黃曲條跳甲短鏈氣味結(jié)合蛋白基因PstrOBP-sc分子和功能特點(diǎn)分析

摘要：【目的】分析黃曲條跳甲（Phyllotretastriolata）短鏈氣味結(jié)合蛋白（Odorant binding protein，OBP）基因PstrOBP-sc分子和功能特點(diǎn)，為揭示昆蟲(chóng)短鏈OBP基因的功能提供參考?！痉椒ā坷媚孓D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）克隆黃曲條跳甲短鏈Classic OBP基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分析短鏈OBP基因在黃曲條跳甲雌、雄成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)情況；構(gòu)建重組表達(dá)載體異源表達(dá)短鏈OBP基因，以聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）驗(yàn)證目的蛋白；運(yùn)用熒光結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)短鏈OBP的配體結(jié)合能力?！窘Y(jié)果】通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)克隆驗(yàn)證，成功獲得1條具有完整開(kāi)放閱讀框的黃曲條跳甲短鏈OBP基因PstrOBP-sc。PstrOBP-sc基因含有1個(gè)357 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼118個(gè)氨基酸殘基，N末端具有1個(gè)由20個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，成熟蛋白PSTROBP-SC僅由98個(gè)氨基酸殘基組成，序列中含有6個(gè)保守的半胱氨酸，屬于典型短鏈OBP基因。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PSTROBP-SC蛋白僅存在5個(gè)α-螺旋，且在第5個(gè)α-螺旋的下游僅有2個(gè)氨基酸殘基。PstrOBP-sc基因組織表達(dá)模式及異源表達(dá)的PSTROBP-SC蛋白配體結(jié)合能力研究結(jié)果表明，PstrOBP-sc基因在黃曲條跳甲雌、雄成蟲(chóng)的所有供試組織中均有表達(dá)，而非特異性表達(dá)于嗅覺(jué)器官。同時(shí)，異源表達(dá)PSTROBP-SC不能結(jié)合熒光探針1-NPN。【結(jié)論】PstrOBP-sc基因的分子和功能特點(diǎn)不同于當(dāng)前廣泛研究的中長(zhǎng)鏈OBP基因，其在生物體內(nèi)很可能行使嗅覺(jué)以外的其他生理功能。

關(guān)鍵詞：黃曲條跳甲；短鏈氣味結(jié)合蛋白；分子特征；組織表達(dá)模式；熒光結(jié)合試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S433.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）08-2464-09

Molecular and functional characteristics of a short-chain odorant binding protein gene PstrOBP-sc from Phyllotretastriolata

TIAN Xiao-li SONG Xu-rong MAO Yong-na3，LI Chuan-ren ZHANG Guo-hui2*

（1College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434025，China；2College of Agriculture，YangtzeUniversity/Institute of Entomology，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434025，China；3Jingzhou Branch，Hubei Academy of Forestry，Jingzhou，Hubei 434020，China）

Abstract：【Objective】The study aimed to analyze the molecular and functional characteristics of the short-chain odo-rant binding protein（OBP）gene PstrOBP-sc from Phyllotretastriolata，providing reference for exploring the function of short-chain OBP genes in insects.【Method】The short-chain Classic OBP gene from P.striolata was cloned using reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）and subjected to bioinformatics analysis.The expression of the short-chain OBP gene in different tissues of male and female adult P.striolata was analyzed by RT-PCR.A recombinant expres-sion vector was constructed for the heterologous expression of the short chain OBP gene，and the target protein was veri-fied using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）and Western blotting techniques.Theligand-binding ability of the short-chain OBP was detected using fluorescence binding assay.【Result】A short-chain OBP gene（PstrOBP-sc）from P.striolata with a complete open reading frame was successfully obtained through RT-PCR clo-ning and verification.ThePstrOBP-sc gene contained an open reading frame of 357 bp，encoding 118 amino acid resi-dues，with a signal peptide of 20 amino acid residues at the N-terminal end.The mature protein PSTROBP-SC consisted of only 98 amino acid residues and contained 6 conserved cysteines in its sequence，making it a typical short-chain OBP gene.Protein secondary structure prediction showed that the PSTROBP-SC protein contained only 5α-helixes，and there were only 2 amino acid residues in the downstream of the fifthα-helix.The tissue expression pattern of the PstrOBP-sc gene and the ligand-binding ability of the heterologously expressed PSTROBP-SC protein showed that the PstrOBP-sc gene was expressed in all tested tissues of male and female adult P.striolata，and was not specifically expressed in olfac-tory organs.Additionally，the heterologously expressed PSTROBP-SC could not bind to the fluorescence probe 1-NPN.【Conclusion】The molecular and functional characteristics of PstrOBP-sc gene are different from those of the currently widely studied medium-long chain OBP genes，and it is likely to perform other physiological functions besides olfactionin the organism.

Key words：Phyllotretastriolata；short-chain odorant binding protein；molecular characteristics；tissue expression pattern；fluorescence binding assay

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31972274）；The Outstanding Youth Science and Technology Innovation Team Project of Colleges and Universities in Hubei（T2022009）；Laboratory Research Project of Colleges and Universities in Hubei（HBSY2023-016）

0引言

【研究意義】氣味結(jié)合蛋白（Odorant binding pro-tein，OBP）是昆蟲(chóng)的重要嗅覺(jué)蛋白。OBP功能研究已成為昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一，并被視為篩選新型高效引誘劑和驅(qū)避劑的理想靶標(biāo)（Tian et al.，2016；da Costa et al.，2019；Li etal.，2021）。目前，學(xué)者們對(duì)OBP功能研究主要集中在Classic OBP（即多肽鏈中存在6個(gè)保守的半胱氨酸殘基的OBP）的中長(zhǎng)鏈OBP（120～160個(gè)氨基酸殘基）（Rana et al.，2024）。有關(guān)短鏈OBP（約100個(gè)氨基酸殘基）分子和功能研究鮮有報(bào)道。因此，深入探究短鏈OBP分子和功能特點(diǎn)對(duì)全面認(rèn)識(shí)昆蟲(chóng)OBP家族，以及利用該家族成員應(yīng)用于害蟲(chóng)防治具有重要的理論和實(shí)踐意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】嗅覺(jué)對(duì)昆蟲(chóng)的生存和繁殖至關(guān)重要。昆蟲(chóng)利用嗅覺(jué)感受環(huán)境中揮發(fā)性化合物，并根據(jù)這些化合物攜帶的信息尋找配偶、食物、產(chǎn)卵地點(diǎn)以及躲避天敵（Zhao et al.，2023）。觸角是昆蟲(chóng)主要的嗅覺(jué)器官，觸角的嗅覺(jué)功能通過(guò)著生于其表面的化學(xué)感受器實(shí)現(xiàn)（楊成都等，2024）。昆蟲(chóng)化學(xué)感受器內(nèi)的OBP可結(jié)合進(jìn)入化學(xué)感受器內(nèi)的氣味分子，這個(gè)過(guò)程是昆蟲(chóng)識(shí)別環(huán)境氣味分子的第1步生化反應(yīng)（Kaissling，2009；Leal，2013）。OBP可結(jié)合并運(yùn)送氣味分子至化學(xué)感受器內(nèi)嗅覺(jué)神經(jīng)元樹(shù)突上的嗅覺(jué)受體，此時(shí)神經(jīng)電信號(hào)產(chǎn)生并傳入昆蟲(chóng)大腦，調(diào)控昆蟲(chóng)各種嗅覺(jué)行為反應(yīng)（Leal，2013；劉偉和王桂QTbuSeUhE/GD2qC1QqH8bFrGyZ7GIeHczSjrmHse/4k=榮，2020）。自從多音天蠶蛾（Antheraea poly-phemus）雄蟲(chóng)觸角中首次發(fā)現(xiàn)OBP（Vogt and Riddi-ford，1981）后，大量OBP從超過(guò)100種昆蟲(chóng)中被鑒定出來(lái)（Rihani et al.，2021），如果蠅（Drosophila mela-nogaster）（Hekmat-Scafe et al.，2002）、赤擬谷盜（Tri-boliumcastaneum）（Dippel etal.，2014）和家蠶（Bom-byx mori）（Gonget al.，2009）等。昆蟲(chóng)OBP是一類小分子量（15～20 kD）水溶性分泌蛋白。根據(jù)OBP一級(jí)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度可將其分為長(zhǎng)鏈OBP（約160個(gè)氨基酸殘基）、中鏈OBP（約120個(gè)氨基酸殘基）和短鏈OBP（約100個(gè)氨基酸殘基）（Rihani et al.，2021）。典型的昆蟲(chóng)OBP最明顯的標(biāo)志是其氨基酸序列中存在6個(gè)保守的半胱氨酸殘基（C1～C6），其中第2和第3位（C2和C3）以及第5和第6位（C5和C6）半胱氨酸殘基之間的氨基酸殘基數(shù)一般固定不變，分別為3和8個(gè)氨基酸殘基（Hull et al.，2014）。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)氨基酸序列中半胱氨酸殘基的缺失或增加，昆蟲(chóng)OBP可分為3個(gè)亞類：（1）Classic OBP，即序列中具有上述6個(gè)保守半胱氨酸殘基；（2）Plus-C OBP，這類OBP序列中除了具有Classic OBP中的6個(gè)保守半胱氨酸殘基外，在第6個(gè)保守半胱氨酸下游還存在1個(gè)獨(dú)特的C端結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)保守的半胱氨酸和1個(gè)保守的脯氨酸（Hekmat-Scafe et al.，2002）。2004年學(xué)者們提出了這類OBP的基序（motif）為C1-X20-41-C2-X3-C3-X41-46-C4-X19-29-C4a-X9-C5-X8-C6-P-X9-10-C6a-X9-10（Zhou et al.，2004）；（3）Minus-C OBP，這類OBP序列中缺少Classic OBP的6個(gè)保守半胱氨酸殘基中的2個(gè)，一般是第2和第5位的半胱氨酸殘基缺失，這2個(gè)半胱氨酸被認(rèn)為在昆蟲(chóng)OBP三維結(jié)構(gòu)中會(huì)形成二硫鍵以維持OBP的立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（Hekmat-Scafe et al.，2002）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，學(xué)者們對(duì)Classic OBP的研究最多，并主要集中于中長(zhǎng)鏈Classic OBP，關(guān)于黃曲條跳甲（Phyllotretastriolata）短鏈Classic OBP的分子和功能特點(diǎn)研究鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）克隆黃曲條跳甲短鏈氣味結(jié)合蛋白基因PstrOBP-sc，明確PstrOBP-sc基因生物信息學(xué)及其在成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)情況；構(gòu)建重組表達(dá)載體異源表達(dá)PstrOBP-sc，以聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）驗(yàn)證目的蛋白，運(yùn)用熒光結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)菌表達(dá)的PSTROBP-SC配體結(jié)合能力，分析PstrOBP-sc基因的分子和功能特點(diǎn)，為揭示昆蟲(chóng)短鏈OBP基因的功能提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試蟲(chóng)源本研究所用蟲(chóng)源采集自湖北省枝江市郊白菜田（30°43′N，111°82′E）。

1.1.2主要試劑Trans-T1和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）；Mini-BEST Universal RNA Extraction Kit、DL2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、Prime-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Premix Taq試劑和DNA Ligation Kit［寶生物工程（大連）有限公司］；質(zhì)粒提取試劑盒（美國(guó)Omega公司）；透析袋和Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)模緩沖液（pH 8.3，10×）、BSA封閉液、抗體稀釋液、TBST緩沖液（pH 8.0，10×）和麗春紅染色液（江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司）；pGEM-T easy vector（美國(guó)Promega公司）；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和純化樹(shù)脂Ni-NTA His·Bind Resin（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司）；重組腸激酶（上海近岸科技有限公司）。

1.1.3主要儀器Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、Mini-PROTEAN Tetra cell電泳儀、T100TM PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；UV-5100B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；F-7000熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司）。

1.2黃曲條跳甲總RNA提取及第一鏈cDNA合成

按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說(shuō)明書(shū)依次對(duì)黃曲條跳甲雌、雄成蟲(chóng)的頭、胸、腹3個(gè)部位進(jìn)行總RNA提取。RNA完整性和濃度經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)驗(yàn)證后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成第一鏈cDNA。

1.3 PstrOBP-sc基因克隆鑒定

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到的1條短鏈OBP候選基因（PstrOBP-sc）序列，利用SnapGene設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PSTROBP-SC蛋白的編碼序列（表 OBPscF和OBPscR）。PCR反應(yīng)體系20μL：cDNA模板（黃曲條跳甲雌成蟲(chóng)頭部組織cDNA）1μL、Premix Taq 10μL、正、反向引物（10μmol/L）各1μL、ddH2O補(bǔ)足至20μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃15 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收目的片段、連接T載體、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞涂板培養(yǎng)。挑取單菌落置1a7784f562a600eeb597cb5bdd50fc59于LB液體培養(yǎng)基中振蕩（37℃，200 r/min）培養(yǎng)12h，并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的菌液送至武漢華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.4 PstrOBP-sc基因生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 7.0預(yù)測(cè)PstrOBP-sc基因編碼的氨基酸序列；采用在線工具SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）預(yù)測(cè)PSTROBP-SC蛋白氨基端信號(hào)肽；采用ExPASy的ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析；采用TMHMM Server v2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）分析蛋白跨膜情況；使用在線工具PredictProtein（http：//www.predictpro-tein.org）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用MEGA 5.1中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.5 PstrOBP-sc基因在黃曲條跳甲成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)分析

以1.2中各組織cDNA為模版，分別使用表1中引物（OBPscF和OBPscR），對(duì)PstrOBP-sc基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL：cDNA模板1μL，Premix Taq 10μL，正、反向引物（10μmol/L）各0.5μL、ddH2O補(bǔ)足至20μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃30 s，56℃30 s，72℃15 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。以黃曲條跳甲Actin作為內(nèi)參基因（表 PstrActinF和PstrActinR），PCR反應(yīng)體系同上。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃15 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，以此判斷PstrOBP-sc基因在供試各組織中的表達(dá)情況。

1.6 PstrOBP-sc基因表達(dá)載體構(gòu)建及其原核表達(dá)與純化

將1.3測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的重組克隆載體以及表達(dá)載體pET-32a（+）進(jìn)行雙酶切（BamHⅠ和HindⅢ）。凝膠回收目的基因片段和表達(dá)載體的長(zhǎng)片段。參照T4連接酶說(shuō)明書(shū)連接二者的回收產(chǎn)物。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株（Trans-T1），挑選陽(yáng)性單菌落送樣測(cè)序。測(cè)序正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單菌落用于原核小量表達(dá)。小量表達(dá)的菌液以1∶100接種至LB培養(yǎng)基（含終濃度0.5μL/mLAMP）中，37℃下200 r/min培養(yǎng)，當(dāng)菌液在600 nm處的吸光度（OD600）達(dá)到0.7時(shí)，在培養(yǎng)體系中加入0.5 mmol/LIPTG，37℃下200r/min繼續(xù)誘導(dǎo)6 h。之后，離心（4℃下8000 r/min持續(xù)11 min）收集菌體。為明確表達(dá)蛋白的可溶性，收集的菌體經(jīng)裂解緩沖液處理后超聲破碎，低溫高速離心（4℃下12000 r/min持續(xù)10 min）后分別收集上清液和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。后續(xù)蛋白純化參照Ni-NTA His·Bind Resin純化樹(shù)脂說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)PSTROBP-SC蛋白的濃度；利用重組腸激酶切除His-Tag標(biāo)簽，以此獲得不含His-Tag的目的蛋白PSTROBP-SC。

1.7融合蛋白的Western bbotting檢測(cè)

純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，將分離膠、PVDF膜和濾紙板裁剪成適當(dāng)大小，并在轉(zhuǎn)膜夾負(fù)極面上按照海綿、濾紙板、凝膠、PVDF膜、濾紙板、海綿的順序由下向上組裝，在低溫條件下恒流300 mA，進(jìn)行2 h轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜完畢后，使用1×TBST Buffer對(duì)PVDF膜進(jìn)行漂洗去除膜上的轉(zhuǎn)膜緩沖液；使用麗春紅染色液染色，判斷蛋白是否轉(zhuǎn)移到膜上，檢測(cè)完畢后使用純水漂洗PVDF膜上殘留的麗春紅染色液；將PVDF膜用封閉液（BSA Blocking Buffer）在搖床上室溫封閉2 h，封閉結(jié)束后使用1×TBST Buffer洗去PVDF膜上的封閉液；用稀釋好的鼠抗6×His單克隆抗體4℃靜置過(guò)夜孵育；用1×TBST Buffer洗膜5次，加入羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h；1×TBST Buffer洗膜5次，加入ECL工作液室溫孵育1 min，在Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中檢測(cè)免疫印記。

1.8 PSTROBP-SC熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)

使用F-7000熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光結(jié)合試驗(yàn)。試驗(yàn)中設(shè)定的激發(fā)光波長(zhǎng)、發(fā)射光譜范圍和狹縫寬度參數(shù)參照Cheng等（2019）的方法。本試驗(yàn)所用的熒光探針N-苯基-1-萘胺（1-N-phenyl-naphtylamine，1-NPN）使用色譜級(jí)甲醇配置成終濃度為1 mmol/L的工作液。蛋白溶液使用常溫20mmol/LTris-HCL（pH 7.4）緩沖液稀釋至終濃度為2μmol/L。在含有2 mL稀釋蛋白溶液的四通比色皿中依次加入終濃度為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24μmol/L的1-NPN，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1 PstrOBP-sc基因克隆和序列分析結(jié)果

根據(jù)PstrOBP-sc基因克隆測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果，PstrOBP-sc基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)357bp，編碼118個(gè)氨基酸殘基，N末端具有1個(gè)由20個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，成熟蛋白僅由98個(gè)氨基酸組成，其中包含6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，屬于典型的短鏈ClsssicOBP（圖1）。成熟PSTROBP-SC分子量11.1 kD，理論等電點(diǎn)（pI）4.26，親水性總平均值（GRAVY）-0.437，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，表明PSTROBP-SC是親水性小分子量分泌蛋白，符合昆蟲(chóng)Clsssic OBP家族特征。

2.2 PSTROBP-SC系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)27個(gè)葉甲科昆蟲(chóng)Classic OBP的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示（圖2）［圖中各OBP的氨基酸序列及登錄號(hào)來(lái)自相關(guān)文獻(xiàn)（Li etal.，2015；Zhang et al.，2016；Li et al.，2017；張國(guó)輝等，2023）］，PSTROBP-SC與榆綠毛螢葉甲PaenOBP18、榆黃毛螢葉甲PmacOBP18、螢葉甲GdauOBP4和猿葉蟲(chóng)CbowOBP14聚在同一個(gè)分支上，表明其親緣關(guān)系較近。進(jìn)一步分析表明，與PSTROBP-SC聚在一起的4個(gè)OBP均是短鏈Classic OBP（97～100個(gè)氨基酸殘基），且相似性很高，為76.6%（圖3-A）；對(duì)上述5個(gè)短鏈Classic OBP的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3-B）顯示，序列中只存在5個(gè)“-螺旋，且在靠近C端的第5個(gè)“-螺旋后僅存在2個(gè)氨基酸殘基。本研究的5個(gè)短鏈Classic OBP特征與昆蟲(chóng)中長(zhǎng)鏈Classic OBP存在明顯差異。

2.3 PstrOBP-sc基因在成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)

通過(guò)半定量PCR分析PstrOBP-sc基因在黃曲條跳甲雌、雄成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，該基因在供試所有組織中均有表達(dá)，并非特異性表達(dá)在含有嗅覺(jué)器官的頭部組織。

2.4 PstrOBP-sc基因原核表達(dá)與純化

SDS-PAGE檢測(cè)融合表達(dá)載體pET-32a/PstrOBP-sc在大腸桿菌中的表達(dá)，結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有pET-32a/PstrOBP-sc的細(xì)菌細(xì)胞目的融合蛋白大量表達(dá)（圖5，泳道4），而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有空載體pET-32a的BL21菌株在相應(yīng)位置未產(chǎn)生條帶（圖5，泳道2）；為進(jìn)一步檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物是否為目的融合蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting印跡分析顯示，處于29 kD左右的蛋白條帶與6×His抗體發(fā)生免疫反應(yīng)（圖6，泳道1），與預(yù)期大小一致，說(shuō)明表達(dá)出目的融合蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)超聲破損后的菌體顯示，目的融合蛋白主要在上清液中表達(dá)，說(shuō)明表達(dá)出的蛋白溶解性很好。利用Ni-NTA His·Bind Resin純化樹(shù)脂對(duì)上清液進(jìn)行純化，獲得高純度的目的融合蛋白（圖5，泳道7）；為了避免His標(biāo)簽對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響，利用重組腸激酶切除目的融合蛋白的His標(biāo)簽，獲得不含His-Tag的目的蛋白（圖5，泳道8）。使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)得PSTROBP-SC蛋白溶液濃度為20.1μmol/L，可用于后續(xù)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。

2.5 PSTROBP-SC的熒光結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果

在PSTROBP-SC蛋白溶液中分別滴加終濃度為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24μmol/L的1-NPN，發(fā)現(xiàn)其熒光強(qiáng)度均非常微弱（圖7），表明PSTROBP-SC不能結(jié)合1-NPN于疏水結(jié)合腔內(nèi)。

3討論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)克隆獲得1條黃曲條跳甲短鏈OBP基因PstrOBP-sc。預(yù)測(cè)的成熟PSTROBP-SC蛋白僅由98個(gè)氨基酸殘基組成，其中包含6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，屬于典型的短鏈Clsssic OBP（Rihani et al.，2021）。當(dāng)前對(duì)OBP的研究主要集中在Classic OBP家族中的中長(zhǎng)鏈OBP，中長(zhǎng)鏈OBP的一級(jí)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度通常在120～160個(gè)氨基酸殘基（Rana et al.，2024）。其高級(jí)結(jié)構(gòu)中通常存在6個(gè)“-螺旋，這些“-螺旋經(jīng)過(guò)折疊在空間上形成1個(gè)疏水的氣味配體結(jié)合腔（Sandler et al.，2000）。然而，PSTROBP-SC二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PSTROBP-SC僅存在5個(gè)“-螺旋。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組成上的差異勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致PSTROBP-SC與中長(zhǎng)鏈OBP在三級(jí)結(jié)構(gòu)上的差異，進(jìn)而表現(xiàn)為功能上的差異。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在PSTROBP-SC第5個(gè)“-螺旋的下游僅剩2個(gè)氨基酸殘基組成C末端，與中長(zhǎng)鏈OBP的C末端明顯不同，中長(zhǎng)鏈OBP通常具有較長(zhǎng)的C末端（Lautenschlager et al.，2005；Wogulis et al.，2006；Leite et al.，2009；Mao et al.，2010）。OBP的C末端長(zhǎng)度與OBP氣味配體結(jié)合和釋放過(guò)程密切相關(guān)。如家蠶BmorPBP1屬于長(zhǎng)鏈OBP，具有長(zhǎng)C末端，pH為4.5時(shí)，C末端盤(pán)旋折疊成1個(gè)α-螺旋占據(jù)結(jié)合腔，擠出存在于結(jié)合腔中的配體；當(dāng)pH為7.0時(shí)，C末端形成的α-螺旋解旋并離開(kāi)結(jié)合腔，此時(shí)配體可進(jìn)入（Lautenschlager et al.，2005）。對(duì)于中鏈OBP來(lái)說(shuō)，其C末端雖然沒(méi)有長(zhǎng)鏈OBP長(zhǎng)，但仍在OBP配體結(jié)合和釋放過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如屬于中鏈OBP的岡比亞按蚊（Culex quinquefasciatus）AgamOBP1、埃及伊蚊（Aedes aegypti）AaegOBP1和致倦庫(kù)蚊（Culex quinquefas-ciatus）CquiOBP1的C末端如同蓋子，一旦配體結(jié)合于結(jié)合腔，C末端上的氨基酸殘基通過(guò)pH敏感的分子內(nèi)氫鍵將配體關(guān)在結(jié)合腔內(nèi)。當(dāng)環(huán)境變?yōu)樗嵝詴r(shí)，氫鍵斷裂導(dǎo)致蓋子開(kāi)啟配體被釋放（Wogulisetal.，2006；Leite et al.，2009；Mao et al.，2010）。然而，黃曲條跳甲PSTROBP-SC二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PSTROBP-SC在第5個(gè)α-螺旋后幾乎沒(méi)有C末端，僅有2個(gè)氨基酸殘基組成1個(gè)非常短的C末端。由此推測(cè)，PSTROBP-SC配體結(jié)合與釋放的機(jī)制與中長(zhǎng)鏈OBP截然不同。由上述可知，短鏈PSTROBP-SC與中長(zhǎng)鏈OBP的分子特征存在明顯差異，這勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致二者間的功能差異。但這種短鏈OBP的具體結(jié)構(gòu)信息仍有必要通過(guò)其晶體結(jié)構(gòu)解析給出更具說(shuō)服力的證據(jù)。

為分析PstrOBP-sc基因功能，本研究對(duì)PstrOBP-sc的組織表達(dá)模式進(jìn)行了研究。組織表達(dá)模式顯示PstrOBP-sc在黃曲條跳甲成蟲(chóng)的所有供試組織中均有表達(dá)，而非特異性表達(dá)于嗅覺(jué)器官集中的頭部組織。那些在昆蟲(chóng)主要嗅覺(jué)器官觸角中特異性或顯著上調(diào)表達(dá)的OBP通?？山Y(jié)合、識(shí)別氣味信息化合物調(diào)控昆蟲(chóng)嗅覺(jué)行為（Cheng et al.，2019；Lun et al.，2023；Yuan et al.，2024）。PstrOBP-sc在不同組織的廣譜性表達(dá)暗示該基因在黃曲條跳甲體內(nèi)很可能行使嗅覺(jué)以外的其他生理功能。為進(jìn)一步驗(yàn)證PSTROBP-SC蛋白是否具備結(jié)合配體的能力，本研究利用熒光結(jié)合試驗(yàn)測(cè)試了細(xì)菌表達(dá)的PSTROBP-SC的配體結(jié)合能力，結(jié)果顯示，PSTROBP-SC不能結(jié)合熒光探針1-NPN。1-NPN是目前研究OBP配體結(jié)合能力的通用探針，廣泛應(yīng)用于各種OBP功能研究（張玉等，2019）。本研究結(jié)果從側(cè)面反映出短鏈PSTROBP-SC結(jié)合腔與當(dāng)前廣泛研究的中長(zhǎng)鏈OBP的結(jié)合腔差異很大，進(jìn)一步證明PSTROBP-SC很可能行使嗅覺(jué)以外的其他生理功能。事實(shí)上，隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)OBP并非總是結(jié)合配體化合物在昆蟲(chóng)化學(xué)感受過(guò)程中行使功能，而是還有很多其他生理功能。以目前研究比較深入的果蠅OBP為例，果蠅的OBP28a在造血和傷口愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Benoit et al.，2017）；OBP59a在果蠅成蟲(chóng)濕度感受過(guò)程中扮演重要角色（Sun et al.，2018）；OBP56g對(duì)于果蠅雄成蟲(chóng)交配突（Mating plug）的形成及其生育能力保持至關(guān)重要（Brown et al.，2023）。因此，PSTROBP-SC完全有可能在黃曲條跳甲體內(nèi)行使嗅覺(jué)以外的其他生理功能，PSTROBP-SC的具體生理功能有待探究。

4結(jié)論

PstrOBP-sc基因的分子和功能特點(diǎn)不同于當(dāng)前廣泛研究的中長(zhǎng)鏈OBP基因，其在生物體內(nèi)很可能行使嗅覺(jué)以外的其他生理功能。

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（責(zé)任編輯麻小燕）