基于全基因組關(guān)聯(lián)分析的香蕉枯萎病菌致病基因挖掘與功能研究

摘要：【目的】深入挖掘香蕉枯萎病菌致病相關(guān)基因，并解析其基因特性，為香蕉抗枯萎病品種選育及新藥物靶標(biāo)的開發(fā)打下基礎(chǔ)?！痉椒ā炕谶z傳背景將供試299株香蕉枯萎病菌的致病力分別依據(jù)數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀進(jìn)行分組，使用混合線性模型的Gemma軟件，運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）技術(shù)對香蕉枯萎病菌致病力表型與全基因組重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；進(jìn)一步采用ProtParam、SingleIP和SAMRT等生物信息學(xué)軟件解析候選基因的理化性質(zhì)及初級結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】運(yùn)用GWAS共關(guān)聯(lián)到151個與致病力相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。初步確定3個不同類型基因FocScp、FocChp和FocGhf12與枯萎病菌致病力密切相關(guān)，進(jìn)一步對FocScp、FocChp和FocGhf12基因的編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析并預(yù)測其功能，結(jié)果顯示，F(xiàn)ocScp基因的cDNA編碼區(qū)全長948 bp，編碼314個氨基酸殘基，大小約33.27 kD，含有N-端信號肽，預(yù)測為胞外分泌蛋白；FocChp基因的cDNA編碼區(qū)全長1302 bp，編碼433個氨基酸殘基，大小約49.17 kD，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核，預(yù)測為含有3個鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子；FocGf12基因的cDNA編碼區(qū)全長1533 bp，編碼480個氨基酸殘基，大小約53.54 kD，該蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)域，具有GPI修飾位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位在胞外，預(yù)測為糖苷水解酶家族12蛋白?！窘Y(jié)論】通過GWAS獲得香蕉枯萎病菌3個致病相關(guān)基因FocScp、FocChp和FocGhf1 其編碼蛋白分別為分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)蛋白。

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎病菌；致病相關(guān)基因；全基因組關(guān)聯(lián)分析；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S436.681文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）08-2442-12

Mining and functional study of pathogenic genes ofFusariumoxysporumf.sp.cubense based on genome-wideassociation analysis

GAO Hui JIANG Shang-bo YANG Di DU Chan-juan ZHANG Jin PAN Lian-fu CUI Hai-tao 3*，F(xiàn)U Gang1*

（1Plant Protection Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Green Preventionand Control on Fruits and Vegetables in South China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangxi Key Laboratoryfor Biology of Crop Diseases and Insect Pests，Nanning，GuanZegeB43CpEPO8hsfJeqzd3GZrslJxcw2n9xb8lT+sE4=gxi 530007，China；2College of Agriculture，F(xiàn)ujianAgriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 35300 China；3School of Plant Protection，ShandongAgricultural University，Tai’an，Shandong 272018，China）

Abstract：【Objective】In-depth exploration of the pathogenicity related genes in Fusarium oxysporumf.sp.cubense，and analysis of their genetic characteristics were conducted to laid foundation for the breeding of banana varieties resistant tofusarium wilt，as well as the development of new drug targets.【Method】Based on the genetic backgrounds，the patho-genicity of 299 tested strains ofF.oxysporumf.sp.cubense was grouped accrording to quantity traits and quality traits.Using the Gemma software，which employed a mixed linear model，a genome-wide association study（GWAS）was carried out to perform an association analysis between the pathogenic phenotype ofF.oxysporumf.sp.cubense and the genome-wide resequencing data.Additionally，ProtParam，SingleIP and SAMRT online software tools were utilized to analyze the physicochemical properties and primary structure of candidate genes.【Result】Using GWAS，a total of 151 pathogenicity related single nucleotide polymorphism（SNP）loci were associated.It was preliminarily determined that 3 different types of genes FocScp，F(xiàn)ocChp and FocGhf12 were closely related to the pathogenicity ofF.oxysporumf.sp.cubense.Further bioinformatics analysis was performed on the encoded proteins ofFocScp，F(xiàn)ocChp and FocGhf12 genes and their func-tions were predicted.The results revealed that the full-length cDNA coding region ofFocScp gene was 948 bp，and en-coded 314 amino acid residues with size of about 33.27 kD and contained an N-terminal signal peptide，which was predicted to be an extracellular secretory protein.The full-length cDNA coding region of FocChp gene was 1302 bp，en-coding 433 amino acid residues with size of about 49.17 kD，with subcellular localization in the nucleus，and was pre-dicted to be a transcription factor containing 3 zinc finger domains.The full-length cDNA coding region of FocGhf12 gene was 1533 bp，encoding 480 amino acid residues with size of about 53.54 kD.The protein had transmembrane domain，GPI modification sites，and subcellular localization outside the cell.It was predicted to be a glycoside hydrolase family 12 protein.【Conclusion】Three pathogenicity related genes（FocScp，F(xiàn)ocChp and FocGhf12）ofF.oxysporumf.sp.cubense are obtained by GWAS，and their encodesd proteins are secretory protein，transcription factor and structural protein.

Key words：Fusariumoxysporumf.sp.cubense；pathogenicity related genes；genome-wide association study（GWAS）；bioinformatics analysis

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31960520）；Central Guidance for Local Science and Technology Development Fund（Guike ZY21195015）；Science and Technology Development Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（2020ZX10，2024YP013）

0引言

【研究意義】由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporumf.sp.cubense，F(xiàn)oc）引起的香蕉枯萎病是香蕉生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的一種土傳病害（Ploetz，2006a；Pegg etal.，2019；Yang et al.，2023）。該病最早于1874年在澳大利亞出現(xiàn)（Swarupa et al.，2014；Siamak and Zhang，2018），1967年在我國臺灣首次發(fā)現(xiàn)，并鑒定出致病菌新的生理小種4號小種（Focrace 4，F(xiàn)oc4），使香蕉產(chǎn)業(yè)再次面臨嚴(yán)重威脅（Hwang and Ko，2004；Ploetz，2005，2006b）。20世紀(jì)90年代，依據(jù)遺傳背景和致病條件的差異，4號生理小種又進(jìn)一步區(qū)分為熱帶4號小種（FocTR4）和亞熱帶4號小種（FocSTR4）（Zhu et al.，2023）。截至目前，F(xiàn)oc共鑒定出4個生理小種：1號生理小種（Foc1）、2號生理小種（Foc2）、3號生理小種（Foc3）和4號生理小種（Foc4），其中，對香蕉產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害的為Foc1和Foc4。目前，香蕉枯萎病已遍布全球主要香蕉產(chǎn)區(qū)，成為制約香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素（李華平等，2019）。當(dāng)前對香蕉枯萎病病原菌致病機(jī)制的研究相對滯后，已報(bào)道的致病基因多數(shù)源自鐮刀菌其他專化型的同源基因。對新致病基因的挖掘，可為香蕉枯萎病防治藥物的研發(fā)提供新靶標(biāo)，也有助于進(jìn)一步闡明香蕉枯萎病病原菌的致病機(jī)制。【前人研究進(jìn)展】近年來，隨著高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量物種的基因組已被測序和注釋。香蕉枯萎病菌的全基因組測序最早于2014年完成，Guo等（2014）采用第二代測序（NGS）技術(shù)完成了1株Foc1菌株（N2）和2株Foc4菌株（B2和II5）的基因組組裝。隨后，Yun等（2019）使用單分子實(shí)時(shí)測序（SMRT）完成了Foc1菌株和FocTR4菌株更為完整的基因組組裝。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）在動植物功能基因挖掘中具有巨大優(yōu)勢，其通過以大量的單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為分子遺傳標(biāo)記，對許多自然個體組成的大群體進(jìn)行基因組水平上的相關(guān)分析，從而確定表型性狀和遺傳位點(diǎn)的相關(guān)性（Mohammadi et al.，2020；王艷茹，2022）。張?。?013）對30份香蕉群體的抗1號和4號枯萎病性狀與SSR分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)，共計(jì)關(guān)聯(lián)到358個變異位點(diǎn)，其中有21個位點(diǎn)與性狀相關(guān)。Kawicha等（2023）對340份尖孢鐮刀菌番茄?；颓秩痉训闹虏×Ρ硇瓦M(jìn)行評價(jià)，并通過對基因型過濾最終篩選到4478個SNP，隨后運(yùn)用混合線性模型，結(jié)合病情嚴(yán)重程度指數(shù)（DSI）與SNP進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共計(jì)關(guān)聯(lián)到24個與DSI相關(guān)的SNP位點(diǎn)。使用Blast N（https：//solgenomics.net/tools/blast/）在番茄基因組染色體中搜索基因功能，鑒定到與Fol侵染應(yīng)答相關(guān)的候選基因，包括溶質(zhì)載體35家族蛋白、鋅指蛋白、肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶樣蛋白、富含亮氨酸的重復(fù)樣蛋白、WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白和bZIP型轉(zhuǎn)錄因子等。但該方法在真菌中的應(yīng)用起步較晚，Skelly等（2013）首次將表型數(shù)據(jù)整合到釀酒酵母全基因組關(guān)聯(lián)分析研究中，測量了22個遺傳多樣性菌株中的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、代謝物和形態(tài)特征，結(jié)合酵母菌株的重測序數(shù)據(jù)展開遺傳標(biāo)記與性狀間的關(guān)聯(lián)分析，最終關(guān)聯(lián)到與轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)豐度顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)分別有302和64個。Talas等（2016）對220株禾谷鐮刀菌分離株進(jìn)行了與限制性位點(diǎn)相關(guān)的DNA測序（RAD-seq），質(zhì)控后約獲得29000個單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，結(jié)合菌株侵染性、DON毒素產(chǎn)生及丙環(huán)唑敏感性等表型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共計(jì)關(guān)聯(lián)到與侵染性、DON毒素產(chǎn)生及丙環(huán)唑敏感性顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)分別有50、29和74個。【本研究切入點(diǎn)】因Foc遺傳背景復(fù)雜，其致病機(jī)制仍未明晰，生產(chǎn)上也缺乏針對香蕉枯萎病的有效防治藥劑及理想抗病品種。致病相關(guān)基因的挖掘和病原菌致病機(jī)制的解析是推動香蕉枯萎病防控研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。【擬解決的關(guān)鍵問題】使用混合線性模型，運(yùn)用Gemma軟件，結(jié)合主成分分析和親緣關(guān)系矩陣，對香蕉枯萎病菌進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，挖掘致病相關(guān)基因，通過生物信息學(xué)方法分析其理化性質(zhì)和初級結(jié)構(gòu)，旨在進(jìn)一步闡明香蕉枯萎病病原菌的致病機(jī)制，為香蕉抗枯萎病品種選育及新藥物靶標(biāo)的開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試香蕉枯萎病菌菌株299株，分別采集自廣東、廣西、云南、海南、福建等我國香蕉主產(chǎn)區(qū)及緬甸、尼泊爾、越南等香蕉產(chǎn)區(qū)（表1），其中1號生理小種和4號生理小種分別有183、116株，均保存于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

1.2香蕉枯萎病菌致病力表型測定及性狀分組

香蕉枯萎病菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，用無菌水沖洗菌落獲得分生孢子，將孢子懸浮液調(diào)整濃度至1×106 CFU/mL。使用4～5葉期的香蕉和粉蕉，采用水培法接種，每株苗接種200 mL孢子懸浮液（1×105 CFU/mL），以接種無菌水為對照，每株菌株設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)3株苗。接種2周后進(jìn)行調(diào)查，記錄發(fā)病等級并計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高一級代表值）×100。病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，球莖呈白色，無褐變；1級，球莖褐變面積≤25%；3級，26%<球莖褐變面積≤50%；5級，51%<球莖褐變面積≤75%；7級，球莖褐變面積>76%。

由于香蕉枯萎病菌具有豐富的遺傳多樣性，為降低表型數(shù)據(jù)混雜造成的假陽性，按照生理小種進(jìn)行分組處理：針對生理小種首先使用總?cè)后w進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)而以Foc1、Foc4、TR4和SR4等群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。首先使用數(shù)量性狀方式進(jìn)行表型性狀關(guān)聯(lián)，然后使用質(zhì)量性狀方式進(jìn)行關(guān)聯(lián)，因其無法使用具體數(shù)值衡量，故將Foc1的菌株賦值為0、Foc4的菌株賦值為1進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。分級性狀分布類似質(zhì)量性狀，但實(shí)際受多基因控制，故需要具體數(shù)值進(jìn)行分組。因此，根據(jù)致病力（病情指數(shù)）大小進(jìn)行分級處理后進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1.3香蕉枯萎病菌基因型數(shù)據(jù)質(zhì)控

利用VCFtools（Danecek et al.，2011）將299份Foc樣本基因組重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因型質(zhì)量控制，保留最小質(zhì)量大于50且覆蓋深度在3～20的SNP，剔除最小等位基因小于5%且缺失率大于20%的SNP，保留含有2個ALT變異的位點(diǎn)。

1.4致病力表型與全基因組關(guān)聯(lián)分析

使用Plink（Purcell et al.，2007）將基因型文件轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制格式；利用GCTA（Zhou and Stephens，2012）計(jì)算親緣關(guān)系矩陣（G矩陣），用以校正遺傳背景，減少假陽性（VanRaden，2008）。同時(shí)，使用主成分分析（PCA）作為關(guān)聯(lián)分析的協(xié)變量；使用Gemma的混合線性模型［Mixed-linear model，MLM，Y=Wα+Xβ+υ+e模型（即表型=平均數(shù)+基因型效應(yīng)+群體結(jié)構(gòu)+環(huán)境）］進(jìn)行本次全基因組關(guān)聯(lián)分析（馬雅杰等，2023）；Bonferroni作為全基因組關(guān)聯(lián)分析中簡單有效的校正方法，可通過對P值的閾值進(jìn)行校正來實(shí)現(xiàn)消除假陽性結(jié)果。根據(jù)Bonferroni校正P=1/309747=3.22E-06［即-log10（P）=5.49］，以此作為顯著性閾值進(jìn)行篩選（李博等，2013；馬雅杰等，2023）。利用R包的CM plot進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的可視化，繪制曼哈頓圖及QQ-plot圖。

1.5致病相關(guān)候選基因功能注釋

使用TBtools獲得候選基因核苷酸和氨基酸序列，運(yùn)用eggNOG-mapper（http：//eggnog-mapper.embl.de/）進(jìn)行基因功能注釋，通過生物信息平臺（https：//www.omicstudio.cn/home）制作GO功能注釋分析及可視化結(jié)果。使用KOBAS v3.0（http：//bioinfo.org/kobas）進(jìn)行KEGG信號通路富集分析及可視化結(jié)果。

1.6關(guān)鍵致病基因篩選與功能預(yù)測

使用TBtools通過比對Foc4基因組數(shù)據(jù)獲得顯著位點(diǎn)的核苷酸和氨基酸序列，利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，初步確定蛋白功能信息；利用NCBI-BLAST在線軟件進(jìn)行同源性分析，結(jié)合二者結(jié)果進(jìn)行文獻(xiàn)檢索。

使用ProtParam（https：//www.expasy.org/resources/protparam）初步分析基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）和NetPhos（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）分別預(yù)測蛋白親疏水性和磷酸化位點(diǎn)；使用SingleIP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/ser-vices/SignalP-5.0/#main-content）預(yù)測編碼蛋白是否存在信號肽位點(diǎn)；使用DTU/DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預(yù)測基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用Euk-mPLoc 2.0 server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/#）預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位；利用big-PI-predictor（https：//mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html）預(yù)測蛋白GIP修飾位點(diǎn)；利用SAMRT（https：//smart.embl.de/）和CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域。

1.7總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol法提取香蕉枯萎病菌4號生理小種Foc1594菌株的總RNA。稱取0.5 g菌絲，用液氮磨成粉末，加入1 mL TRIzol試劑，充分混勻，室溫放置5 min；加入200μL氯仿，劇烈震動15 s后室溫放置3 min；4℃下12000 r/min離心15 min；取上清400μL至1.5 mL RNA-Free離心管，加入等體積異丙醇顛倒混勻，室溫靜置2～5 min；4℃下12000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇顛倒混勻；4℃下7500 r/min離心5 min后，棄上清，開蓋放入烘箱中烘10min；加入30～50μL DEPC水溶解，閉蓋放入65℃烘箱中烘10min。將經(jīng)檢測完整的RNA參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（魏巍等，2012）。

1.8關(guān)鍵致病基因的PCR擴(kuò)增

通過比對參考基因組獲得3個基因的相關(guān)信息，分別設(shè)計(jì)FocScp、FocChp和FocGhf12基因引物Scp-F（5'-ATGCGTTCTCTTCCCATTGCA-3'）和Scp-R（5'-CTAAGGACCACCAGCGCG-3'）、Chp-F（5'-ATG AGCGCGTCAGGCTCG-3'）和Chp-R（5'-CTAGAAC CCAATGAATGCATTCTT-3'）、Ghf12-F（5'-ATGGGT AACGCTTCATCGAAAGAT-3'）和Ghf12-R（5'-TCA AGAAAGAACCACGCTTATGAC-3'）對4號生理小種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50μL：TaKaRa Mix 25μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性5 min；98℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

2結(jié)果與分析

2.1香蕉枯萎病菌致病力表型及分布

本研究關(guān)聯(lián)使用的299株菌株包含1號生理小種183株、4號生理小種116株，所有菌株均采用水培法完成致病力表型測定（圖1）。其中，侵染香蕉苗測得致病力分布情況為0～10占群體的33.4%，10～20占18.7%，20～30占9.4%，30～40占8.4%，40～50占7.4%，50～60占6.4%，60～70占3.7%，70～80占5.0%，80～90占4.0%，90～100占3.6%；侵染粉蕉苗測得致病力分布情況為0～10占群體的4.3%，10～20占7.7%，20～30占5.4%，30～40占5.4%，40～50占10.0%，50～60占8.4%，60～70占12.4%，70～80占11.0%，80～90占15.4%，90～100占20.0%。

考慮到小種間的差異，分別使用Foc1和Foc4的致病力以數(shù)量性狀方式作為表型數(shù)據(jù)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（表2）和直方圖（圖2），F(xiàn)oc1侵染香蕉致病力的平均數(shù)為16.746，峰度和偏度分別為6.656、2.556，且平均數(shù)大于中位數(shù)，分布為右偏（正偏態(tài)），而侵染粉蕉致病力的平均數(shù)為72.35 峰度和偏度分別為0.304、-1.030，且平均數(shù)小于中位數(shù)，分布左偏（負(fù)偏態(tài)）；Foc4侵染香蕉致病力平均數(shù)為49.766，且平均數(shù)約等于中位數(shù)，數(shù)值相對集中，峰度和偏度分別為-0.555、0.047；侵染粉蕉致病力平均數(shù)為45.866，與中位數(shù)接近，峰度和偏度分別為-0.909、0.095。

2.2全基因組關(guān)聯(lián)分析定位致病相關(guān)位點(diǎn)

基于篩選獲得的309747個高密度SNP和299份香蕉枯萎病菌致病力表型，綜合考慮群體結(jié)構(gòu)，利用Gemma軟件中混合線性模型結(jié)合不同分組方式的致病力進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共關(guān)聯(lián)到151個與致病力相關(guān)的SNP位點(diǎn)。其中以Foc4群體作為質(zhì)量性狀，共關(guān)聯(lián)到123個相關(guān)SNP位點(diǎn)（圖3-A）；以Foc4作為數(shù)量性狀，在2號染色體上關(guān)聯(lián)到3個相關(guān)SNP位點(diǎn)（圖3-B）?？赡苁鼙硇蛿?shù)據(jù)的影響，將生理小種分組后以Foc1群體數(shù)量性狀關(guān)聯(lián)未篩選到相關(guān)位點(diǎn)；以質(zhì)量性狀關(guān)聯(lián)篩選到幾處，但不符合影響表型性狀的連鎖不平衡狀態(tài)（圖3-C）。根據(jù)致病力大小進(jìn)行分級處理后，僅在以香蕉為寄主的菌株致病力80～100群體中分別在9號及11號染色體中關(guān)聯(lián)到17和8個相關(guān)SNP位點(diǎn)（圖3-D）。

2.3候選基因功能注釋

利用eggNOG-mapper對候選基因進(jìn)行GO功能注釋分析（圖4-A），在GO數(shù)據(jù)庫中根據(jù)功能分為生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF），在生物過程富集到25個二級分類，主要在有機(jī)物與離子的運(yùn)輸、有機(jī)物的代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)及輔助定位等方面發(fā)揮功能；在細(xì)胞組成富集到15個二級分類，主要在細(xì)胞器及質(zhì)膜等部位發(fā)揮作用；在分子功能富集到10個二級分類，具有一些跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、有機(jī)化合物結(jié)合及ATP酶活性相關(guān)功能。

使用KOBAS v3.0對候選基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析（圖4-B），發(fā)現(xiàn)候選基因主要富集在新陳代謝（Metabolism）、環(huán)境信息處理（Environmental information processing）、遺傳信息處理（Genetic in-formation processing）和生物體系統(tǒng)（Organismal sys-tems），其中參與代謝途徑的基因共有26個，占比68.42%，主要包括代謝途徑、脂肪酸生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解；參與環(huán)境信息處理的基因有4個，占比10.52%，其中包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和AMPK信號通路；參與遺傳信息處理的基因有5個，占比13.16%，主要包括抗葉酸抗性通路、谷胱甘肽代謝和碳代謝；參與生物體系統(tǒng)的基因有3個，占比7.89%，主要包括膽汁分泌通路和胰島素信號通路。

2.4關(guān)鍵致病基因功能解析

通過檢索Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫，查詢候選基因的遺傳背景，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析關(guān)聯(lián)的P值和候選基因的注釋結(jié)果，篩選出3個與致病力密切相關(guān)的基因，其編碼蛋白分別為FocScp、FocChp和Foc-Ghf12。

FocScp基因全長1134 bp，cDNA編碼區(qū)全長948 bp，編碼314個氨基酸殘基，大小約33.27 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.5 半胱氨酸含量3.8%。預(yù)測Foc-Scp編碼蛋白在N端第1～17位氨基酸位點(diǎn)存在信號肽片段，亞細(xì)胞定位在胞外，無跨膜結(jié)構(gòu)域和GPI修飾位點(diǎn)，存在多個磷酸化位點(diǎn)，具有親水性，預(yù)測為分泌蛋白（圖5）。

FocChp基因全長2848 bp，cDNA編碼區(qū)全長1302 bp，編碼433個氨基酸殘基，大小約49.17 kD，理論等電點(diǎn)（PI）5.78，半胱氨酸含量2.5%。FocChp蛋白不存在N-端信號肽、GPI修飾位點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核，存在多個磷酸化位點(diǎn)，具有親水性，預(yù)測為含有3個鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子（圖6）。

FocGhf12基因全長2351 bp，cDNA編碼區(qū)全長1533 bp，編碼480個氨基酸殘基，大小約53.54 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.78，其中半胱氨酸含量2.5%。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測FocGhf12蛋白結(jié)果顯示存在可能性達(dá)到0.8，不存在N-端信號肽，亞細(xì)胞定位在胞外，在466與467兩個位點(diǎn)存在GPI修飾位點(diǎn)，存在多個磷酸化位點(diǎn)，為親水蛋白，預(yù)測為糖苷水解酶家族12蛋白（圖7）。

2.5關(guān)鍵致病基因克隆驗(yàn)證

提取香蕉枯萎病菌4號生理小種Foc1594菌株的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，分別使用Scp-F/R、Chp-F/R和Ghf12-F/R 3對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別可以擴(kuò)增到945、1302和1509 bp大小的條帶，經(jīng)過測序比對，與預(yù)測片段大小一致（圖8）。

3討論

隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，更為全面、深刻和精細(xì)地解析復(fù)雜性狀形成的分子機(jī)制，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等數(shù)據(jù)進(jìn)行多組學(xué)整合分析也逐漸成為一種趨勢（王博和孫廣宇，2016；陳元軍等，2023）。本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)對299株來自我國廣東、廣西、云南、海南、福建等香蕉主產(chǎn)區(qū)及緬甸、尼泊爾、越南等地的枯萎病菌致病表型性狀與全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確定了與枯萎病菌致病力密切相關(guān)的3個不同類型基因。前人運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)主要是針對植物挖掘抗病基因，而針對病原菌全基因組關(guān)聯(lián)分析的報(bào)道較少。Dalman等（2013）首次把全基因組關(guān)聯(lián)分析應(yīng)用到植物病原真菌中，分析了一種壞死性病原體Heterobasidionannosum對其寄主歐洲云杉（Picea abies）和歐洲赤松（Pinus sylvestris）的毒力；對23個單倍體H.annosum分離株的基因組進(jìn)行了測序，以菌株對寄主的毒力為表型，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析關(guān)聯(lián)到12個與毒力相關(guān)的SNP位點(diǎn)。

全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)通過在整個基因組范圍內(nèi)對SNPs的掃描標(biāo)記，來定位與特定生物學(xué)性狀相關(guān)的遺傳變異。目前在真菌中開展的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究多使用單性狀和SNP的關(guān)聯(lián)分析，但很多性狀同時(shí)受多基因控制，倘若單個個體有多個測量性狀時(shí)，性狀間也可能存在關(guān)聯(lián)，這些因素往往被忽視，為降低誤差，應(yīng)在關(guān)聯(lián)時(shí)將該因素考慮在內(nèi)，從而提高檢測效率。無論是多性狀還是單性狀關(guān)聯(lián)，基因型數(shù)據(jù)與表型數(shù)據(jù)是直接影響全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的2個關(guān)鍵數(shù)據(jù)。精確的表型檢測是關(guān)聯(lián)分析的關(guān)鍵之一，表型數(shù)據(jù)需根據(jù)群體物種生物學(xué)特性和遺傳特性嘗試不同分組，權(quán)衡更適宜的方案。對于表型數(shù)據(jù)，一般采用數(shù)量性狀、質(zhì)量性狀和分組性狀的處理方式。數(shù)量性狀在自然界中是一個重要特征（Mareesetal.，2018；曹磊等，2023），具有數(shù)據(jù)分布連續(xù)、受環(huán)境影響大等特點(diǎn)。但與致病性相關(guān)的數(shù)量性狀在真菌生物學(xué)中很少受到關(guān)注（Pariaud et al.，2009；Lannou，2012），數(shù)量性狀受多基因控制，需測量到具體數(shù)值，而關(guān)聯(lián)分析屬于線性模型，數(shù)據(jù)必須符合正態(tài)分布，需去除極端異常值，防止由于異常值的存在導(dǎo)致假陽性關(guān)聯(lián)偏高。質(zhì)量性狀受單基因控制，無法使用具體數(shù)值衡量，因此每個群體選取近似的樣本即可。分級性狀作為一種處理方式，其表型分布與質(zhì)量性狀類似，但實(shí)際上受多基因控制。本研究對3種性狀的表型處理均有嘗試。首先使用具體的香蕉或粉蕉致病力數(shù)值進(jìn)行關(guān)聯(lián)，但表型數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故未關(guān)聯(lián)到理想結(jié)果，繼而根據(jù)菌株遺傳特性剔除離群數(shù)據(jù)，但效果也不理想，最終以Foc4為群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)，在2號染色體上關(guān)聯(lián)到3個顯著SNP位點(diǎn)；隨后嘗試質(zhì)量性狀，根據(jù)生理小種進(jìn)行賦值，其中以Foc4作為質(zhì)量性狀，共關(guān)聯(lián)到123個相關(guān)SNP位點(diǎn)；最后使用分級性狀，根據(jù)不同致病力劃分等級，但只在香蕉為寄主的菌株致病力分級線設(shè)置為80時(shí)，以此群體數(shù)據(jù)分別在9號及11號染色體中關(guān)聯(lián)到17和8個相關(guān)SNP位點(diǎn)。據(jù)此共計(jì)關(guān)聯(lián)到151個與Foc致病相關(guān)的SNP位點(diǎn)。對于該群體規(guī)模，僅關(guān)聯(lián)到151個SNP位點(diǎn)，結(jié)果少于預(yù)期，但為香蕉枯萎病菌在基因組層面的分析打下了基礎(chǔ)。后續(xù)將對該群體的表型進(jìn)行深入探究，結(jié)合其他表型數(shù)據(jù)重新進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

本研究根據(jù)關(guān)聯(lián)到的SNP位點(diǎn)，檢索到香蕉枯萎病菌的大量致病相關(guān)候選基因；并通過比對Uni-prot蛋白數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)這些基因所編碼的蛋白包括鋅蔟家族蛋白、CFEM（Common in fungal extracellu-lar membrane）結(jié)構(gòu)域蛋白、含有P環(huán)的核苷三磷酸水解酶超家族蛋白、富含半胱氨酸的小分泌蛋白、C2H2型轉(zhuǎn)錄因子及糖苷水解酶12家族蛋白等。其中有些蛋白在植物病原真菌中已有報(bào)道，如Zhang等（2023）在假禾谷鐮刀菌中也鑒定到鋅蔟家族轉(zhuǎn)錄因子FpUme18，靶向敲除后發(fā)現(xiàn)?Fpume18缺失突變體在生長、分生孢子產(chǎn)生和分生孢子萌發(fā)方面存在缺陷，同時(shí)降低了小麥胚芽鞘的致病性。此外，F(xiàn)pUme18也通過調(diào)節(jié)TRI基因表達(dá)參與DON毒素的產(chǎn)生，表明FpUme18參與調(diào)控假禾谷鐮刀菌的毒力。CFEM是真菌中特有的一類位于細(xì)胞外膜的蛋白，許多CFEM結(jié)構(gòu)蛋白被證明在病原真菌與寄主植物互作中起效應(yīng)因子的作用（Kulkarni et al.，2003；Zhang et al.，2015）。Huang等（2023）從甘蔗鐮刀菌基因組中鑒定到20個CFEM蛋白，其中4個FsC-FEM蛋白（Fs06761、Fs08184、Fs10706和Fs13617）能抑制煙草上Bax（BCL2-associated X protein）所誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡；使用YTK12酵母系統(tǒng)驗(yàn)證其為分泌蛋白，靶向敲除后，F(xiàn)s06761、Fs08184和Fs13617缺失造成甘蔗鐮刀菌致病力降低，表明3個基因是病原菌的重要致病因子。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)Scp同源蛋白在尖孢鐮刀菌和亞洲大豆銹病中曾有報(bào)道。Li等（2019）在分泌組中發(fā)現(xiàn)Cerato-platanin（CP）蛋白家族的一個成員FocCP 該蛋白可以被植物的病原體相關(guān)分子模式（PAMP）所識別，并引起一系列免疫反應(yīng)，此外還能增強(qiáng)煙草對煙草花葉病毒及香蕉對Foc4的抗性。Chp在番茄枯絲核菌和梨樹腐爛病菌曾有報(bào)道，Ghosh等（2021）通過HIGS介導(dǎo)的基因沉默將轉(zhuǎn)錄組中一些上調(diào)基因沉默后發(fā)現(xiàn)，RS_CRZ1（C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子）沉默植株不僅表現(xiàn)出疾病癥狀的顯著減少，而且病原體的定殖也受到損害。Ghf12在棉花枯萎病及番茄枯萎病中曾有報(bào)道，Zhang等（2021）發(fā)現(xiàn)一種由尖孢鐮刀菌分泌的糖苷水解酶家族12蛋白FoEG 并證明該蛋白可觸發(fā)不同植物的細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)，當(dāng)FoEG1缺失或酶活性喪失時(shí)會降低尖孢鐮刀菌的毒力。可以看出，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)挖掘植物病原菌致病基因是較為可靠并高效的方法。

4結(jié)論

本研究以299份香蕉枯萎病菌作為關(guān)聯(lián)群體，結(jié)合309747個高密度SNP，針對Foc對香蕉和粉蕉致病力性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共關(guān)聯(lián)到151個與致病力相關(guān)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)基因功能注釋及功能預(yù)測，確定了3個與枯萎病菌致病力密切相關(guān)的不同類型基因FocScp、FocChp和FocGhf1 其編碼蛋白分別為分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)蛋白。

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（責(zé)任編輯麻小燕）