克氏原螯蝦duox1基因抵御金黃色葡萄球菌侵染的先天免疫機(jī)制

摘要：【目的】探究雙氧化酶1基因（duox1）在克氏原螯蝦抵抗金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）侵染先天免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制，為確?？耸显r產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。【方法】采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌刺激后，duox1基因在克氏原螯蝦血細(xì)胞、肝胰腺、腸道及鰓組織中的表達(dá)情況；通過(guò)RNA干擾（RNAi）敲低duox1基因表達(dá)再進(jìn)行金黃色葡萄球菌刺激，統(tǒng)計(jì)克氏原螯蝦存活率，采用H2O2含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝胰腺H2O2含量，電子顯微鏡下觀察血淋巴黑化現(xiàn)象，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝胰腺中抗菌肽基因（toll1、dorsal、crustin3和crustin4）的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】經(jīng)金黃色葡萄球菌刺激后，克氏原螯蝦duox1基因在血細(xì)胞、肝胰腺、腸道及鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量較PBS組整體上呈上升趨勢(shì)，故推測(cè)duox1基因參與克氏原螯蝦的抗菌先天免疫應(yīng)答，具有潛在的抵抗細(xì)菌侵染作用。與dsGFP+金黃色葡萄球菌組相比，經(jīng)RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后，克氏原螯蝦存活率呈明顯下降趨勢(shì)，肝胰腺H2O2含量呈先降低后回升的變化趨勢(shì)（在刺激后24 h達(dá)最低值），且克氏原螯蝦血淋巴黑化反應(yīng)程度明顯減弱。干擾duox1基因表達(dá)并感染金黃色葡萄球菌后，克氏原螯蝦肝胰腺Toll信號(hào)通路上的抗菌肽基因（toll1、dorsal、crustin3和crustin4）表達(dá)被抑制，導(dǎo)致參與抗菌反應(yīng)的先天免疫能力下降，最終引起克氏原螯蝦存活率下降?！窘Y(jié)論】克氏原螯蝦duox1基因通過(guò)調(diào)控H2O2產(chǎn)生、影響血淋巴黑化現(xiàn)象及調(diào)控toll1、dorsal、crustin3和crustin4等抗菌肽基因的表達(dá)，參與機(jī)體的先天免疫應(yīng)答，進(jìn)而協(xié)助機(jī)體抵御金黃色葡萄球菌的侵染。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦；雙氧化酶1基因（duox1）；金黃色葡萄球菌；RNA干擾；抗菌肽基因

中圖分類號(hào)：S945.49文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）08-2485-10

Innate immune mechanism of duox1 gene in Procambarus clarkii against Staphylococcus aureus infection

LIU Shu-yao LI Qian-qian WEN Jing JIN Bo-yang ZHANG Ming-da TAN Ming-yue SHEN Xiu-li DU Zhi-qiang1*

（1School of Life Science and Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou，InnerMongolia 014010，China；2Library of Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou，Inner Mongolia 014010，China）

Abstract：【Objective】The study aimed to elucidate the role and mechanism of double oxidase 1 gene（duox1）in the innate immune response of Procambarus clarkii against Staphylococcus aureus infection，providing technical support for the sustainable and healthy development of P.clarkii industry.【Method】The real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the relative expression of duox 1 gene in hemocytes，hepatopancreas，intestine and gill tissues of P.clarkii after stimulation of S.aureus.By using RNA interference（RNAi）to down-regulate the expression of the duox1 gene and subsequently stimulating with S.aureus，the survival rate of the P.clarkii was determined.The contents of H2O2 in the he-patopancreas were measured with an H2O2 detection kit.Melanization in the hemolymph was observed under an electronmicroscope.The expression of antimicrobial peptide genes（toll dorsal，crustin3 and crustin4）in the hepatopancreas was assessed using real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】After stimulation by S.aureus，the relative expres-sion of the duox1 gene in hemocytes，hepatopancreas，intestine and gill tissues of P.clarkii showed an overall upwaHpfc30FFHSigBKZjUR0tzw==rd trend compared to the PBS group.This suggested that the duox1 gene may be involved in the innate immune response of P.clarkii against bacterial infection，with a potential role in combating bacterial invasion.Compared to the dsGFP+S.au-reus group，after RNA interference and S.aureus stimulation，the survival rate of P.clarkii greatly decreased.The H2 O2 content in the hepatopancreas showed a trend of initial reduction followed by recovery（reaching its lowest point 24 h after stimulation），and the degree of hemolymph melanization was markedly weakened.After duox1 gene expression was inter-fered and S.aureus infection，the expression of antimicrobial peptide genes（toll dorsal，crustin3 and crustin4）in the Toll signaling pathway of the hepatopancreas was suppressed，leading to a reduction in innate immune capacity against bacterial infection，ultimately resulting in a decreased survival rate of P.clarkii.【Conclusion】The duox1 gene ofP.clarkii participates in the innate immune response of the body by regulating H2O2 production，affecting themelanization of hemo-lymph，and regulating the expression of antimicrobial peptide genes such as toll dorsal，crustin3 and crustin4，thereby assisting the body in resisting infection by S.aureus.

Key words：Procambarus clarkii；double oxidase 1 gene（duox1）；Staphylococcus aureus；RNA interference；anti-bacterial peptide genes

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32060834）；Inner Mongolia Natural Science Foundation（2024MS03051）；Basic Research Fund of Inner Mongolia University of Science and Technology（〔2022〕028）

0引言

【研究意義】克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱紅沼澤小龍蝦，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）十足目（Decapoda）擬螯蝦科（Parastacidae），原產(chǎn)于墨西哥北部和美國(guó)南部，現(xiàn)已發(fā)展成為我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物（陳衛(wèi)軍，2019）。近年來(lái)受病害頻發(fā)等因素的影響，克氏原螯蝦死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，已影響到我國(guó)淡水養(yǎng)殖市場(chǎng)的健康發(fā)展（孟思妤等，2017）。金黃色葡萄球菌（Staphylococ-cus aureus）作為常見(jiàn)的致病菌，可誘發(fā)蝦蟹等甲殼類生物發(fā)生多種細(xì)菌性疾?。╒asta and Wang，2020；Cheung et al.，2021），但目前尚缺乏有效的防治手段，給水產(chǎn)養(yǎng)殖市場(chǎng)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失?？耸显r感染細(xì)菌后不僅導(dǎo)致其養(yǎng)殖減產(chǎn)，在食品安全方面還會(huì)威脅人類健康（蘭培利等，2024）。因此，亟待明確克氏原螯蝦的先天免疫應(yīng)答機(jī)制，為制定其病害防控策略提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】克氏原螯蝦缺乏特異性免疫，只能通過(guò)先天免疫應(yīng)答而發(fā)揮免疫抵抗作用，主要包括體液免疫和細(xì)胞免疫2種形式（Li etal.，2020）。血淋巴作為克氏原螯蝦的主要免疫組織之一，同時(shí)在體液免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮作用（Qin et al.，2019）。其中，血淋巴氧化性殺滅機(jī)制會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen spe-cies，ROS）（張利慶，2007），而ROS作為一種重要免疫效應(yīng)物，在無(wú)脊椎動(dòng)物抵抗病原菌侵染時(shí)發(fā)揮免疫作用或作為第二信使激活下游相關(guān)信號(hào)通路（Zhang et al.，2022）。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）家族包括7種異構(gòu)體（NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2）（Nocella et al.，2023），其主要生理功能包括宿主防御、蛋白翻譯后處理、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控及細(xì)胞分化等（Bedard and Krause，2007）。雙氧化酶（Dual oxi-dase，DUOX）是NOX家族的重要成員之一（García et al.，2023），主要介導(dǎo)H2O2產(chǎn)生，在機(jī)體抗菌的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Giusti etal.，2020；Gu et al.，2021）。DUOX首次在人類甲狀腺細(xì)胞中鑒定獲得（Caillou et al.，2001），隨后陸續(xù)在果蠅（Dro-sophila）（Kim and Lee，2014）、斑馬魚(yú)（Danio rerio）（Chopra et al.，2019）、凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus van-namei）（Zhang et al.，2019）等生物體中發(fā)現(xiàn)DUOX。Yang等（2020）研究證實(shí)，經(jīng)副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）或白斑綜合征病毒（White spotsyndrome virus，WSSV）感染后，擬穴青蟹（Scylla paramamosain）的duox1基因表達(dá)被激活，ROS積累增加，從而抑制擬穴青蟹血淋巴中的病原微生物增殖；Guan等（2021）以斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)RIC體液因子可能是通過(guò)調(diào)控duox基因表達(dá)，而在氧化應(yīng)激與組織損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用；Yu等（2023）在蛤蜊中也發(fā)現(xiàn)DUOX介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生可激活Toll信號(hào)通路中抗菌肽表達(dá)，而參與無(wú)脊椎動(dòng)物的抗菌先天免疫應(yīng)答；Ji等（2024）研究發(fā)現(xiàn)，DUOX在甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的先天免疫中發(fā)揮抗菌作用。在無(wú)脊椎動(dòng)物中，血淋巴黑化現(xiàn)象作為體液免疫的關(guān)鍵免疫反應(yīng)，由無(wú)活性的酶原（prophenoloxidase，proPO）激活級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)，在抵御病原微生物入侵的過(guò)程發(fā)揮重要作用（Tassanakajonet al.，2018）。Wilson等（2001）在非洲黏蟲(chóng)（Spodop-tera exempta）中發(fā)現(xiàn)，黑化現(xiàn)象與血淋巴中的酚氧化酶（PO）活性呈正相關(guān)；Huang等（2020）研究表明，黑水虻（Hermetiaillucens）的Duox-TLR3 RNAi滅活NF-κB信號(hào)通路并下調(diào)抗菌肽表達(dá)，進(jìn)而減弱機(jī)體對(duì)病原體的抑制作用。綜上所述，DUOX在無(wú)脊椎動(dòng)物抗菌先天免疫中發(fā)揮重要作用。【本研究切入點(diǎn)】已有研究證實(shí)，duox1基因在果蠅免疫應(yīng)答反應(yīng)中被激活，通過(guò)產(chǎn)生H2O2介導(dǎo)Toll信號(hào)通路激活，幫助機(jī)體抵抗外來(lái)病原菌的侵染（Ramond et al.，2021），但關(guān)于克氏原螯蝦duox1基因抵抗金黃色葡萄球菌侵染的免疫應(yīng)答作用機(jī)制至今鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)克氏原螯蝦感染金黃色葡萄球菌后血細(xì)胞、肝胰腺、腸道及鰓組織中的duox1基因表達(dá)情況，并通過(guò)RNA干擾（RNAi）降低duox1基因表達(dá)后再以金黃色葡萄球菌進(jìn)行刺激，統(tǒng)計(jì)克氏原螯蝦存活率、檢測(cè)H2O2含量及觀察血淋巴黑化現(xiàn)象，并檢測(cè)Toll信號(hào)通路上經(jīng)典抗菌肽基因的表達(dá)變化，探究duox1基因在克氏原螯蝦抗細(xì)菌感染先天免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制，為確保克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

克氏原螯蝦購(gòu)自內(nèi)蒙古包頭市友誼福瑞水產(chǎn)市場(chǎng)，挑選體積較小、活力好的個(gè)體。正式試驗(yàn)前，克氏原螯蝦在恒溫水池中避光暫養(yǎng)2周。金黃色葡萄球菌由內(nèi)蒙古科技大學(xué)分子免疫實(shí)驗(yàn)室保存提供，試驗(yàn)前用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)。動(dòng)物試驗(yàn)獲得內(nèi)蒙古大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)許可，許可證號(hào)為SCXK（內(nèi)蒙古）2016-0001。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1金黃色葡萄球菌刺激及表達(dá)模式研究試驗(yàn)分別設(shè)金黃色葡萄球菌刺激組及磷酸鹽緩沖液（PBS）刺激組，每組30只健康的克氏原螯蝦。金黃色葡萄球菌刺激組在克氏原螯蝦第二腹節(jié)處注射金黃色葡萄球菌懸液（以PBS稀釋，2×107 CFU/mL），注射劑量100.0μL；PBS刺激組克氏原螯蝦注射等體積的PBS。注射后0、2、6、12、24、36和48 h，無(wú)菌條件下采集克氏原螯蝦的血淋巴、肝胰腺、腸道和鰓組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只克氏原螯蝦。其中，血淋巴在4℃下2900 r/min離心10 min，以獲得血細(xì)胞（Huang et al.，2023）。分別提取各時(shí)間點(diǎn)不同組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌刺激后克氏原螯蝦duox1基因的表達(dá)情況。以18S rRNA為內(nèi)參基因，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60℃34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物如表1所示。

1.2.2克氏原螯蝦duox1基因雙鏈RNA體外轉(zhuǎn)錄合成基于前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)干擾引物（duox1-iF和duox1-iR）（表1）。擴(kuò)增克氏原螯蝦duox1基因干擾片段，擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，60℃45 s，72℃40 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。富集純化后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，-20℃保存?zhèn)溆?。使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，制備克氏原螯蝦duox1基因雙鏈RNA，反應(yīng)體系25.0μL：10×Transcription Buffer 4.0μL，ATP/UTP/CTP/GTP 4.0μL，RNase Inhibitor 1.0μL，T7 RNA聚合酶1.0μL，DNA模板10.0μL，RNase Free H2O 5.0μL?；靹蚝?，42℃水浴2h。加入RNase free DNaseI 4.0μL，37℃繼續(xù)水浴1h以去除殘留的DNA。體外轉(zhuǎn)錄合成的克氏原螯蝦duox1基因雙鏈RNA置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，并以相同方法制備GFP雙鏈RNA作為對(duì)照。

1.2.3 RNA干擾試驗(yàn)RNA干擾試驗(yàn)分為3組，分別為dsduox1+金黃色葡萄球菌組、dsGFP+金黃色葡萄球菌組和PBS組。將制備的雙鏈RNA稀釋至3000 ng/μL。每組隨機(jī)挑選30只健康的克氏原螯蝦，于血竇處注射25.0μL雙鏈RNA，同時(shí)在第二腹節(jié)處注射金黃色葡萄球菌懸液（2×107 CFU/mL），注射劑量100.0μL。PBS組注射等體積的無(wú)菌PBS。

1.2.4 RNA干擾后克氏原螯蝦存活率統(tǒng)計(jì)經(jīng)RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后，對(duì)克氏原螯蝦存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；同時(shí)，在注射后0、24和48 h無(wú)菌解剖克氏原螯蝦并采集肝胰腺組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)至少解剖3只克氏原螯蝦，肝胰腺組織樣品-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 RNA干擾后克氏原螯蝦肝胰腺H2O2含量檢測(cè)取上述RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后0、24和48 h的克氏原螯蝦肝胰腺組織（3只克氏原螯蝦的混合樣品），置于無(wú)菌勻漿器中加入1 mL預(yù)冷丙酮，冰浴勻漿后，4℃下12000 r/min離心10 min，取上清液，按H2O2含量檢測(cè)試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）說(shuō)明在415nm處檢測(cè)吸光度（A），并換算為克氏原螯蝦肝胰腺H2O2含量。

1.2.6 RNA干擾后克氏原螯蝦血淋巴黑化反應(yīng)情況觀察在RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后0、24和48h分別進(jìn)行克氏原螯蝦血淋巴黑化反應(yīng)情況觀察。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取3只克氏原螯蝦的血淋巴，將2 mL克氏原螯蝦血淋巴與1 mL抗凝劑（表2）混合后，立即滴一滴混合液于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，電子顯微鏡下觀察拍攝。

1.2.7干擾后克氏原螯蝦肝胰腺抗菌肽基因表達(dá)檢測(cè)取RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后0、24和48 h的克氏原螯蝦肝胰腺組織樣品50 mg（3只克氏原螯蝦的混合樣品），使用RNAiso Plus試劑盒（日本TaKaRa公司）提取總RNA，以NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定其完整性。采用Prime Script TR Reagent Kit試劑盒（日本TaKaRa公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系10.0μL：5×Prime Script TR Master Mix 2.0μL，RNA模板1.0μL，RNase freedH2O 7.0μL。反轉(zhuǎn)錄程序：37℃15 min，85℃5 s。以制備獲得的cDNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)抗菌肽基因（toll1、dorsal、crustin3和crustin4）的表達(dá)情況，以18S rRNA為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增引物序列如表1所示，擴(kuò)增程序同1.2. 每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2020進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過(guò)GraphPad Prism 8.0進(jìn)行雙因素方差分析（Two-way ANOVA）。

2結(jié)果與分析

2.1金黃色葡萄球菌刺激后克氏原螯蝦duox1基因表達(dá)模式

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌刺激后duox1基因在克氏原螯蝦不同組織中的表達(dá)模式，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)金黃色葡萄球菌刺激后，克氏原螯蝦duox1基因在血細(xì)胞、肝胰腺、腸道及鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量較PBS組整體上呈上升趨勢(shì)。在血細(xì)胞中，duox1基因相對(duì)表達(dá)量在金黃色葡萄球菌刺激后6～48 h呈顯著上調(diào)趨勢(shì)（P<0.05，下同），于感染后24 h達(dá)最高值（圖1-A）；金黃色葡萄球菌刺激后2 h，肝胰腺中的duox1基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值，隨后呈顯著下降趨勢(shì)（圖1-B）；在鰓組織中，duox1基因在金黃色葡萄球菌刺激6h后開(kāi)始上調(diào)表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量在刺激后24h達(dá)最高值（圖1-C）；金黃色葡萄球菌刺激后12h，腸道中的duox1基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值（圖1-D）。由此推測(cè)，duox1基因參與克氏原螯蝦的抗菌先天免疫應(yīng)答，具有潛在的抵抗細(xì)菌侵染作用。

2.2 RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后克氏原螯蝦的存活率

經(jīng)RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后，克氏原螯蝦的存活率如圖2所示。與dsGFP+金黃色葡萄球菌組和PBS組相比，dsduox1+金黃色葡萄球菌組克氏原螯蝦存活率呈明顯下降趨勢(shì)，在刺激后36和48 h的差異達(dá)極顯著水平（P<0.0 下同）。

2.3 RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后克氏原螯蝦肝胰腺的H2O2含量

為進(jìn)一步探究duox1基因?qū)耸显r抗金黃色葡萄球菌侵染的作用機(jī)制，使用H2O2含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)克氏原螯蝦肝胰腺的H2O2含量，結(jié)果如圖3所示。與dsGFP+金黃色葡萄球菌組相比，dsduox1+金黃色葡萄球菌組克氏原螯蝦肝胰腺的H2O2含量呈先降低后回升的變化趨勢(shì)，在刺激后24 h達(dá)最低值，H2O2含量被顯著抑制。

2.4 RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后克氏原螯蝦血淋巴黑化現(xiàn)象

經(jīng)RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后，分別于刺激后0、24和48 h對(duì)克氏原螯蝦血淋巴黑化反應(yīng)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示。與dsGFP+金黃色葡萄球菌組相比，dsduox1+金黃色葡萄球菌組克氏原螯蝦血淋巴黑化反應(yīng)被抑制。在刺激后24和48 h，dsGFP+金黃色葡萄球菌組克氏原螯蝦血淋巴出現(xiàn)明顯的黑化現(xiàn)象，dsduox1+金黃色葡萄球菌組克氏原螯蝦雖然存在血淋巴黑化現(xiàn)象，但黑化反應(yīng)程度明顯減弱。

2.5 RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后克氏原螯蝦肝胰腺抗菌肽基因表達(dá)情況

經(jīng)RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后，分別在刺激后0、24和48 h通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)克氏原螯蝦肝胰腺抗菌肽基因表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示。與PBS組相比，dsGFP+金黃色葡萄球菌組克氏原螯蝦肝胰腺中toll1、dorsal、crustin3和crustin4基因的表達(dá)整體上呈不同程度的上調(diào)趨勢(shì)。與dsGFP+金黃色葡萄球菌組相比，dsduox1+金黃色葡萄球菌組克氏原螯蝦肝胰腺中toll1、dorsal、crustin3和crustin4基因呈顯著下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。可見(jiàn)，干擾duox1基因表達(dá)并感染金黃色葡萄球菌后，克氏原螯蝦肝胰腺Toll信號(hào)通路上的toll1、dorsal、crustin3和crustin4基因表達(dá)被抑制，導(dǎo)致參與抗細(xì)菌反應(yīng)的先天免疫能力下降，最終引起克氏原螯蝦存活率下降。

3討論

DUOX是NOX家族的主要成員之一。NOX家族包括5個(gè)產(chǎn)生超氧陰離子的Noxes和2個(gè)產(chǎn)生H2O2的Duoxes（Inada et al.，2013）。DUOX主要介導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生，進(jìn)而產(chǎn)生低硫氰酸根離子，在宿主的防御反應(yīng)或促炎反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Rada and Leto，2008）。在脊椎動(dòng)物中，duox基因與黏膜免疫相關(guān)；在無(wú)脊椎動(dòng)物中，duox基因的主要功能是維持機(jī)體腸道菌群平衡（Li etal.，2024）。細(xì)菌通過(guò)自身產(chǎn)生的尿嘧啶，促使膜上的G蛋白偶聯(lián)受體激活2條信號(hào)通路［激活轉(zhuǎn)錄因子2（ATF2）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜應(yīng)激］。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜應(yīng)激致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的通道打開(kāi)，鈣離子外泄形成鈣波，作為第二信使激活duox基因表達(dá)，從而產(chǎn)生ROS（Hong and Qin，2023）。

DUOX主要與氧化應(yīng)激、能量代謝及炎癥反應(yīng)等有關(guān)（Lee et al.，2018；Grasberger et al.，2021；Baek et al.，2022），但至今有關(guān)無(wú)脊椎動(dòng)物DUOX的研究報(bào)道較少。Yang等（2016）以日本囊對(duì)蝦（Marsu-penaeus japonicus）為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在鰻弧菌（V.anguillarum）侵染機(jī)體后，duox1基因呈明顯上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；Sun等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，以LPS模擬細(xì)菌刺激及副溶血性弧菌感染擬穴青蟹后，其體內(nèi)的duox1基因表現(xiàn)出明顯的免疫響應(yīng)，故推測(cè)擬穴青蟹duox1基因參與機(jī)體抵抗細(xì)菌侵襲的免疫過(guò)程?？梢?jiàn)，duox1基因在無(wú)脊椎動(dòng)物抵御病原菌侵染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究以金黃色葡萄球菌為病原菌感染刺激克氏原螯蝦，分別檢測(cè)血細(xì)胞、肝胰腺、腸道和鰓組織中的duox1基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)duox1基因在各組織中的表達(dá)整體上呈上升趨勢(shì)。值得注意的是，鰓組織中duox1基因的上調(diào)表達(dá)主要集中在感染后期，可能是鰓組織作為主要的呼吸器官，其免疫響應(yīng)相對(duì)較弱，而出現(xiàn)滯后現(xiàn)象（Burgos-Aceves et al.，2021）。為進(jìn)一步驗(yàn)證duox1基因在抵御金黃色葡萄球菌侵染的作用機(jī)制，本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)敲低duox1基因表達(dá)，再以金黃色葡萄球菌進(jìn)行刺激，結(jié)果顯示，與dsGFP+金黃色葡萄球菌組相比，克氏原螯蝦存活率極顯著下降，與Inada等（2013）的研究結(jié)果相似，即敲低duox基因表達(dá)后以WSSV進(jìn)行刺激，日本囊對(duì)蝦的存活率顯著下降。說(shuō)明duox1基因在克氏原螯蝦抵抗病原菌感染的過(guò)程中對(duì)于維持機(jī)體生存起重要作用。

DUOX主要介導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生而發(fā)揮殺菌作用，同時(shí)可作為第二信使激活或募集血細(xì)胞執(zhí)行免疫效應(yīng)（Cheon et al.，2020；Giusti et al.，2020；To et al.，2020）。Huang等（2020）以黑水牤（Hermetiaillucens）為模式生物，敲低duox基因表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于dsGFP組，其H2O2含量顯著下降；Jia等（2023）以中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）為研究對(duì)象，同樣發(fā)現(xiàn)敲低duox基因表達(dá)后，機(jī)體內(nèi)的ROS含量顯著降低，表明duox基因介導(dǎo)ROS產(chǎn)生的主要類型是H2O2；Zhang等（2023）對(duì)同家族的NOX基因進(jìn)行RNA干擾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹H2O2含量也出現(xiàn)明顯的抑制現(xiàn)象，其體內(nèi)細(xì)菌含量則顯著增加。本研究結(jié)果表明，經(jīng)RNA干擾及金黃色葡萄球菌刺激后，克氏原螯蝦肝胰腺H2O2含量較dsGFP+金黃色葡萄球菌組呈先降低后回升的變化趨勢(shì)，在刺激后24 h達(dá)最低值。此外，Li等（2019）在以大腸桿菌（Escherichia coli）刺激的家蠶（Bombyx mori）中發(fā)現(xiàn)血淋巴黑化現(xiàn)象增加，表明血淋巴黑化作用有可能具有清除病原體的功能。在本研究中，敲低duox1基因表達(dá)后以金黃色葡萄球菌進(jìn)行刺激，克氏原螯蝦血淋巴黑化反應(yīng)程度明顯減弱，與H2O2含量檢測(cè)結(jié)果相互驗(yàn)證。

抗菌肽作為一種廣譜抗菌活性物質(zhì)，是無(wú)脊椎動(dòng)物殺菌的主要途徑（李博等，2020；梁子瑩等，2023；Guryanova et al.，2023）。Lipinski等（2009）在敲低duox基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)NOD2基因和duox基因協(xié)同發(fā)揮抗菌作用；Huang等（2020）以黑水虻為研究對(duì)象，通過(guò)干擾體內(nèi)duox基因信號(hào)級(jí)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)抵抗病原菌侵染的相關(guān)基因顯著下調(diào)表達(dá)，推測(cè)duox基因通過(guò)影響下游效應(yīng)基因表達(dá)而發(fā)揮作用。此外，Chakrabarti和Visweswariah（2020）研究表明，機(jī)體損傷部位的H2O2水平?jīng)Q定著DUOX活性，H2O2在血細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生與積累對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路和Toll信號(hào)通路的激活至關(guān)重要。為進(jìn)一步探究引起克氏原螯蝦存活率下降的原因，本研究通過(guò)RNA干擾敲低duox1基因表達(dá)，再進(jìn)行金黃色葡萄球菌刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦肝胰腺中的toll1、dorsal、crustin3和crustin4基因均呈顯著下調(diào)表達(dá)，無(wú)法及時(shí)發(fā)揮殺菌作用。綜上所述，在克氏原螯蝦針對(duì)金黃色葡萄球菌感染的免疫響應(yīng)中duox1基因可能通過(guò)影響抗菌肽相關(guān)基因表達(dá)而發(fā)揮免疫調(diào)控功能。

4結(jié)論

克氏原螯蝦duox1基因通過(guò)調(diào)控H2O2產(chǎn)生、影響血淋巴黑化現(xiàn)象及調(diào)控toll1、dorsal、crustin3和crustin4等抗菌肽基因的表達(dá)，參與機(jī)體的先天免疫應(yīng)答，進(jìn)而協(xié)助機(jī)體抵御金黃色葡萄球菌的侵染。

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（責(zé)任編輯蘭宗寶）