花椒精油及其主要成分對番茄鏈格孢菌的抑制作用

摘要：【目的】探明花椒精油對番茄鏈格孢菌（Alternaria alternata）的抑菌效果及作用機(jī)制，以期為利用花椒精油作為植物源熏蒸劑進(jìn)行茄果類蔬菜鏈格孢腐爛病的生物防治提供理論依據(jù)。【方法】以番茄鏈格孢菌菌株HJF-1為試驗(yàn)對象，設(shè)不同濃度（40、80、120、160和200μg/mL）花椒精油及其3種主要成分芳樟醇、檸檬烯、月桂烯熏蒸HJF-1菌絲試驗(yàn)，以無菌水處理作為空白對照，評價(jià)不同物質(zhì)對番茄鏈格孢菌的抑菌效果。通過顯微鏡觀察、生理生化檢測及離體接種等方法，進(jìn)一步分析花椒精油和芳樟醇對病原菌的菌絲形態(tài)、孢子萌發(fā)、芽管長度、細(xì)胞膜完整性及致病力的影響，闡明花椒精油和芳樟醇熏蒸對番茄鏈格孢腐爛病菌的抑菌效果及作用機(jī)制?！窘Y(jié)果】不同濃度的花椒精油及其3種主要成分熏蒸后，HJF-1菌落直徑與對照之間存在明顯差異，熏蒸抑菌效果表現(xiàn)為花椒精油>芳樟醇>月桂烯>檸檬烯，花椒精油和芳樟醇的抑菌效果相對較強(qiáng)，二者的最小抑菌濃度（MIC）均為160μg/mL。不同濃度花椒精油和芳樟醇熏蒸處理的菌絲生長抑制率存在顯著差異（P<0.05，下同），以200μg/mL的濃度熏蒸72 h后，其菌絲生長抑制率分別達(dá)99.10%和99.00%。熏蒸濃度與生長抑制率呈劑量效應(yīng)關(guān)系，花椒精油和芳樟醇對菌株HJF-1的半致死濃度（EC50）分別為85.98和89.84μg/mL。花椒精油和芳樟醇熏蒸處理不僅能顯著降低孢子萌發(fā)率，還可顯著抑制孢子芽管伸長，以濃度為200μg/mL花椒精油和芳樟醇熏蒸6 h后，菌孢子萌發(fā)率最低，分別為1.0%和1.2%，此時孢子芽管長度也最小，分別為9.2和10.8μm。此外，花椒精油和芳樟醇還能引起病原菌畸形和細(xì)胞膜氧化破損，導(dǎo)致菌絲丙二醛含量在熏蒸12 h時上升至6.3和4.0 nmol/mL；熏蒸24 h時，胞外可溶性蛋白含量分別上升至11.9和9.1μg/L，胞外可溶性糖含量分別上升至263.8和237.2μg/L，最終在熏蒸72 h時導(dǎo)致胞外相對電導(dǎo)率達(dá)最大值，分別為62.5%和50.5%。離體試驗(yàn)結(jié)果表明，2×MIC的花椒精油及芳樟醇熏蒸72 h可大幅降低鏈格孢菌的致病力，對鏈格孢腐爛病的相對防效分別達(dá)83.9%和75.6%。【結(jié)論】花椒精油及其主要成分芳樟醇通過抑制鏈格孢菌菌絲生長和孢子萌發(fā)而阻斷病原菌侵染及延緩擴(kuò)展，破壞細(xì)胞表面完整性而引起胞內(nèi)物質(zhì)滲漏及細(xì)胞功能紊亂，最終導(dǎo)致病原菌致病力降低。

關(guān)鍵詞：花椒精油；番茄；鏈格孢菌；抑菌機(jī)理；相對防效

中圖分類號：S573.909.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）08-2473-12

Inhibition effects of Chinese prickly ash essential oil and its main components on Alternaria alternata in tomato

XIONG Shi-jie ZHU Xue-dong YUAN Ji-rong WANG Fa-xing LI Jing-hua JIA Qie1*

（1College of Horticulture and Gardening，Yangtze University/Spice Crops Research Institute，Jingzhou，Hubei 434025，China；2Southeast Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 408000，China）

Abstract：【Objective】This research aimed to explore the antifungal effect and mechanism of Chinese prickly ash es-sential oil against Alternaria alternata in tomato，which would provide th_{7fw8D61yy96I/IYqWbe8IT0b/HG4NnknUXwFOaM5meM=}eoretical reference for the application of Chinese prickly ash essential oil as a botanical fumigant to control A.alternatarot disease in solanaceous vegetable.【Method】Using tomato A.alternata strain HJF-1 as the the tested material，a fumigation experiment was conducted on the mycelium of HJF-1 with different concentrations（40，80，120，160，200μg/mL）of Chinese prickly ash essential oil and its 3 maincomponents（linalool，limonene and mycrene），with sterile water treatment as the blank control.The antifungal effect of different substances on A.alternata were evaluated.Through microscopy observations，physiological and biochemical analysis and in vitro inoculation methods，further analysis was conducted to study the effect of Chinese prickly ash essen-tialoiland linalool on the mycelial morphology，spore germination，germ tube length，cell membrane integrity and patho-genicityofA.alternata，aiming to clarify the antifungal effect and mechanism of fumigation of Chinese prickly ash essen-tialoiland linalool against A.alternata.【Result】After fumigation with different concentrations of Chinese prickly ash es-sential oil and its 3 main components，there were great differences in the colony diameter of HJF-1 compared to the con-trol.The inhibition effect showed as Chinese prickly ash essential oil>linalool>myrcene>limonene.The inhibition effects of Chinese prickly ash essential oil and linalool were stronger than those of other components，and the minimum inhibi-tory concentration（MIC）of the two was both 160μg/mL.There was significant difference in the inhibition rates of myce-lial growth fumigated with different concentrations of Chinese prickly ash essential oil and linalool（P<0.05，the same be-low）with mycelial growth inhibition rates of 99.10%and 99.00%treated with 200μg/mL of Chinese prickly ash essential oil and linalool respectively.There was a dose-effect relationship between fumigation concentration and growth inhibition rate of HJF- and the half lethal concentrations（EC50）of Chinese prickly ash essential oil and linalool were 85.98 and 89.84μg/mL respectively.Fumigation with Chinese prickly ash essential oil and linalool not only significantly reduced spore germination rate，but also inhibited spore tube elongation.By fumigation with 200μg/mL Chinese prickly ash essen-tialoiland linalool for 6 h，spore germination rates were the lowest（1.0%and 1.2%respectively）.At the same time，the lengthes of spore tubes were the minimum（9.2 and 10.8μm respectively）.In addition，Chinese prickly ash essential oil and linalool could also cause pathogen deformity，cell membrane oxidative damage，and increased mycelium malondialde-hyde content to 6.3 and 4.0 nmol/mL after panthogenfumigatied for 12 h compared with before fumigation.By fumigation with the two essential oil for 24 h，the inextracellular soluble proteins contents showed an increase and reached 11.9 and 9.1μg/L respectively，and a increase in extracellular soluble sugars contents to 263.8 and 237.2μg/L respectively.At 72 h of fumigation，extracellular relative conductivity reached the maximun，compared with before fumigation which were 62.5%and 50.5%.In vitro experiment indicated that fumigation with Chinese prickly ash essential oil and linalool（2×MIC）for 72 h greatly reduced the pathogenicity of A.alternata with relative control effects of 83.9%and 75.6%to Alter-naria rot respectively.Chinese prickly ash essential oil and its main components linalool can block the infection and delay the spread of A.alternata by inhibiting mycelium growth and spore germination，causing intracellular leakage and func-tion disorders through damage of cell surface integrity，and ultimately resulting in reduced pathogenicity ofA.alternata.

Key words：Chinese prickly ash essential oil；tomato；Alternaria alternata；antifungal mechanism；relative control effect

Foundation items：Hubei Key Research and Development Plan Project（2022BBA0061）；Hubei Natural Science Foundation（2023AFB1001）；General Project of Chongqing Natural Science Foundation（CSTB2022NSCQ-MSX1558）；Science and Technology Special Project of Yiling District，Yichang City（2023D-101）

0引言

【研究意義】番茄（Solanum lycopersicum L.）在貯藏過程中易受環(huán)境變化影響出現(xiàn)生理失調(diào)，發(fā)生由鏈格孢菌（Alternaria alternata）、青霉菌（Penicil-liumexpansum）等引起的腐爛病，造成產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失（喬鏡澄和麻杰，2015；趙煥蘭等，2022）。目前，番茄的防腐保鮮主要依賴于冷藏、氣調(diào)保藏及化學(xué)防腐劑熏蒸等理化方法，由于成本高、安全性低及病原菌抗藥性等原因，上述方法在實(shí)際生產(chǎn)過程中應(yīng)用有限（凌麗晨，2021）。精油是來源于植物不同部位的小分子、易揮發(fā)的天然混合物，具有來源廣、毒性低、抑菌強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可作為天然的抑菌殺蟲劑（程作慧等，2020；羅怡華等，2020；程志敏等，2022；劉全俊等，2022）。因此，研究植物精油對番茄腐爛病原菌的抑制效果及作用機(jī)理，對于開發(fā)綠色高效的果蔬防腐保鮮劑及提供番茄采后腐爛的生態(tài)友好防治策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究表明，植物精油可對多種植物病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長萌發(fā)和代謝生理產(chǎn)生顯著影響，具有良好的抑菌防腐效果（Fallehetal.，2020；劉全俊等，2022；Luo et al.，2022）。肉桂精油和大蒜精油對鏈鉻孢菌具有顯著抑制作用，其最小抑菌濃度（MIC）分別為0.313和1.250μL/mL，二者復(fù)配體積比為3∶1時抑菌效果良好，72 h后的抑菌直徑可達(dá)22.4 mm（許倩等，2013）。300μg/mL的丁香酚不僅能完全抑制鏈格孢菌菌絲的生長及孢子萌發(fā)，還可導(dǎo)致鏈格孢菌菌體嚴(yán)重變形，表面出現(xiàn)大量褶皺，胞內(nèi)物質(zhì)流失，破壞完整細(xì)胞器，其胞外可溶性蛋白含量和電導(dǎo)率分別提高1.18和8.02倍（葛達(dá)娥，2020）。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)花椒精油也是一種效果顯著的生物抑菌熏蒸劑（Wang et al.，2020b）。Ma等（2021）通過氣質(zhì)聯(lián)用方法檢測發(fā)現(xiàn)，花椒精油富含烯烴類、醇類、酮類、醛類、環(huán)氧化合物、酯類和芳烴類等物質(zhì)，能有效抑制果蔬上的病原微生物，起到果蔬防腐保鮮的功效。全二維氣相色譜—飛行時間質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，花椒精油富含芳樟醇、檸檬烯、β-月桂烯、檜烯和β-蒎烯等物質(zhì)，其相應(yīng)的組分含量分別為22.00%、14.84%、12.70%、8.93%和6.41%（程志敏等，2022）。Wang等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，花椒精油對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocyto-genes）具有顯著抗菌活性。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果也證明，花椒精油對青霉菌和鏈格孢菌均具有顯著抑制效果，14.2μL/L的花椒精油熏蒸5.6 h可有效控制損傷蘋果上的青霉菌生長（王聰?shù)龋?021）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，有離體試驗(yàn)結(jié)果表明，花椒精油溶液浸泡處理能有效控制番茄果實(shí)腐爛病害的發(fā)生，且番茄果實(shí)上鏈格孢菌菌絲體和孢子生長量顯著低于對照（Slathia et al.，2021）。但有關(guān)花椒精油對鏈格孢菌起抑菌作用的主要成分及其相關(guān)的抑菌機(jī)制仍不明確，有待于進(jìn)一步解析。【擬解決的關(guān)鍵問題】以櫻桃番茄腐爛病原菌鏈格孢菌為研究對象，通過熏蒸抑菌評價(jià)、光學(xué)及掃描電子顯微鏡觀察、生理生化檢測和果實(shí)離體接種試驗(yàn)，分析花椒精油及其主要成分對病原菌的生長、萌發(fā)、細(xì)胞膜完整性及致病力的影響，闡明花椒精油熏蒸對番茄鏈格孢菌的抑菌效應(yīng)及作用機(jī)制，為利用花椒精油作為植物源熏蒸劑進(jìn)行茄果類蔬菜鏈格孢腐爛病的生物防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株、培養(yǎng)基及主要試劑供試菌株HJF-1為番茄鏈格孢菌，由長江大學(xué)園藝園林學(xué)院香辛作物研究院保存。櫻桃番茄果實(shí)購自湖北省荊州市果品批發(fā)市場。

PDA培養(yǎng)基：稱取去皮的新鮮馬鈴薯200 g，置于800 mL蒸餾水中煮沸20 min后，用4層紗布過濾。向過濾后的土豆汁中加入20 g葡萄糖、15 g瓊脂，以蒸餾水定容至1000 mL，于121℃下高壓滅菌20 min后備用。PDB培養(yǎng)基：培養(yǎng)基營養(yǎng)配方同PDA，但不加瓊脂。水瓊脂培養(yǎng)基：稱取瓊脂粉16 g加入適量蒸餾水，定容至1000 mL，于121℃下高壓滅菌20min后備用。

主要試劑：花椒精油由花椒果實(shí)通過水蒸氣提取法獲得（羅怡華等，2020）；芳樟醇（純度≥98%）、檸檬烯（純度≥95%）、月桂烯（純度≥90%）購自上海麥克林生化股份有限公司；碘化丙啶（PI，分析純）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；丙二醛測定試劑盒（BC0020）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2儀器和設(shè)備主要儀器設(shè)備包括LDZX-40SBI型電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、HPS-250生化培養(yǎng)箱（青島精誠儀器儀表有限公司）、E600光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）、EVO 18掃描電子顯微鏡［卡爾蔡司（上海）管理有限公司］、Ni-U熒光顯微鏡（日本Nikon公司）、DDS-307A電導(dǎo)儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、UV-8000紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌株活化將低溫（-80℃）保藏的菌株HJF-1菌絲塊移至PDA斜面培養(yǎng)基，于25℃條件下暗培養(yǎng)72 h。然后挑取PDA斜面培養(yǎng)基上長出的HJF-1菌株菌絲，置于新鮮PDA平板培養(yǎng)基上，于25℃條件下暗培養(yǎng)72h后備用。

1.2.2抑菌活性測定采用濾紙片熏蒸法進(jìn)行抑菌活性測定。挑取直徑為6mm的HJF-1菌絲塊，置于PDA平板培養(yǎng)基上，再以貼有5 mm直徑濾紙圓片的培養(yǎng)皿蓋密封，于25℃條件下暗培養(yǎng)。通過在濾紙圓片上滴加不同質(zhì)量精油（包括花椒精油及其3種主要成分芳樟醇、檸檬烯和月桂烯），使培養(yǎng)皿內(nèi)的精油熏蒸濃度分別達(dá)40、80、120、160和200μg/mL。于24、48和72h時，通過十字交叉法測量不同處理時間的菌落直徑，以48 h內(nèi)完全無菌絲生長的精油質(zhì)量濃度作為MIC，并計(jì)算不同濃度精油熏蒸對HJF-1菌絲生長的抑制率。生長抑制率按照以下公式計(jì)算：

生長抑制率（%）=（處理菌落直徑-菌絲塊直徑）/（對照菌落直徑-菌絲塊直徑）×100

通過不同精油濃度值與相應(yīng)菌絲生長抑制率進(jìn)行回歸分析，以SPSS 26.0估算毒力方程及半致死濃度（EC50）。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)使用6個培養(yǎng)皿，以無菌水處理作為空白對照。

1.2.3孢子萌發(fā)率及芽管長度測定以無菌水洗脫菌株HJF-1的分生孢子，調(diào)整為1×105個/mL濃度的孢子懸液。吸取該孢子懸液200μL，涂布于水瓊脂培養(yǎng)基上，參照1.2.2的方法，以濃度40、80、120、160和200μg/mL的花椒精油和芳樟醇熏蒸孢子。在熏蒸6h后通過光學(xué)顯微鏡觀察孢子萌發(fā)，并計(jì)算孢子萌發(fā)率，測量芽管長度，以芽管長度大于孢子半徑為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)觀察3個視野，每個視野下統(tǒng)計(jì)100個分生孢子。以無菌水處理作為空白對照。

1.2.4病原菌菌絲形態(tài)觀察參照1.2.2的方法，以MIC濃度的花椒精油和芳樟醇熏蒸HJF-1菌絲，在25℃條件下暗培養(yǎng)72h后，收集菌絲并按照Yu等（2015）的方法以戊二醛固定2h。通過不同濃度（30%、50%、70%、85%、95%、100%）乙醇溶液依次脫水，以真空冷凍干燥機(jī)干燥2 h，以離子濺射鍍膜機(jī)鍍膜60 s，然后在掃描電子顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。每處理重復(fù)3次，以無菌水處理作為空白對照。

1.2.5病原菌細(xì)胞膜完整性測定PI染色觀察：參照1.2.2的方法，挑取經(jīng)MIC濃度的花椒精油和芳樟醇熏蒸72 h的HJF-1菌絲，置于10μg/mL的PI染液中，在30°C、暗條件下染色20 min。再以PBS溶液漂洗菌絲3次，通過熒光顯微鏡在546和590 nm激發(fā)波長下觀察菌絲熒光強(qiáng)度。每處理重復(fù)3次，以無菌水處理作為空白對照。

相對電導(dǎo)率測定：吸取1×105個/mL濃度的孢子懸液2 mL，置于150 mL的PDB培養(yǎng)基中，于25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72h。將濾得的菌絲以無菌水沖洗3次，置于含有MIC濃度的花椒精油和芳樟醇的150 mL去離子水中，于25℃、150 r/min條件下再振蕩培養(yǎng)，分別于0、6、12、24、48和72 h時，將培養(yǎng)液以5000 r/min離心5 min。參考Wang（2020a）等的方法，使用便攜式電導(dǎo)率儀測定上清液的胞外電導(dǎo)率L，然后將其煮沸處理10 min后冷卻至室溫，再次測定電導(dǎo)率L'，初始電導(dǎo)率為L0，計(jì)算相對電導(dǎo)率。每處理重復(fù)3次，以無菌水作為空白對照。相對電導(dǎo)率按以下公式計(jì)算：

相對電導(dǎo)率（%）=（L-L0）/（L'-L0）×100

丙二醛含量測定：按照測定相對電導(dǎo)率的方法處理菌絲，分別于0、6、12、24、48和72 h離心獲得菌絲培養(yǎng)上清液。取0.1 g菌絲，加入提取液，充分研磨，于4℃、5000 r/min下離心5 min。取上清液，參照丙二醛檢測試劑盒說明書，測定不同時間處理菌絲的丙二醛含量。每處理重復(fù)3次，以無菌水處理作為空白對照。

可溶性蛋白含量測定：按照測定相對電導(dǎo)率的方法處理菌絲，分別于0、6、12、24、48和72 h離心獲得菌絲培養(yǎng)上清液。參照石志琦等（2004）的方法，取0.2 mL上清液置于玻璃試管中，再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，5 min后于595nm波長下測定吸光度，計(jì)算菌絲可溶性蛋白含量。每處理重復(fù)3次，以無菌水處理作為空白對照?？扇苄缘鞍缀堪匆韵鹿接?jì)算：

可溶性蛋白含量（μg/L）=c×V2×N×1000/V1

式中，c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的可溶性蛋白濃度（μg/mL），V1為提取液的總體積（mL），V2為測定時所取樣品提取液體積（mL），N為樣品提取液的稀釋倍數(shù)。

可溶性糖含量測定：按照測定相對電導(dǎo)率的方法處理菌絲，分別于0、6、12、24、48和72 h離心獲得菌絲培養(yǎng)上清液。參照蒲小龍等（2017）的方法，取0.1 mL上清液置于玻璃試管中，再加入1.9 mL蒸餾水和0.5 mL蒽酮試劑，然后緩慢加入5.0 mL濃硫酸，迅速混勻后置于80℃恒溫水浴中保溫10min，冷卻至室溫，在630 nm波長下測定吸光度，計(jì)算菌絲可溶性糖含量。每處理重復(fù)3次，以無菌水處理作為空白對照?？扇苄蕴呛堪匆韵鹿接?jì)算：

可溶性糖含量（μg/L）=c×V2×N×1000/V1

式中，c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的可溶性糖濃度（μg/mL），V1為提取液的總體積（mL），V2為測定時所取樣品提取液體積（mL），N為樣品提取液的稀釋倍數(shù)。

1.2.6病原菌致病力測定選取大小一致、色澤均勻、健康的櫻桃番茄果實(shí)，通過針刺法將6 mm的HJF-1菌絲塊接種到櫻桃番茄果實(shí)上。再將接種的櫻桃番茄果實(shí)置于食品盒內(nèi)，以保鮮膜密封并置于25℃下培養(yǎng)。接種24 h后，在食品盒內(nèi)放置1塊棉球，滴加精油至棉球上使食品盒內(nèi)精油濃度達(dá)到MIC和2×MIC。于25℃下熏蒸培養(yǎng)72h后，測定果實(shí)病斑大小，并計(jì)算不同精油對鏈格孢腐爛病害的防治效果。每處理重復(fù)3次，每個重復(fù)檢測20枚櫻桃番茄果實(shí)，以無菌水處理作為空白對照。相對防效按以下公式計(jì)算：

相對防效（%）=（對照斑病直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100

1.3統(tǒng)計(jì)分析

通過SPSS 26.0計(jì)算不同處理下數(shù)據(jù)的平均值，采用單因素（One-way ANOVA）和Duncan’s法進(jìn)行方差分析和多重比較，以Excel 2010制圖。

2結(jié)果與分析

2.1花椒精油及其3種主要成分熏蒸對菌株HJF-1菌絲生長的影響

由圖1可知，不同濃度的花椒精油及其3種主要成分熏蒸后，HJF-1菌落直徑與對照之間存在明顯差異，熏蒸抑菌效果表現(xiàn)為花椒精油>芳樟醇>月桂烯>檸檬烯。當(dāng)熏蒸時間為24h時，不同濃度的花椒精油、芳樟醇、月桂烯和檸檬烯處理的菌餅均未形成明顯的菌落；當(dāng)熏蒸時間為48h時，120μg/mL濃度的花椒精油和芳樟醇處理的菌餅剛形成菌落，其直徑分別為6.5和6.8 mm，而相同濃度檸檬烯和月桂烯處理的菌餅已形成較大菌落，其直徑分別為21.5和22.4 mm，表明花椒精油和芳樟醇的抑菌效果強(qiáng)于檸檬烯和月桂烯，且花椒精油和芳樟醇的MIC均為160μg/mL。隨著花椒精油或芳樟醇熏蒸濃度的逐漸升高，HJF-1菌落直徑不斷減小。以40～200μg/mL濃度梯度的花椒精油熏蒸72h時，HJF-1菌落直徑分別為30.8、23.7、15.3、7.2和6.0 mm；而以同樣濃度梯度的芳樟醇熏蒸72 h時，HJF-1菌落直徑分別為31.8、24.2、16.2、7.7和6.3 mm，菌落直徑與花椒精油和芳樟醇熏蒸濃度之間均呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

根據(jù)花椒精油及其3種主要成分熏蒸72h后的HJF-1菌落直徑，進(jìn)一步計(jì)算不同精油對病原菌的生長抑制率。結(jié)果（圖2）表明，不同濃度的花椒精油及其主要成分熏蒸對HJF-1菌絲生長的抑制率存在顯著差異（r<0.05，下同），花椒精油和芳樟醇相對于檸檬烯和月桂烯的抑菌效果更強(qiáng)。當(dāng)花椒精油和芳樟醇濃度為40μg/mL時，菌絲生長抑制率最低，分別為26.31%和23.34%，當(dāng)2種精油濃度提高至200μg/mL時，菌絲生長抑制率最高，分別為99.10%和99.00%。隨著精油濃度的不斷升高，生長抑制率不斷增大，二者呈劑量效應(yīng)關(guān)系。在相同濃度下，花椒精油和芳樟醇對HJF-1菌絲生長的抑制率無明顯差異，表明花椒精油的抑菌效果可能主要來自芳樟醇組分。

2.2花椒精油和芳樟醇熏蒸對菌株HJF-1的毒力評價(jià)

根據(jù)菌絲生長抑制結(jié)果，進(jìn)一步評價(jià)花椒精油和芳樟醇對菌株HJF-1的熏蒸毒力。由表1可知，以精油對菌株HJF-1的抑菌率為y，以精油濃度的對數(shù)值為x建立回歸方程，花椒精油和芳樟醇對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分別為0.980和0.984，且均達(dá)顯著水平，表明2個方程均能較好擬合精油濃度梯度與毒力效應(yīng)變化之間的關(guān)系。此外，花椒精油對菌株HJF-1的EC50（85.98μg/mL）稍小于芳樟醇對菌株HJF-1的EC50（89.84μg/mL），表明花椒精油對病原菌的熏蒸毒力稍強(qiáng)于芳樟醇。

2.3花椒精油和芳樟醇熏蒸對菌株HJF-1孢子萌發(fā)的影響

圖3-A顯示，不同濃度花椒精油和芳樟醇熏蒸6 h后，菌株HJF-1的孢子萌發(fā)數(shù)量明顯低于對照。圖3-B顯示，除0μg/mL外，花椒精油和芳樟醇濃度為40μg/mL時，菌株HJF-1孢子萌發(fā)率最高，分別為5.5%和7.4%；當(dāng)2種精油濃度上升至200μg/mL時，菌株HJF-1孢子萌發(fā)率最低，分別為1.0%和1.2%，不同濃度花椒精油和芳樟醇處理的孢子萌發(fā)率均顯著低于0μg/mL的萌發(fā)率，且各濃度處理間差異也達(dá)顯著水平。此外，花椒精油熏蒸還能顯著抑制菌株HJF-1孢子芽管伸長。除0μg/mL外，花椒精油和芳樟醇濃度為40μg/mL時，孢子芽管長度最大，分別為30.8和42.2μm，二者分別較0μg/mL顯著降低44.7%和26.4%；當(dāng)2種精油濃度提高至200μg/mL時，孢子芽管長度最小，分別為9.2和10.8μm，二者分別較0μg/mL顯著降低83.5%和81.2%（圖3-C）。由此可知，花椒精油和芳樟醇熏蒸不僅能影響病原菌菌絲生長，還能顯著抑制其孢子萌發(fā)及芽管伸長。

2.4花椒精油和芳樟醇熏蒸對菌株HJF-1菌絲形態(tài)的影響

通過掃描電子顯微鏡觀察160μg/mL（MIC）花椒精油和芳樟醇熏蒸72h后的HJF-1菌絲形態(tài)。結(jié)果表明，對照的菌絲表面平滑，菌絲舒展，邊界清晰（圖4-A）；而花椒精油和芳樟醇熏蒸后HJF-1菌絲形態(tài)異常，表現(xiàn)為菌絲體膨脹、扭曲、表面粗糙、分枝增多變短等畸形，尤其是花椒精油熏蒸的菌絲甚至出現(xiàn)表面缺損、菌絲消解的現(xiàn)象（圖4-B和圖4-C）。由此可知，花椒精油和芳樟醇熏蒸對HJF-1菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成了不可逆的損傷，花椒精油熏蒸甚至造成菌絲體消解。

2.5花椒精油和芳樟醇熏蒸對菌株HJF-1細(xì)胞膜完整性的影響

2.5.1 PI染色觀察結(jié)果圖5顯示，經(jīng)濃度160μg/mL（MIC）花椒精油和芳樟醇熏蒸72h后，HJF-1菌絲內(nèi)均出現(xiàn)明顯的紅色熒光信號，并遍布于菌絲內(nèi)部各個部位，而對照菌絲內(nèi)部未見紅色熒光信號。由此可知，PI熒光染料的滲入，可能是由于花椒精油和芳樟醇熏蒸破壞了病原菌菌絲的細(xì)胞膜完整性，進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)含物泄露。另外，花椒精油熏蒸的菌絲熒光信號強(qiáng)度稍高于芳樟醇，表明花椒精油對病原菌菌絲細(xì)胞膜系統(tǒng)造成了更大損傷。

2.5.2胞外相對電導(dǎo)率和丙二醛含量如圖6-A所示，以濃度160μg/mL（MIC）花椒精油和芳樟醇熏蒸6～72 h后，菌株HJF-1胞外相對電導(dǎo)率均顯著高于對照；且隨著熏蒸時間的不斷延長，胞外相對電導(dǎo)率逐漸上升。在花椒精油和芳樟醇熏蒸24h時，胞外相對電導(dǎo)率大幅上升，分別為40.5%和30.2%，較熏蒸前增加8.0和6.6倍；熏蒸72h時，胞外相對電導(dǎo)率達(dá)最大值，分別為62.5%和50.5%，較熏蒸前增加12.9和11.6倍。

如圖6-B所示，以濃度160μg/mL（MIC）花椒精油和芳樟醇熏蒸6～72 h后，HJF-1菌絲丙二醛含量也存在顯著差異；且隨著熏蒸時間延長，丙二醛含量逐漸上升。在花椒精油和芳樟醇熏蒸12h時，菌絲丙二醛含量大幅上升，分別為6.3和4.0 nmol/mL，較熏蒸前增加5.2和2.9倍；在2種精油熏蒸72h時，丙二醛含量達(dá)最大值，分別為11.5和9.8 nmol/mL，較熏蒸前增加10.2和8.6倍。表明花椒精油和芳樟醇熏蒸12h后，開始造成病原菌細(xì)胞膜嚴(yán)重氧化損傷，并提高細(xì)胞膜的通透性，繼而對鏈格孢菌的生長萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用。

2.5.3胞外可溶性蛋白和可溶性糖含量如圖7-A所示，以濃度160μg/mL（MIC）花椒精油和芳樟醇熏蒸6～72 h后，HJF-1的胞外可溶性蛋白含量與對照存在顯著差異；且隨著熏蒸時間延長，胞外可溶性蛋白含量逐漸上升。在花椒精油和芳樟醇熏蒸24 h時，胞外可溶性蛋白含量開始大幅度上升，分別為11.9和9.1μg/L，較熏蒸前增加10.7和7.8倍；在2種精油熏蒸72h時可溶性蛋白含量達(dá)最大值，分別為14.2和12.5μg/L，較熏蒸前增加13.0和11.1倍。

如圖7-B所示，以濃度160μg/mL（MIC）花椒精油和芳樟醇熏蒸6～72 h后，HJF-1的胞外可溶性糖含量也均高于對照；且隨著熏蒸時間延長，胞外可溶性糖含量逐漸上升。在花椒精油和芳樟醇熏蒸24 h時，胞外可溶性糖含量開始大幅上升，分別為263.8和237.2μg/L，較熏蒸前增加52.7%和37.8%；在2種精油熏蒸72 h時，胞外可溶性糖含量達(dá)最大值，分別為285.5和265.0μg/L，較熏蒸前增加65.2%和53.9%。表明花椒精油及芳樟醇熏蒸24 h后，病原菌細(xì)胞表面損傷，造成可溶性蛋白和可溶性糖等物質(zhì)滲漏，以及細(xì)胞生理功能紊亂，最終導(dǎo)致病原菌生長停止。另外，不同物質(zhì)滲漏結(jié)果也顯示花椒精油對鏈格孢菌的破壞程度稍強(qiáng)于芳樟醇。

2.6花椒精油和芳樟醇熏蒸對菌株HJF-1致病力的影響

由圖8可知，不同濃度花椒精油和芳樟醇熏蒸72 h后，番茄果實(shí)病斑直徑存在顯著差異，但相同濃度的花椒精油和芳樟醇處理的番茄果實(shí)間病斑直徑差異不明顯。當(dāng)花椒精油和芳樟醇熏蒸濃度為160μg/mL（MIC）時，番茄果實(shí)病斑直徑相對較大，分別為9.7和12.0 mm，其相對防效分別為53.3%和41.5%；熏蒸濃度為320μg/mL（2×MIC）時，二者的果實(shí)病斑直徑相對較小，分別為3.3和5.0 mm，其相對防效分別為83.9%和75.6%。由此可知，花椒精油和芳樟醇熏蒸不僅能抑制番茄鏈格孢菌的生長萌發(fā)和細(xì)胞物質(zhì)滲漏，還對其致病力產(chǎn)生顯著抑制，且二者的病害防治效果相當(dāng)。

3討論

鏈格孢腐爛病是番茄的一種重大貯藏病害，通過生物抑菌劑熏蒸防治是目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)（Tian et al.，2006）?；ń肪筒粌H廣泛用于調(diào)料、香料和食品添加劑等，還可作為一種天然環(huán)保的抑菌物質(zhì)進(jìn)行多種植物病害的控制，是理想的果蔬采后熏蒸防腐劑選擇之一（Yang et al.，2017；Raveau et al.，2020）。開展花椒精油及其主要成分對番茄鏈格孢腐爛病的防治效果與作用機(jī)理研究，對拓展利用植物源活性物質(zhì)抑菌防腐具有理論與實(shí)踐價(jià)值（Chouhan et al.，2017；Dehsheikhetal.，2020）。

前人研究表明，花椒精油對細(xì)菌和真菌生長均有顯著抑制效果（Wang et al.，2020a）。宋麗雅等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，花椒精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌均具有顯著抑制效果，其相應(yīng)的MIC分別為7.5、7.5和10.0 mg/mL。本研究也得到類似結(jié)果，花椒精油和芳樟醇對番茄鏈格孢菌表現(xiàn)出顯著抑制作用，其MIC為160μg/mL；相較于檸檬烯和月桂烯，花椒精油和芳樟醇對番茄鏈格孢菌的抑制效果更佳，以200μg/mL熏蒸72h后，菌絲生長抑制率分別達(dá)99.1%和99.0%。不同物質(zhì)的抑菌效果存在差異可能是由病原菌對花椒精油不同成分的敏感性不同所造成。其中，花椒精油和芳樟醇的EC50分別為85.98和89.84μg/mL，表明花椒精油和芳樟醇能顯著抑制病原菌生長，延緩病害發(fā)生。但本研究的EC50較王啟方等（2023）研究中的EC50結(jié)果偏大，其原因可能是不同試驗(yàn)菌株對藥劑的敏感性及試驗(yàn)處理方法（前人研究方法為直接觸殺法）存在差異。另外，花椒精油的EC50略小于芳樟醇，顯示前者對鏈格孢菌的毒力稍強(qiáng)于后者。

由于番茄鏈格孢菌多以分生孢子等繁殖體進(jìn)行傳播致病，孢子萌發(fā)的效率及快慢能顯著影響病害發(fā)生的程度，因此抑制孢子萌發(fā)和芽管伸長也具有重要的病害防治意義（Ma etal.，2022）。王啟方等（2023）的研究結(jié)果顯示，芳樟醇對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)有顯著抑制作用，且隨著芳樟醇處理濃度的提高，抑制率不斷升高。香葉醇處理12 h后也對甜橙酸腐病菌的孢子萌發(fā)具有顯著抑制效果（翁甜等，2023）。本研究通過花椒精油和芳樟醇熏蒸也得到類似結(jié)果，經(jīng)200 mg/mL花椒精油熏蒸6 h后，番茄鏈格孢菌孢子萌發(fā)率和芽管長度均顯著低于對照，其孢子萌發(fā)率和芽管長度分別降低98.8%和83.5%，芳樟醇熏蒸6h后的孢子萌發(fā)率和芽管長度也分別降低98.7%和81.2%，表明花椒精油和芳樟醇能顯著抑制鏈格孢菌孢子的萌發(fā)，阻斷該病原菌的再侵染過程。

細(xì)胞膜是真菌細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞的正常形態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，參與細(xì)胞與外界物質(zhì)的交換和信息傳遞過程，保障正常生命活動（Ju et al.，2022）。PI是一種核熒光染料，可通過破損表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，反映細(xì)胞的衰亡狀況（Wang et al.，2022）。王啟方等（2023）通過PI染色觀察發(fā)現(xiàn)，芳樟醇處理后的灰葡萄孢菌內(nèi)部呈紅色熒光，細(xì)胞表現(xiàn)出衰亡現(xiàn)象。本研究中，以花椒精油和芳樟醇熏蒸72h的鏈格孢菌絲，經(jīng)PI染色后內(nèi)部也出現(xiàn)大量紅色熒光信號，表明PI染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，病原菌進(jìn)入衰亡狀態(tài)。而掃描電鏡觀察結(jié)果也顯示，花椒精油和芳樟醇熏蒸會導(dǎo)致菌絲膨脹、扭曲、邊界模糊等，甚至發(fā)生表面消解，該現(xiàn)象也從另一角度印證了鏈格孢菌受到精油熏蒸抑制而發(fā)生衰亡的現(xiàn)象。

番茄鏈格孢菌經(jīng)過熏蒸發(fā)生衰亡的原因也可從滲漏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解釋。丙二醛為細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其濃度反映細(xì)胞膜的氧化損傷程度。本研究中，經(jīng)花椒精油和芳樟醇熏蒸12h后，菌絲丙二醛含量呈大幅上升，較熏蒸前分別增加5.2和2.9倍，表明鏈格孢細(xì)胞膜受到了嚴(yán)重的氧化損傷。而細(xì)胞表面損傷的進(jìn)一步危害則是引起胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，包括可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和核酸等，導(dǎo)致胞外電導(dǎo)率不斷增加，致病力下降，細(xì)胞死亡加速（胡晶鼎，2022）。本研究中，經(jīng)花椒精油和芳樟醇熏蒸24 h后，鏈格孢菌胞外相對電導(dǎo)率開始大幅上升，較熏蒸前分別增加8.0和6.6倍，表明因細(xì)胞表面氧化造成損傷可能帶來了胞內(nèi)物質(zhì)滲漏。而同樣熏蒸處理也使胞外可溶性蛋白和可溶性糖含量在24h后開始大幅上升，最終在72h時，前者較熏蒸前分別增加13.0和11.1倍，后者較熏蒸前分別增加65.2%和53.9%。另外，2種精油熏蒸可使果實(shí)腐爛病斑直徑顯著減小，病原菌致病力降低，對鏈格孢腐爛病分別產(chǎn)生83.9%和75.6%的防治效果。綜上可知，花椒精油和芳樟醇熏蒸造成細(xì)胞表面不可逆的破損，引起胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，影響細(xì)胞正常的形態(tài)和生理活動，最終導(dǎo)致病原菌生長減緩和致病力喪失。

此外，花椒精油及芳樟醇還能引起病原菌的細(xì)胞膜組分合成減少、能量代謝系統(tǒng)紊亂及植株抗病系統(tǒng)的激活等生理生化變化。前人研究表明，隨著芳樟醇處理濃度的增加，紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）細(xì)胞膜麥角甾醇含量減少，芳樟醇抑制其細(xì)胞膜組分的合成（成福等，2022）；芳樟醇處理可導(dǎo)致熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）的三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性和Na+/K+-ATP酶活性顯著下降，可干擾病原菌的能量合成代謝（郭俸鈺，2021）；花椒精油處理還可提高番茄水楊酸、茉莉酸、乙烯信號通路中相關(guān)防衛(wèi)基因PR1、PIN2的表達(dá)（王丹，2015）。本研究僅分析了花椒精油及其主要成分對鏈格孢菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用及其對病原菌細(xì)胞破壞和致病力的影響，今后尚需深入開展上述物質(zhì)對病原菌的生理代謝、致病基因表達(dá)及植物防衛(wèi)反應(yīng)的影響等研究，以期為番茄鏈格孢腐爛病的新型無公害生物防治藥劑開發(fā)提供更科學(xué)的借鑒參考。

4結(jié)論

花椒精油及其主要成分芳樟醇通過抑制鏈格孢菌菌絲生長和孢子萌發(fā)而阻斷病原菌侵染及延緩擴(kuò)展，破壞細(xì)胞表面完整性而引起胞內(nèi)物質(zhì)滲漏及細(xì)胞功能紊亂，最終導(dǎo)致病原菌致病力下降。

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（責(zé)任編輯王暉）