞需要降解胞內(nèi)不必要的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來維持自身生存及穩(wěn)態(tài)，這一過程可通過自噬來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)VECs損傷后，可誘發(fā)自噬以保護(hù)細(xì)胞，而當(dāng)自噬誘發(fā)失敗或被抑制時(shí)，內(nèi)皮的完整性被破壞而促進(jìn)局部脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致AS、斑塊不穩(wěn)定、急性血管閉塞甚至猝死［5］。自噬調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，目前被認(rèn)為與多條信號通路有關(guān)，其中PI3K/Akt/mTOR信號通路是典型的自噬信號傳導(dǎo)途徑，該通路可能參與AS自噬的誘導(dǎo)［6-7］，但其具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索。AS的發(fā)生還受到基因表達(dá)的調(diào)控，在基因的轉(zhuǎn)錄過程中，microRNAs（miRNAs）的差異性表達(dá)與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，部分miRNAs可通過影響VECs的增殖、遷移、自噬和凋亡來促進(jìn)AS的進(jìn)展［8］，如位于人類9號染色體上的miR-24，其成熟序列在心血管疾病中起著至關(guān)重要的作用［9］。在前期的研究中，已發(fā)現(xiàn)miR-24可顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（humanumbilical vein endothelial cell， HUVECs）自噬及增殖［10］。因此，本研究為進(jìn)一步探討miR-24與HUVECs自噬之間的相關(guān)分子機(jī)制及其是否對AS有潛在作用，將采用ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs自噬并體外模擬AS模型，以PI3K/Akt/mTOR為切入點(diǎn)探究miR-24調(diào)控HUVECs自噬的相關(guān)分子機(jī)制，進(jìn)一步探討miR-24通過調(diào)控自噬在AS中的潛在價(jià)值，為AS提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs

HUVECs購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，用含15%新生胎牛血清（15% FBS）的DMEM培養(yǎng)液，加入青霉素100 IU/mL和鏈霉素0.1 mg/mL，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)HUVECs分別用0、25、50、100和200 g/mL濃度的ox-LDL處理0、6、12、24和48小時(shí)，檢測miR-24在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中表達(dá)情況。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

委托上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，設(shè)計(jì)合成并得到miR-24高表達(dá)、anti-miR-24和miR-NC三種載體質(zhì)粒，見表1。取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種到6孔板，正常靜置培養(yǎng)24 h，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書要求，將以上3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HUVECs中，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，加入10 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行_{6sQQ26LA1K0cH66ynfgkDTh+0xWh2F+Sx7YY7msOMdI=}篩選。

1.3 qRT-PCR檢測miR-24及其他基因mRNA的表達(dá)

按TRLzol試劑說明提取HUVECs總RNA，然后使用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA，使用SYBR Green PCR Master Mix試劑（Qiagen）進(jìn)行qPCR分析。miRNA和mRNA的表達(dá)以U6或GAPDH為內(nèi)參，并采用2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。本實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列見表2。

1.4 MTT法檢測HUVECs的活性

將HUVECs以5×103個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后向每個(gè)孔中加入MTT試劑10 L，繼續(xù)孵育4小時(shí)，然后除去上清液，再加入150 L DMSO，振蕩10 s，最后用酶聯(lián)免疫檢測儀（Model-450）測定490 nm波長下的吸光度（A490nm），通過測試孔的吸光度減去空白孔的光密度表示細(xì)胞的存活/增殖。

1.5 劃痕試驗(yàn)檢測HUVECs的遷移

將HUVECs以5×104個(gè)/孔的密度接種到24孔板上并孵育至融合（每組3次重復(fù)），隨后用槍頭垂直于培養(yǎng)板底部劃“一”字痕，PBS洗去被劃下的細(xì)胞，再加入無血清培養(yǎng)基，在劃痕后0和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)對HUVECs進(jìn)行拍照。計(jì)算公式為：細(xì)胞遷移率（%）=（A0-An）/A0×100，其中A0代表初始劃痕面積，An代表時(shí)間計(jì)量點(diǎn)處劃痕面積。

1.6 Caspase-3活性測定檢測HUVECs的凋亡

按照說明書上的步驟，將細(xì)胞裂解液與酶特異性底物（100 uM）在37 ℃下孵育4小時(shí)，然后使用酶標(biāo)儀在405 nm處測量吸光度。

1.7 Hoechst 33258染色法檢測HUVECs的凋亡

將細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種到12孔板中。培養(yǎng)24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，用冷PBS沖洗細(xì)胞2次，然后用4%多聚甲醛溶液將貼壁細(xì)胞在4 ℃中固定10 min，隨后再次用冷PBS沖洗2遍，接著加入Hoechst 33258試劑（0.2 mM），并在室溫避光下培養(yǎng)10 min，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。細(xì)胞核固縮或碎裂成致密顆粒狀，呈亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

1.8 透射電子顯微鏡法觀察各組HUVECs的自噬小體

將細(xì)胞漂洗后置于2.5%戊二醛溶液中，避光并置于4 ℃冰箱中固定過夜。次日用PBS漂洗3次后，鋨酸溶液固定2 h。重復(fù)用PBS溶液漂洗3次，丙酮梯度脫水，純樹脂滲透過夜，環(huán)氧樹脂包埋，烘箱聚合。超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，使用透射電子顯微鏡（H-7650）觀察并拍照。

1.9 western blot法檢測Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt的蛋白表達(dá)

將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞裂解取上清液，用BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白定量，分別取各組30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后加入一抗孵育置于4 ℃冰箱過夜，次日用TBST沖洗3次，然后加入熒光二抗孵育1 h后反復(fù)沖洗3次。用雙色熒光掃描成像系統(tǒng)分析蛋白電泳條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用（±s）表示。多組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

2 結(jié) 果

2.1 miR-24在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中表達(dá)降低

為探討miR-24在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中表達(dá)的水平，本研究采用qRT-PCR檢測miR-24的表達(dá)。如圖1A和1B所示，miR-24在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中的表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴性下調(diào)，用100 g/mL的ox-LDL干預(yù)HUVECs 24 h后，miR-24表達(dá)水平下調(diào)約50%（P＜0.05），提示ox-LDL可明顯降低HUVECs中miR-24表達(dá)水平，miR-24的降低可能與ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs損傷有關(guān)。

2.2 ox-LDL可誘導(dǎo)HUVECs自噬

為研究ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs自噬的情況，本研究用100 g/mL的ox-LDL干預(yù) HUVECs 6 h建立自噬模型。通過透射電鏡法觀察建模前后自噬小體生成情況，結(jié)果顯示與正常對照組比較，ox-LDL組中HUVECs的細(xì)胞質(zhì)中含有更多具有雙膜結(jié)構(gòu)的自噬小體和含細(xì)胞器的空泡型自噬溶酶體（圖2A）。此外，通過western blot和qRT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能顯著上調(diào)自噬標(biāo)志基因Beclin-1的表達(dá)水平，并下調(diào)LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的水平（P＜0.05）。見圖2B和2C。以上結(jié)果表明，用100 g/mL的ox-LDL干預(yù) HUVECs 6 h可誘導(dǎo)HUVECs自噬。

2.3 miR-24的過表達(dá)可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬

為了研究miR-24對ox-LDL誘導(dǎo)自噬的調(diào)控作用，本研究構(gòu)建高表達(dá)miR-24質(zhì)粒、anti-miR-24質(zhì)粒和miR-NC質(zhì)粒，并分別轉(zhuǎn)染至經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)過的HUVECs中，采用qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率（圖3B），與陰性對照組（miR-NC）和ox-LDL組比較vvjB2cPuCvjd5Aes4kQAHg==，miR-24組中的miR-24表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），anti-miR-24組中的miR-24表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），陰性對照組與ox-LDL組中的miR-24表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。此外，F(xiàn)AM熒光標(biāo)記表明（圖3A），HUVECs中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率達(dá)90%以上。這些結(jié)果表明，高表達(dá)miR-24質(zhì)粒、anti-miR-24質(zhì)粒和miR-NC質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)染至ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中。通過western blot和qRT-PCR法檢測各組Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的蛋白和mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示（圖3C和3D）：與miR-NC組比較，miR-24高表達(dá)組的Beclin-1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低，而LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），anti-miR-24組的Beclin-1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高，而LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），提示miR-24可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬。為了進(jìn)一步證明miR-24對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬的調(diào)控作用，我們通過透射電鏡觀察各組自噬小體的生成情況（圖3E），與miR-NC組相比，miR-24高表達(dá)組細(xì)胞質(zhì)中可見數(shù)個(gè)散在于細(xì)胞質(zhì)中的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體及內(nèi)含細(xì)胞器的空泡狀自噬溶酶體，而anti-miR-24組細(xì)胞質(zhì)中可見較多的自噬小體，進(jìn)一步證明miR-24可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬。

2.4 miR-24通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬

為了進(jìn)一步探討miR-24抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs自噬的潛在機(jī)制，本研究采用western blot和qRT-PCR檢測與PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)的蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，ox-LDL明顯降低了磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白和mRNA的表達(dá)（P＜0.05），見圖4A和4B。與miR-NC組相比，miR-24高表達(dá)組中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白和mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），而anti-miR-24組中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白和mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖4C和4D，提示過表達(dá)miR-24可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬。

2.5 miR-24可降低HUVECs活性和遷移能力并誘導(dǎo)HUVECs凋亡

本研究采用MTT檢測HUVECs增殖情況（圖5A），與正常對照組比較，ox-LDL組HUVECs增殖明顯受到抑制（P＜0.05），陰性對照組與ox-LDL組比較無明顯變化（P>0.05）。與陰性對照組相比，miR-24高表達(dá)組的HUVECs增殖受到抑制（P＜0.05），anti-miR-24組的HUVECs增殖增加（P＜0.05）。本研究采用劃痕試驗(yàn)進(jìn)一步檢測miR-24對HUVECs遷移能力的影響（圖5C和5E），與正常對照組相比，ox-LDL組HUVECs遷移能力明顯受到抑制（P＜0.05），陰性對照組與ox-LDL組比較無明顯變化（P>0.05）。與陰性對照組相比，miR-24高表達(dá)組HUVECs的遷移能力受到抑制（P＜0.05），而anti-miR-24組細(xì)胞的遷移能力得到了提高（P＜0.05）。

為證實(shí)miR-24是否參與調(diào)控HUVECs的凋亡，本研究采用Caspase-3比色法和Hoechst 33258染色法檢測分析HUVECs凋亡的變化。Caspase-3比色法結(jié)果顯示（圖5B）：與正常對照組相比，ox-LDL組的Caspase-3活性明顯增加（P＜0.05）；與陰性對照組相比，miR-24高表達(dá)組的Caspase-3的活性更強(qiáng)（P＜0.05），而anti-miR-24組的Caspase-3活性明顯降低（P＜0.05）。Hoechst 33258雙染色結(jié)果顯示（圖5D和5F）：正常對照組HUVECs的細(xì)胞核形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，呈彌散均勻的淺藍(lán)色熒光，未發(fā)生凋亡，而與正常對照組相比，ox-LDL組的HUVECs的細(xì)胞核固縮或碎裂成致密顆粒狀，呈亮藍(lán)色熒光，凋亡現(xiàn)象明顯（P＜0.05）；與陰性對照組相比，miR-24過表達(dá)能顯著促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡（P＜0.05），而anti-miR-24能顯著減弱ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，miR-24的過表達(dá)能降低HUVECs的增殖和遷移能力并促進(jìn)其凋亡，而下調(diào)miR-24水平則會增加HUVECs增殖和遷移能力并抑制其凋亡。

3 討 論

本項(xiàng)目通過研究miR-24調(diào)控HUVECs自噬的潛在分子機(jī)制，進(jìn)一步探討miR-24通過調(diào)控自噬在AS中的潛在價(jià)值，主要有以下兩個(gè)發(fā)現(xiàn)：（1）過表達(dá)miR-24可明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬并抑制HUVECs的增殖和遷移能力，進(jìn)而發(fā)揮其在 AS 中的作用。（2）過表達(dá)miR-24可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路從而降低HUVECs自噬水平并促進(jìn)其凋亡。

AS是導(dǎo)致血管疾病死亡的主要原因之一［11］。ox-LDL是一種促AS發(fā)展的關(guān)鍵因子，可誘導(dǎo)VECs損傷進(jìn)而導(dǎo)致AS的發(fā)生［12］。AS的重要特征之一為VECs的凋亡，其機(jī)制為通過ox-LDL降低Caspase-3活性而促進(jìn)VECs的凋亡［13］。本研究中，XUJ4Epn+iav3/j7vsNzXkg==我們通過ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs模擬體外AS模型，發(fā)現(xiàn)ox-LDL能顯著降低HUVECs的活力，并增強(qiáng)Caspase-3的活性而促進(jìn)HUVECs凋亡。還有其他研究表明，細(xì)胞的自噬在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用［14］，其異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂而加速AS的發(fā)生［15］。在自噬過程中，一種以細(xì)胞質(zhì)形式的LC3（LC3-Ⅰ）會被偶聯(lián)形成LC3-磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)物（LC3-Ⅱ）募集到自噬體膜中，而此過程中LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此可作為自噬體的標(biāo)記蛋白［16］。Beclin-1是磷脂酰肌醇-3-激酶復(fù)合物的組成部分，參與自噬體的形成［17］，因此這兩種蛋白質(zhì)可以被看作是自噬活性的標(biāo)志。ZHANG等［18］揭示了ox-LDL通過LC3/beclin-1途徑激活HUVECs自噬。同樣，我們的研究也發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能上調(diào)自噬標(biāo)志基因Beclin-1的表達(dá)水平，并下調(diào)LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的表達(dá)水平，進(jìn)而誘發(fā)HUVECs自噬（圖2），這些結(jié)果表明ox-LDL通過LC3/Beclin1途徑激活HUVECs的自噬。

此外，近年來越來越多的研究［19-21］表明，miRNAs參與細(xì)胞自噬和凋亡的調(diào)節(jié)，并在AS的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路恢復(fù)自噬通量來緩解ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷［22］。miR-106b則通過靶向PTEN并可能激活PI3K/AKT信號通路，抑制了AS中內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［23］。以上研究提示，miRNAs在HUVECs自噬和凋亡過程中扮演著重要角色，并與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-24能夠顯著抑制HUVECs的增殖和遷移［10］，在本研究中，我們首先在HUVECs中轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-24的質(zhì)粒，再用ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs，通過MTT實(shí)驗(yàn)和Hoechst 33258染色檢測發(fā)現(xiàn)，miR-24的過表達(dá)會增加ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡（圖5A、5D、5F）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)miR-24過表達(dá)可增加Caspase-3活性（圖5B）并下調(diào)Beclin-1的蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)（圖3C）。這些結(jié)果表明，miR-24能夠加劇ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC的損傷，而這與其調(diào)節(jié)HUVECs的自噬和凋亡有關(guān)。而在自噬信號通路中，PI3K/Akt/mTOR信號通路最具有代表性，它在細(xì)胞存活、增殖、凋亡和自噬等多種細(xì)胞功能中扮演著重要的角色［24-26］。LI等［27］研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型的極化，可減少動脈粥樣硬化斑塊損傷，改善血脂代謝和炎癥水平。FENG等［28］報(bào)道可通過抑制PI3K來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的AKT/mTOR和NF-κB信號通路的激活，減少炎癥及與之相關(guān)的淋巴管生成，從而對動脈粥樣硬化展現(xiàn)出全面的保護(hù)效果。這些研究表明PI3K/Akt/mTOR信號通路與細(xì)胞自噬和凋亡關(guān)系緊密。我們的研究結(jié)果顯示，miR-24能夠顯著促進(jìn)p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表達(dá)，這表明miR-24可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC自噬并加劇細(xì)胞凋亡。

在本研究中，我們僅僅對miR-24在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的調(diào)控作用及機(jī)制進(jìn)行了初步探索，對于如何更好地揭示miR-24、自噬和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系仍需通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更深層次的驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果表明了miR-24可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路以抑制ox-LDL誘導(dǎo)的自噬，并促進(jìn)HUVECs凋亡，這可能加重血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。但是它們之間是否存在靶向調(diào)控關(guān)系還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，隨著進(jìn)一步的體內(nèi)驗(yàn)證和傳遞系統(tǒng)的優(yōu)化，外源性anti-miR-24有望成為治療AS的一種有前景的分子藥物。

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（收稿日期：2024-05-08 修回日期：2024-08-22）