3株芽孢桿菌抗菌肽抑菌特性與抑菌譜研究

摘要 ［目的］分離篩選出有抑菌特性的芽孢桿菌，并研究其抑菌譜。［方法］從實驗室分離鑒定的71株芽孢桿菌中篩選出對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌性強的新種芽孢桿菌018株、貝萊斯芽孢桿菌F株和解淀粉芽孢桿菌221株，建立比較3株芽孢桿菌的遺傳進化樹，并應用酸沉淀法提取抗菌肽，比較3種芽孢桿菌抗菌肽提取物對11株動物病原菌的抑菌譜。［結(jié)果］3株芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽抑菌特性各有不同，其抑菌譜中3種芽孢桿菌抗菌肽提取物對試驗菌株中的7株病原菌的抑菌性符合對指示菌的抑菌特性，對維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌略有不同。［結(jié)論］芽孢桿菌可為開發(fā)應用抗菌肽的生物活性添加劑制劑或生物抗菌性藥物提供參考。

關(guān)鍵詞 芽孢桿菌；抗菌肽；抑菌特性；抑菌譜

中圖分類號 S 816.3 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）20-0088-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.021

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Antibacterial Peptide Characteristics and Antibacterial Spectrum of Three Strains of Bacillus

YU Meng-bo XIE Zhi-heng2，LI Jia-ming2 et al

（1.Department of Veterinary Medicine，College of Coastal Agricultural Sciences，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088;2.Foshan City Nanhai Eastern Along Pharmaceutical Co.，Ltd.，F(xiàn)oshan，Guangdong 528234）

Abstract ［Objective］The aim of this experiment was to isolate and screen Bacillus with antibacterial properties and study its antibacterial spectrum.［Method］From 71 strains of Bacillus spp.isolated and identified in the laboratory，we screened out new species of Bacillus 018，Bacillus velezensis F and Bacillus amyloliquefaciens 22 which are highly inhibitory to Staphylococcus aureus and Escherichia coli，the genetic evolution tree of 3 strains of Bacillus was established and compared，and the antimicrobial peptides were extracted by acid precipitation method.The antibacterial spectra of 3 strains of Bacillus against 11 strains of animal pathogens were compared.［Result］The results showed that the antimicrobial peptides produced by the three strains of Bacillus had different antibacterial properties.The antibacterial peptide extracts of the three strains in the antibacterial spectrum were in line with the antibacterial properties of the seven strains in the test strain against the indicator bacteria，but slightly different against Aeromonas vickerii，Aeromonas hydrophila and Actinobacillus transinfectious pleuropneumoniae.［Conclusion］The results show that Bacillus can provide reference for the development of bioactive additives or bioantibacterial drugs using antimicrobial peptides.

Key words Bacillus antimicrobial;APMs;Antibacterial properties;Antimicrobical spectrum

芽孢桿菌（Bacillus）是一類好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陽性、產(chǎn)芽孢的桿狀細菌，具有較強的抵抗外界環(huán)境壓力的能力［1］?？咕模╝ntimicrobial peptides，APMs）又稱為抗微生物肽或肽抗生素，是一種具有抗菌、抗病毒和抗真菌活性的小蛋白質(zhì)?？咕谋憩F(xiàn)出對常見和多重或“超級”的耐藥菌株具有抗菌活性，且不易引起耐藥性的產(chǎn)生［2］。細菌抗菌肽（bacteriocin）是細菌在代謝過程中通過核糖體合成產(chǎn)生，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和萬古霉素耐藥性腸球菌（VRE）等耐藥菌也能起到良好的抑制作用［3］。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽類物質(zhì)根據(jù)化學結(jié)構(gòu)組成主要分為細菌素、糖肽類、脂肽類和環(huán)狀肽類。根據(jù)其合成途徑則主要被分為多酶復合體系統(tǒng)合成的非核糖體抗菌肽以及核糖體合成的抗菌肽兩類［4］，非核糖體合成抗菌肽分為表面活性肽（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和豐原素（fengycin）三大家族［5］。

抗生素在動物飼料“禁抗”、臨床應用“減抗”和飼料添加劑及食品生產(chǎn)“無抗”的理念已成共識［6］。在“替抗”方面，芽孢桿菌及其抗菌肽產(chǎn)品研發(fā)和應用已成為動物飼料添加劑方面關(guān)注的熱點，有望成為對抗微生物感染的新替代品及治療耐藥細菌的新方法［7-8］。筆者從實驗室分離鑒定的71株芽孢桿菌中篩選出對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌性強的新種芽孢桿菌018株、貝萊斯芽孢桿菌F株和解淀粉芽孢桿菌221株，觀察3株芽孢桿菌的抗菌肽提取物的抑菌特性與抑菌譜。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株。從實驗室分離鑒定出71株芽孢桿菌中篩選出3株具有抑菌作用的芽孢桿菌，分別命名為新種芽孢桿菌018、貝萊斯芽孢桿菌F和解淀粉芽孢桿菌221。

1.1.2 指示菌。大腸桿菌（K12D31）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）來自中國微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 抑菌譜試驗菌株。豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型、豬鏈球菌9型、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、沙門氏桿菌、大腸桿菌等由佛山科學技術(shù)學院預防獸醫(yī)學重點實驗室分離鑒定。

1.1.4 培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、牛血清、NAD均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定。新種芽孢桿菌018、貝萊斯芽孢桿菌F和解淀粉芽孢桿菌221菌株16S rDNA序列，廣州艾基生物技術(shù)有限公司測定。

1.2.2 菌株培養(yǎng)。

指示菌培養(yǎng)：將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別采用普通瓊脂平板劃線培養(yǎng)24 h，挑取典型菌落，接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃，振搖（180 r/min）培養(yǎng)16～24 h，細菌濃度為OD 1.0（600nm），取出，置于4 ℃，備用。

抑菌譜試驗菌株培養(yǎng)：豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型、豬鏈球菌9型、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌接種于0.2% NAD、0.5%血清液體LB培養(yǎng)基；維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、多殺性巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、沙門氏桿菌、大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，18～24 h取出，置于4 ℃，備用。

芽孢桿菌培養(yǎng)：分別將新種芽孢桿菌018、貝萊斯芽孢桿菌F和解淀粉芽孢桿菌221株菌株平板劃線后于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，選取每種菌株的典型菌株于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液。

1.2.3 發(fā)酵液與抗菌肽提取物的制備。

將各株芽孢桿菌菌株的種子液以1%接種量接到LB液體培養(yǎng)基中，裝瓶量100 mL/150 mL，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，即得發(fā)酵液。

抗菌肽提取物制備：分別將新種芽孢桿菌018、貝萊斯芽孢桿菌F和解淀粉芽孢桿菌221株菌株發(fā)酵液置于離心機上，于4 ℃ 1×104 r/min條件下離心10 min，棄沉淀即得發(fā)酵上清液。將獲得的發(fā)酵上清液以1 mol/L HCL，調(diào)節(jié)pH為2.0，使蛋白絮凝沉淀，1×104 r/min離心10 min；靜置2 h，再將蛋白絮凝沉淀按原體積的1/10溶于PBS緩沖液中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 分離菌抗菌肽提取物抑菌試驗。

采用瓊脂擴散法測定分離菌的抑菌性。取高壓滅菌后冷卻至50～56 ℃，LB瓊脂分別加指示菌液（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、多殺性巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、沙門氏桿菌、大腸桿菌菌株菌液每平皿約20 μL于平板中，同時注入15～20 mL LB瓊脂搖勻，再取豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型、豬鏈球菌9型、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌菌株菌液，分別加每平皿約20 μL于平板中，并按0.2%NAD、0.5%血清加入每一平皿，注入15～20 mL LB瓊脂搖勻，風干表面凝集水，備用。取出待測分離菌液，使用打孔器（直徑6 mm）取被測菌液（約60 μL）加入孔內(nèi)，以培養(yǎng)基作對照，每株菌作3皿次重復，于37 ℃ 18～24 h取出，使用游標卡尺計量抑菌圈直徑（mm），記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 3株芽孢桿菌的遺傳進化樹

建立的新種芽孢桿菌018、貝萊斯芽孢桿菌F和解淀粉芽孢桿菌221菌株的遺傳進化樹見圖1。從圖1可見，3株芽孢桿菌遺傳進化屬于不同分支，是不同種芽孢桿菌的代表株。

2.2 3種抗菌肽提取物的抑菌特性

新種芽孢桿菌018、貝萊斯芽孢桿菌F和解淀粉芽孢桿菌221菌株抗菌肽提取物抑菌特性如圖2所示，新種芽孢桿菌018抗菌肽提取物對金黃色葡萄球菌抑菌性強，抑菌圈直徑為14 mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為8 mm；解淀粉芽孢桿菌221的抗菌肽提取物對大腸桿菌抑菌性強，抑菌圈直徑為19 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為8 mm；而貝萊斯芽孢桿菌F的抗菌肽提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性均較強，抑菌圈直徑分別為16和21 mm。由此可見，新種芽孢桿菌018、貝萊斯芽孢桿菌F和解淀粉芽孢桿菌221菌株產(chǎn)生的抗菌肽抑菌特性不同，新種芽孢桿菌018抗菌肽提取物對革蘭氏陽性菌抑菌性強；解淀粉芽孢桿菌221的抗菌肽提取物對革蘭氏陰性菌抑菌性強；而貝萊斯芽孢桿菌F的抗菌肽提取物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌性均較強。

2.3 3種抗菌肽提取物的抑菌譜

對豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型、豬鏈球菌9型、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、沙門氏桿菌、大腸桿菌進行抑菌譜試驗，結(jié)果如圖3和表1所示。3種芽孢桿菌抗菌肽提取物對試驗菌株中的8株菌的抑菌性符合對指示菌的抑菌特性，但對維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌（水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌）和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的抑菌性略有不同。

3 討論

芽孢桿菌抗菌肽的特性取決于產(chǎn)生的芽孢桿菌菌株。芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)方面有著廣泛的應用，很多生物農(nóng)藥是用芽孢桿菌制成的［9-10］；有些菌株可用于養(yǎng)殖業(yè)上，作為飼料添加劑應用，可提高畜禽產(chǎn)品的品質(zhì)，降低飼養(yǎng)成本，抗病免疫能力，研究認為現(xiàn)有飼料添加劑中，益生素菌種（株）70%來自芽孢桿菌屬［11］。芽孢桿菌海陸共棲，是一類公認的細菌素產(chǎn)生菌。源于芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽被稱之為芽孢桿菌抗菌肽。大量研究表明，芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種具有較廣抗菌譜的活性物質(zhì)，這些抗菌物質(zhì)大多屬于多肽類［12-13］。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽，如短桿菌肽、桿菌肽、表面活性肽、伊枯草菌素、豐原素等都主要是通過多酶復合體催化氨基酸殘基縮合而成，屬于非核糖體合成類抗菌肽［14］。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽具有抑制真菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等的生物活性，部分還具有抗病毒和抗支原體的特性［15-19］，該研究分離的新種芽孢桿菌018、貝萊斯芽孢桿菌F和解淀粉芽孢桿菌221株菌株產(chǎn)生不同抑菌特性的抗菌肽。新種芽孢桿菌018抗菌肽提取物對革蘭氏陽性菌抑菌性強；解淀粉芽孢桿菌221的抗菌肽提取物對革蘭氏陰性菌抑菌性強；而貝萊斯芽孢桿菌F的抗菌肽提取物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌性均較強。抑菌特性不同主要取決于芽孢桿菌抗菌肽的組成結(jié)構(gòu)。有關(guān)3種抗菌肽的組成結(jié)構(gòu)有待于進一步深入研究。

選取分離的豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型、豬鏈球菌9型、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、沙門氏桿菌、大腸桿菌9株豬細菌病原體和維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌（水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌）檢測3種抗菌肽提取物的抑菌譜，結(jié)果與3種抗菌肽的抑菌特性相符合。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢測抑菌性不明顯，這是否與豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌屬于放線菌，抗菌肽作用于細菌細胞膜活性不強有關(guān)還有待于試驗證明。維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌（水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌）對貝萊斯芽孢桿菌F的抗菌肽提取物中敏或高敏，對新種芽孢桿菌018抗菌肽提取物低敏或中敏，而對解淀粉芽孢桿菌221的抗菌肽提取物均表現(xiàn)不敏感，這種現(xiàn)象可能與水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的生存環(huán)境和該試驗運用的菌株培養(yǎng)液細菌濃度有關(guān)。

4 結(jié)論

3株不同芽孢桿菌新種芽孢桿菌018、解淀粉芽孢桿菌221和貝萊斯芽孢桿菌F分別對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌抑菌性均較強。3株芽孢桿菌抗菌肽對11株動物源性病原菌抑菌譜試驗總體結(jié)果與3種抗菌肽的抑菌特性相符合，其中維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌（水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌）和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌略有不同。

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