基于ARMS-PCR技術(shù)檢測SLC39A13基因核苷酸多態(tài)性方法的建立

摘 要：為了實現(xiàn)核苷酸多態(tài)性（SNP）的精準分型，針對SLC39A13基因rs755555位點，建立基于熒光定量PCR的分子診斷技術(shù)。首先，分別設計rs755555位點及內(nèi)參基因peptidylprolyl isomerase A（PPIA）的Taqman熒光ARMS-PCR檢測引物和探針；其次，構(gòu)建陽性對照質(zhì)粒；最后，以基因分型精確度為指標，優(yōu)化引物探針組合，以及檢測試劑的 PCR 反應體系和反應條件。結(jié)果表明：野生型最優(yōu)引物探針組合為WF1、R1、FP1、PIRF5、PIRR5、PIRP5，突變型最優(yōu)引物探針組合為FMF3、R1、FP1、PIRF5、PIRR5、PIRP5；每個檢測樣品的最優(yōu)反應體系為SLC39A13基因上下游引物探針各0.1 μL，內(nèi)標上下游引物探針各0.1 μL，10 μL PerfectStartⅡ Probe qPCR SuperMix UDG，5.4 μL純水，4 μL樣品基因組。重復性實驗和70個樣品的檢測驗證，確認了檢測體系的可行性，為研發(fā)SLC39A13基因rs755555位點多態(tài)性檢測試劑盒提供了技術(shù)基礎。

關鍵詞：分子生物學；人SLC39A13基因；ARMS-PCR；核苷酸多態(tài)性檢測；實時熒光定量PCR

中圖分類號：Q789

文獻標識碼：A

DOI：10.7535/hbkd.2024yx05005

Establishment of a method for detecting nucleotide polymorphism

of SLC39A13 gene based on ARMS-PCR

GUO Bingqian1，LI Mengyu2，WANG Rui3，WANG Shusong4， FENG Huiyong1，LI Tianming1

（1.School of Food and Biology，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018，China;

2.Forestry Institute，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150006，China;

3.Taiyuan Jinyu Clinical Inspection Office Company Limited，Taiyuan，Shanxi 030003，China;

4.Hebei Key Labratory of Reproductive Medicine， Hebei Hospital of Reproductive Health，

Shijiazhuang，Hebei 050071， China）

Abstract：In order to achieve its nucleotide polymorphism （SNP） accurate typing， this paper establishes a molecular diagnostic technique based on fluorescent quantitative PCR for accurate genotyping of the nucleotide polymorphism （SNP） at the rs755555 locus of the SLC39A13 gene. Firstly， Taqman fluorescent ARMS-PCR detection primers and probes were designed for the rs755555 locus and the internal reference gene peptidylprolyl isomerase A （PPIA）. Secondly， positive control plasmids were constructed. Finally， based on genotyping accuracy， the primer and probe combinations were optimized， and the PCR reaction system and conditions for the detection reagents were optimized. The optimal primer and probe combination for the wild-type was： WF1， R1， FP1， PIRF5， PIRR5， PIRP5; the optimal combination for the mutant type was： FMF3， R1， FP1， PIRF5， PIRR5， PIRP5. The optimal reaction system for detecting samples was： 01 μL each of upstream and downstream primers and probes for the SLC39A13 gene， 01 μL each of upstream and downstream primers and probes for the internal standard， 10 μL PerfectStart Ⅱ Probe qPCR SuperMix UDG， 54 μL purified water， and 4 μL sample genome. The feasibility of this detection system was confirmed through reproducibility experiments and the detection of 70 samples. This provides a technical foundation for the development of a detection kit for the polymorphism at the rs755555 locus of the SLC39A13 gene.

Keywords：molecular biology；human SLC39A13 gene；ARMS-PCR；nucleotide polymorphism detection；real-time fluorescence quantitative PCR

鋅是人體必需的微量元素，也是男性生殖的重要關聯(lián)因子[1]。已有研究證實，缺鋅會導致精子發(fā)生障礙、降低精液質(zhì)量和生育力

[2-4]。鋅吸收轉(zhuǎn)運存在個體差異，但其遺傳學機制尚未完全闡明，臨床診治男性不育時，精準補鋅也缺乏依據(jù)[5]。人

SLC39A13基因編碼鋅轉(zhuǎn)運體跨膜蛋白ZIP13[6]位于11號染色體p112，共有21個轉(zhuǎn)錄本，已知其表達水平與精子活力密切相關。通過對66例樣本的測序分析及精液質(zhì)量檢測，初步發(fā)現(xiàn)ZIP13 基因rs755555位點的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與精子活力高度關聯(lián)，但對于該結(jié)果仍需要擴大樣本量，并采用高可靠度的SNP檢測技術(shù)進一步加以確認。

單核苷酸多態(tài)性是指同一物種同一基因不同個體之間或不同亞型之間在基因組水平上由于單個核苷酸不同所引起的DNA序列多態(tài)性[7-9]，該生物個體內(nèi)全部細胞的基因型相同，所以基因型具有可遺傳性，可以穩(wěn)定傳遞給下一代。該類生物在基因分型時，只有野生型、突變性、雜合型3種類型。在醫(yī)學上，不同SNP基因型的人群對于某種疾病的易感程度是有差別的[10]，所以SNP分型研究具有重要的醫(yī)學意義，是精準醫(yī)療的基礎[11]。目前，中國市場用于進行基因檢測的技術(shù)主要包括全基因組測序技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。其中熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、普及度高、檢測時間短和成本低等優(yōu)勢[12-13]，在目前臨床分子診斷技術(shù)中應用最為成熟。

ARMS-PCR（amplification refractory mutation system PCR）即擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR，通過引物3’末端引物設計控制等位基因特異性延伸，并結(jié)合Taqman探針的方法檢測熒光信號值，從而判斷野生型等位基因和突變型等位基因[14-15]。本研究采用ARMS-PCR和熒光定量PCR技術(shù)，以提高檢測靈敏性、特異性及準確性為目標，設計、優(yōu)化引物探針組合，優(yōu)化檢測試劑的PCR反應體系和反應條件，建立鋅轉(zhuǎn)運體跨膜蛋白相關基因SLC39A13核苷酸多態(tài)性檢測方法，為研發(fā) SLC39A13 基因rs755555位點基因多態(tài)性檢測試劑盒提供技術(shù)基礎。目前，SLC39A13基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法研究還屬空白，因此，本研究具有較好的參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

質(zhì)粒小提中量試劑盒、超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒、DNA回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司提供；DNA提取試劑盒，簡石生物技術(shù)（北京）有限公司提供；探針法qPCR試劑盒，含UDG（PerfectStart Probe qPCR SuperMix UDG），北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；pfu聚合酶、dNTPs及其他PCR反應試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；Taq DNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；SpectraMax QuickDrop超微量分光光度計，實時熒光定量PCR儀，Quantstudio DX提供；DYY-6C電泳儀，北京市六一廠提供；PCR擴增儀，T100TMThermal Cycler；2×PerfectStar Ⅱ Probe qPCR SuperMix UDG，引物由金唯智生物公司合成。

1.2 實驗樣本

本次實驗所需要的全血樣本，由河北省生殖健康研究院提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物和探針的設計

ARMS-PCR檢測方法是利用Taq DNA聚合酶（來自Thermus aquaticus）的擴增特性來完成靶標突變位點的檢測。Taq DNA聚合酶在擴增過程中缺乏3’－ 5’外切酶活性，因此采用等位基因特異的2條上游引物，兩者在3’端核苷酸不同，一個對野生型等位基因特異，另一個對突變型等位基因特異。下游引物采用通用引物，在Taq DNA聚合酶作用下，與模板不完全匹配的上游引物將不能退火，不能生成PCR產(chǎn)物，而與模板匹配的引物體系則可擴增出產(chǎn)物。ARMS-PCR需要設計Taqman探針，探針分別連有2種不同的熒光染料，5’端為熒光基團，3’端連有通用的熒光淬滅基團。在靶基因擴增過程中，PCR引物和熒光標記探針在退火時均會與目標序列互補結(jié)合，Taq酶在延伸模板鏈延伸時遇到與模板穩(wěn)定結(jié)合的探針，Taq酶的5’—3’外切核酸酶會將與模板結(jié)合的特異性探針降解，從而使探針上的熒光基團因為物理空間分離，淬滅效應消失，發(fā)出熒光，而不能順利擴增的則沒有熒光，因此，通過熒光定量PCR的Ct值的差異，確定SNP基因型。針對SLC39A13基因的rs755555位點，本研究野生基因型為CC，因此上游引物3’端為C；突變型基因型為TT，所以上游引物3’端為T；雜合型基因型為CT，2條引物均可擴增，只是擴增強度均減弱。根據(jù)上述原理，設計系列引物及探針，如表1所示。

1.3.2 DNA提取

DNA提取參考DNA提取試劑盒說明書。提取的核酸使用SpectraMax QuickDrop超微量分光光度計測定DNA的含量，于-20 ℃保存。

1.3.3 陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建

以河北省生殖健康研究院提供的人類基因組DNA作為模板，分別擴增 SLC39A13基因突變型、 SLC39A13 基因野生型，與擴增的內(nèi)參基因PPIA融合，融合片段分別T克隆，獲得轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗證，獲得野生型和突變型基因克隆陽性轉(zhuǎn)化子，提交測序，將測序正確的野生型對照質(zhì)粒和突變型對照質(zhì)粒冷凍保存，備用。將已經(jīng)構(gòu)建好的野生型和突變型質(zhì)粒等比例混合，獲得雜合基因型對照質(zhì)粒。

1.3.4 Taqman熒光ARMS-PCR反應體系

每個檢測樣的ARMS-PCR反應體系試劑配比如表2所示，其中DNA模板分別為SLC39A13野生型人工合成質(zhì)粒、SLC39A13突變型人工合成質(zhì)粒以及雜合質(zhì)粒和人類基因組DNA。采用表1中的引物和探針，依據(jù)實驗不同進行組合，每例DNA模板同時在野生反應液和突變反應液中分別進行擴增，DNA聚合酶采用2×PerfectStart Ⅱ Probe qPCR SuperMix UDG。首先，混合配制野生型反應液的引物、探針，以及酶和突變型反應液的引物、探針，配制體積為全部樣品所需的總量；然后，分裝到PCR管中，分別加入各個模板樣品。

1.3.5 Taqman熒光ARMS-PCR反應條件

本研究使用儀器為Quantstudio DX實時熒光定量PCR儀，配套使用軟件為Quant StudioTM Test Development Software v1.0.1 ，實時熒光定量 PCR 反應的每個循環(huán)包括3個主要步驟，具體條件見表3。

1.3.6 檢測結(jié)果的判讀及分型

Ct值即熒光信號達到設定閾值線對應的循環(huán)數(shù)。若計算數(shù)值大于3，則該樣品為野生型；若計算數(shù)值小于-3，則該樣品為突變型；若計算數(shù)值小于3大于-3，則該樣品為雜合型。

2 實驗結(jié)果

2.1 以基因分型準確度為指標確定引物探針組合

以制備的陽性對照質(zhì)粒作為野生型、突變型和雜合型樣品，同時選用野生型、突變型以及雜合型基因組各2例（基因組質(zhì)量濃度稀釋至10～15 ng/μL）樣品進行檢測。將表1中野生型上游引物與共用下游引物和探針以及內(nèi)標上下游引物和探針一一進行組合，共16組，按照表2的體系分別配制野生型反應液和突變型反應液，引物探針加量0.2 μL。按照表3的反應條件設置PCR儀進行檢測，依據(jù)“1.3.6”所述判定方法進行計算及判定分型結(jié)果，以分型準確性為依據(jù)進行優(yōu)選。實驗結(jié)果見圖1和表4。

表4結(jié)果顯示：有9組引物探針組合檢測不準確（實驗數(shù)據(jù)略）；有6組引物探針組合雖然各樣品基因分型準確，但其中有3組陰性對照的突變擴增體系的Ct值介于36～38之間（實驗數(shù)據(jù)略）；有3組引物探針組合的個別Ct差值接近安全區(qū)間邊緣（實驗數(shù)據(jù)略）；有1組引物探針組合檢測分型準確、Ct差值在安全區(qū)間內(nèi)且陰性對照的Ct值大于38。得到野生型最優(yōu)引物探針組合為WF1、R1、FP1、PIRF5、PIRR5、PIRP5，突變型最優(yōu)引物探針組合為FMF3、R1、FP1、PIRF5、PIRR5、PIRP5。

2.2 PCR反應體系的優(yōu)化

2.2.1 引物及探針濃度優(yōu)化

以制備的陽性對照質(zhì)粒作為野生型、突變型和雜合型樣品，同時選用野生型、突變型以及雜合型基因組各2例（基因組質(zhì)量濃度稀釋至10～15 ng/μL）進行檢測，使用“2.1”確定的最優(yōu)引物探針組合。引物及探針濃度的優(yōu)化方案一：引物及探針加量為0.2 μL，模板加量為2 μL，其他加量見表2；優(yōu)化方案二：引物及探針加量為0.1 μL，模板加量為2 μL，其他加量見表2。使用“1.3.6”所述方法進行計算及基因分型判定。方案一的分型結(jié)果雖然都準確（實驗數(shù)據(jù)略），但陰性對照的突變反應液Ct值為38.21，小于方案二，可能是因為引物探針濃度高，引物和探針之間存在的二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等造成了非特異擴增。為了減少對檢測結(jié)果的干擾，也為了減少檢測試劑用量，降低檢測成本，所以采用方案二，即在PCR反應體系中引物及探針加量為0.1 μL更優(yōu)，實驗數(shù)據(jù)見表5，其擴增曲線見圖2。

2.2.2 基因組加樣量優(yōu)化

以制備的陽性對照質(zhì)粒作為野生型、突變型和雜合型樣品，同時選用野生型、突變型以及雜合型基因組各2例（基因組濃度稀釋至10～15 ng/μL）進行檢測，使用“2.1”確定的最優(yōu)引物探針組合。優(yōu)化方案一：引物及探針加量為0.1 μL，模板加量為2 μL，其他加量見表2；優(yōu)化方案二：引物及探針加量為0.1 μL，模板加量為4 μL，其他加量見表2。使用“1.3.6”所述方法進行判定。方案一檢測結(jié)果，每個樣的3個重復實驗中，有個別樣出現(xiàn)沒有擴增現(xiàn)象，造成分型不準。分析原因可能是由于模板加樣量過少，容易造成取樣量不足；而方案二增加了模板加入量，避免了這種操作誤差，所有檢測結(jié)果都分型準確?？梢?，方案二模板加樣量4 μL更優(yōu)。實驗數(shù)據(jù)見表6，擴增曲線見圖3。

2.3 檢測方法的靈敏度研究

為給開發(fā)試劑盒提供數(shù)據(jù)，驗證了該檢測方法的靈敏度。使用“2.1”確定的最優(yōu)引物探針進行熒光定量PCR，PCR體系為“2.2”優(yōu)化后的體系。以制備的陽性對照質(zhì)粒作為野生型、突變型和雜合型樣品，同時選用野生型、突變型以及雜合型基因組各2例，同一基因組選用稀釋到5、10～15 ng/μL以及基因組原濃度3種溶液同時進行檢測，用“1.3.6”所述方法進行判定。由分型準確性可知，3種質(zhì)量濃度的溶液均可分型準確，說明該方法對模板濃度的要求不苛刻，對于基因組提取條件及質(zhì)量要求更寬泛，適應性更強。實驗結(jié)果也顯示稀釋到10～15 ng/μL的結(jié)果最佳。靈敏度實驗數(shù)據(jù)見表7，擴增曲線見圖4。

2.4 PCR引物探針組合、檢測體系及檢測條件可行性研究

通過檢測大量不同基因組樣品，檢驗該PCR檢測體系及檢測條件的可行性。使用“2.1”確定的最優(yōu)引物探針，PCR體系為“2.2”優(yōu)化后的體系，進行熒光定量PCR。首先，選用10例基因組測序樣品進行SNP檢測，分型結(jié)果相符率達100%，見圖5。此外，選用70個已采用質(zhì)譜法SNP檢測的樣品（質(zhì)譜法實驗由河北省生殖健康研究院完成），采用上述最優(yōu)條件及方法進行SNP檢測，對其分型結(jié)果與質(zhì)譜法結(jié)果相比較可知，分型結(jié)果相符率達100%[7]，統(tǒng)計基因型數(shù)據(jù)見表8。通過大量樣品檢測，證明了該檢測方法的穩(wěn)定性和可行性，表明其有進一步開發(fā)應用的價值。

3 結(jié) 語

1）不孕不育癥發(fā)病率持續(xù)上升，其中男性不育主要與精子質(zhì)量有關，而鋅作為人體必需的微量元素，對于保持精子活力是至關重要的[16]。鋅離子的轉(zhuǎn)運，是鋅參與各類生理活動的重要環(huán)節(jié)。已有研究表明，鋅離子跨膜運輸需要鋅轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)助[17-19]，包括

SLC30A家族（ZNT）和SLC39A家族（ZIP）。圍繞著這2個家族已經(jīng)有大量研究。其中，人的SLC39A13基因編碼鋅轉(zhuǎn)運體跨膜蛋白，是ZIP轉(zhuǎn)運蛋白家族的LIV-1亞家族的一個成員，SLC39A13基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）影響了鋅轉(zhuǎn)運的強弱，進而影響了男性的精子質(zhì)量。

2）本研究基于ARMS-PCR技術(shù)建立了鋅轉(zhuǎn)運基因核酸多態(tài)性分析方法，與其他檢測技術(shù)相比，其優(yōu)勢在于成本低、操作方便、穩(wěn)定性好、閉管操作，降低了交叉污染風險（每一個位點：3條引物、1條探針；對于MGB-PCR方法需要2條引物、2個探針，探針成本高）。此外，采用融合PCR制備各檢測位點基因與內(nèi)標基因融合的陽性對照品，簡化了試劑配制操作，降低了檢測信噪比。該方法在目前的文獻和專利中未見報道。

3）本研究以提高檢測靈敏性、特異性及準確性為目標，分別設計、評估和優(yōu)選了SLC39A13基因rs755555位點及內(nèi)參基因PPIA的檢測引物和探針。通過優(yōu)化引物、探針和模板加量，提高了檢測的準確性、穩(wěn)定性，降低了試劑成本。

4）通過檢測大量樣品，檢驗了方法的穩(wěn)定性和可行性，為研發(fā)SLC39A13 基因rs755555位點多態(tài)性檢測試劑盒提供了技術(shù)基礎。

開發(fā)SLC39A13基因rs755555位點多態(tài)性檢測試劑盒，可為診斷和治療男性不育癥精準用藥提供一種檢測手段和工具。

5）未來擬進一步建立高效的篩選評價體系，完成靈敏度、準確度、精密度、特異性、重復性和貨架期穩(wěn)定性等性能指標的驗證。

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