‘44號’抗蟲黑楊基于根段組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

摘要：[目的]以美洲黑楊和轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊的雜交子代‘44號’抗蟲黑楊作為試驗材料，采用無菌苗根基部為外植體，建立高效穩(wěn)定的組培再生體系和黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系。[方法]以‘44號’抗蟲黑楊無菌苗0.5-1.0 cm的根基部為試驗材料，研究不同激素配比對根系不定芽的誘導(dǎo)和生根的影響，探索根系對草銨膦的臨界耐受濃度，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行遺傳轉(zhuǎn)化，并通過B-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因染色實時監(jiān)控和鑒定陽性植株。[結(jié)果]篩選出‘44號’抗蟲黑楊根系誘導(dǎo)不定芽最優(yōu)培養(yǎng)基為：WPM+20 g·L-1蔗糖+ 7.8 g·L-1瓊脂+0.25 mg·1-1 6-BA+ 0.05 mg·L-1 NAA，分化率為86.67%；不定芽生根的最優(yōu)培養(yǎng)基為：WPM+ 0.075 mg·L-1NAA+7g·L-1瓊脂+0.1 g·L-1 AC，生根率為75.00%。通過根系草銨膦抗性篩選梯度試驗，確定根系對草銨膦篩選最適遺傳轉(zhuǎn)化篩選濃度為0.8 mg·L-1。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因轉(zhuǎn)入到根中，經(jīng)不定芽誘導(dǎo)和生根兩個階段獲得再生植株苗，經(jīng)特異引物進行PCR鑒定，31個外植體中陽性植株為9株，轉(zhuǎn)化效率為29.0%。[結(jié)論]建立了‘44號’抗蟲黑楊根系的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，為黑楊派楊樹的高效基因轉(zhuǎn)化提供了途徑的同時，也為以‘44號’抗蟲黑楊為基礎(chǔ)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)聚合更多的優(yōu)良性狀，提供了重要的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：‘44號’抗蟲黑楊（P. deltoides cl．‘Danhong'x P．nigra）；美洲黑楊；歐洲黑楊；根系侵染；遺傳轉(zhuǎn)化；組培再生；GUS染色

中圖分類號：S722;S792.11 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）05-0074-11

楊樹（Populus）是中緯度平原地區(qū)木材產(chǎn)量最高、種植面積最大的速生用材樹種之一，具有生長快、成材早和產(chǎn)量高等特點。人工林是我國木材供應(yīng)的主要來源，從2007年開始，我國楊樹人工林總面已經(jīng)達到700萬hm，其中美洲黑楊（Populus deltoides Marsh.）占據(jù)主導(dǎo)地位。隨著楊樹人工林規(guī)模的不斷擴大和集中種植，以舞毒蛾（Lymantria dispar）、楊尺蠖（Malacosomaneustria）和天牛（Coleoptera）等為主的多種森林病蟲害開始蔓延肆虐，對林業(yè)經(jīng)濟和生態(tài)系統(tǒng)造成重大損失。我國非常重視楊樹病蟲害研究，1989年獲得首例轉(zhuǎn)BtCry1Ac（Bt）基因歐洲黑楊（P．nigra），田間試驗證明其對楊尺蠖等具有很好的抗性，同時也具有生長快速的特性。由中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所培育的轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊目前已進入產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用階段，能夠有效抵抗食葉害蟲的危害。此外，美洲黑楊速生良種丹紅楊（P．deltoides c1．‘Danhong，）與轉(zhuǎn)Bt歐洲黑楊的雜交子代被報道能夠顯著抵抗舞毒蛾的蟲害，同時具有生長快速的特性。在這些雜交子代中，‘44號，抗蟲黑楊（P．deltoides c1．‘Danhong，xP．nigra L．）表現(xiàn)尤為突出，成為集速生、耐水濕和抗蟲等多種優(yōu)良性狀的優(yōu)良楊樹品種，在推廣種植方面具有優(yōu)勢。

隨著我國楊樹人工林不斷向困難立地擴展，并面臨木材市場的多元化需求，楊樹良種需要不斷更新，如選育抗逆性強、經(jīng)營成本低、木材密度提高或纖維含量增加等楊樹新品種。常規(guī)育種效率低、周期長，而通過基因工程手段實現(xiàn)林木優(yōu)良性狀聚合育種已成為林木育種的重要技術(shù)途徑，也是楊樹新品種創(chuàng)制的新趨勢。基因工程育種的關(guān)鍵在于遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。如前所述，‘44號’抗蟲黑楊集合了速生、耐水濕和抗蟲等多種優(yōu)良特性，選擇‘44號，抗蟲黑楊作為遺傳轉(zhuǎn)化受體，通過基因工程手段，進一步聚合優(yōu)質(zhì)、抗逆等其它優(yōu)良性狀，有望創(chuàng)制突破性楊樹新品種。因此，‘44號’抗蟲黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立對于優(yōu)良性狀聚合育種具有重要意義。

目前比較成熟的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化體系多為以84K楊等白楊派物種為遺傳轉(zhuǎn)化受體，采用的轉(zhuǎn)化方法多是葉盤法，轉(zhuǎn)化效率可以達到35.0%左右。此外，直接侵染愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法也有報道。歐美楊107具有與‘44號，抗蟲黑楊相似的黑楊派遺傳背景，它的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要是通過葉盤法將組培苗的葉片、莖段和葉柄作為試驗材料進行侵染來實現(xiàn)。然而其優(yōu)化后的遺傳轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化效率僅有10.0%。基因編輯技術(shù)在林木育種應(yīng)用方面，需要獲得等位基因都發(fā)生編輯的“純合體”，由于遺傳轉(zhuǎn)化效率低下的原因，所以需要獲得更多的轉(zhuǎn)基因植株來進行篩選，確保篩選到理想的“純合體”。因此，‘44號，抗蟲黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立需要嘗試新的遺傳轉(zhuǎn)化方法，以大幅提高轉(zhuǎn)化效率。

前期利用葉盤法和愈傷組織轉(zhuǎn)化的方法對‘44號，抗蟲黑楊進行遺傳轉(zhuǎn)化均未成功，誘導(dǎo)出不定芽很困難，但在轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)利用‘44號’抗蟲黑楊根系進行不定芽和愈傷組織誘導(dǎo)效率較高。此前有報道表明，對草本植物橡膠草（Ficus elasticaRoxb.）和小冠花（Passiflora foetida L．）、塊莖植物甘薯（lpomoea batatas L.）、木本植物臭椿（Ailanthus altissima （Mill．） Swingle）等的外植體根系進行侵染，可以獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。因此，本研究試圖通過根系再生途徑，對‘44號’抗蟲黑楊進行轉(zhuǎn)化，以建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本研究以1月齡的‘44號，抗蟲黑楊組培苗的根系和剪去根尖的根基部為材料，根系剪切成1.0 cm長的小段、根基部保留0.5～1.0 cm進行試驗。試驗所需農(nóng)桿菌菌株采用EHA105；載體為pCAMBIA3300-GUS，攜帶GUS蛋白和潮霉素篩選標(biāo)記；WPM固體培養(yǎng)基（L449）；AC（活性炭）；KT、NAA用1 mol·L-1 KOH溶解加無菌水分別配制成2 mg·mL-1母液并4℃保存；6-BA、TDZ用1 mol·L-1 KOH溶解加無菌水配制成1 mg·mL-1母液并4℃保存；IBA、2，4-D用無水乙醇分別配制成1 mg·mL-1、2 mg·mL-1母液并4℃保存；潮霉素（H370）為Phytotech的50 mg·mL-1濃度的溶液，并-20℃保存；卡那霉素用無菌水配制50 mg·mL-1母液并-20℃保存，特美汀用無菌水配制200 mg·mL-1母液并-20℃保存；乙酰丁香酮和利福平直接用二甲基亞砜溶解分別配制成100 mmol·L-1、50 mg·mL-1母液并-20℃保存。所有培養(yǎng)基pH調(diào)至5.9～6.0，除6-BA、2，4-D、KT、NAA激素外，其余激素和抗生素均過濾除菌。

1.2 '44號’抗蟲黑楊根系再生

1.2.1 外源激素對‘44號，抗蟲黑楊生根的影響

將1月齡‘44號’抗蟲黑楊的幼苗取帶頂芽的1.5～2.0 cm莖段接種到含有不同NAA（0.025～0.1 mg·L-1）、IBA（0，0.05 mg·L-1）配比的生根培養(yǎng)基（WPM+10 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.1 g·L-1 AC，pH 5.9）上，在2 100～2 300 lx光照條件下培養(yǎng)1個月，統(tǒng)計接種材料的生根情況，每個組合9個帶頂芽莖段，共進行3次實驗重復(fù)。生根率計算如下：生根率公式：Rs=（R/N）×100%，式中：Rs為生根率，R為生根的不定芽數(shù)，N為接種的不定芽數(shù)。

1.2.2 外源激素對‘44號，抗蟲黑楊根系不定芽誘導(dǎo)的影響

選取剪切成長度2 cm左右無菌苗頂芽或莖段，扦插在生根培養(yǎng)基上生長1個月大小的‘44號，抗蟲黑楊的根系，剪切成1.0 cm的小段，放置到含有不同6-BA（0.25～0.75 mg·L-1）、TDZ（0，0.05 mg·L-1）配比的分化培養(yǎng)基（WPM+20 g·L-1蔗糖，pH 5.9）上，在2 100～2 300 lx光照條件下培養(yǎng)1個月，統(tǒng)計芽的再生效率，共進行3次實驗重復(fù)。出芽率計算如下：γ＝（n/M）×100%，式中：y為出芽率，n為出芽的外植體數(shù)，M為共放置培養(yǎng)的外植體數(shù)。

1.3 '44號，抗蟲黑楊除草劑濃度的選擇

選取健康、生長狀態(tài)一致的‘44號，抗蟲黑楊無菌組培苗根系剪切成0.5～1.0 cm長度大小的根段，分別接種到含有不同濃度草銨膦（0、0.4、0.8、1.2和1.6 mg·L-1）的分化培養(yǎng)基上，觀察根段的生長狀態(tài)和誘導(dǎo)出不定芽的情況。每個處理接種18個根段，30 d后觀察根段生長狀況，統(tǒng)計不同濃度草銨膦培養(yǎng)基上根段發(fā)芽數(shù)量和褐化情況，確定草銨膦最適抑制濃度，共進行3次實驗重復(fù)。褐化率計算如下：RB=（B/T）×100%，式中：RB表示褐化率，B為褐化的外植體數(shù)，丁為共放置培養(yǎng)的外植體數(shù)。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)‘44號，抗蟲黑楊的遺傳轉(zhuǎn)化

1.4.1 農(nóng)桿菌菌液的制備

將攜帶GUS報告基因的pCAMBIA3300表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，涂板2d后挑單菌落于1 mL液體LB培養(yǎng)基（卡那霉素50 mg·L-1、利福平50 mg·L-1）中，28℃下210 r.min-1條件下震蕩過夜培養(yǎng)，取200 μL接種到50 mL液體LB培養(yǎng)基（卡那霉素50 mg·L-1、利福平50 mg·L-1）中繼續(xù)培養(yǎng)10～12 h，至菌液OD600為0.6左右。4 000 r·min-1離心10 min，用重懸液（WPM+20 g·L-1蔗糖+1 mg·L-1 2，4-D+0.1 mg·L-1 KT，pH 5.6）懸浮農(nóng)桿菌00600至0.3～0.5左右。

1.4.2 侵染與共培養(yǎng)

選取生長30 d左右，狀態(tài)健康的‘44號，抗蟲黑楊無菌組培苗，對無菌組培苗進行剪切，保留根莖連接處向上莖部分2.0 cm左右即可，莖上如有小芽可保留，去除植株下部的根系尖端，剪去根下部后剩余根基部0.5～1.0 cm的部分作為侵染的外植體，將外植體直接放到LB菌液或重懸液中，侵染10～15 min，用無菌濾紙吸去多余菌液，放到到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（WPM+20g·L-i蔗糖+ 7.8 g·L-1瓊脂+1 mg·L-12，4-D+0.1 mg·L-1KT+100μmol·L-1 AS，

pH 5.9）中，24-27℃暗培養(yǎng)48 h。

1.4.3 抗性根系誘導(dǎo)

共培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌濾紙吸取根系上過多的菌液，隨后將莖根基外植體移至生根培養(yǎng)基（WPM+10 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+1 mg·L-1草銨膦+ 800 mg·L-1特美汀，pH5.9）中，2 100～2 300 lx光照條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)10～20 d左右，直至新的抗性根系生長到3.0～5.0 cm左右。

1.4.4 抗性根系不定芽誘導(dǎo)

將由根基部和根系剪切傷口處生長到3.0～5.0 cm左右的抗性根系剪切成約1.0 cm左右的3段，并將抗性根系小段移至分化培養(yǎng)基（WPM +20 g·L-1蔗糖+ 7.8 g·L-1瓊脂+0.6 mg·L-1 6-BA+0.06 mg·L-1 NAA+0.8 mg·L-1草銨膦+ 800 mg·L-1特美汀，pH 5.9）上進行不定芽的誘導(dǎo)，2 100～2 300 lx光照條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)1-2個月左右，直至新的抗性不定芽生長到0.5～1.0 cm左右。

1.4.5 抗性不定芽的生根

切取1個或相距較遠(yuǎn)的2個不定芽誘導(dǎo)生根，以保證每一個芽都來自一個獨立轉(zhuǎn)化事件?？剐圆欢ㄑ拷臃N到生根培養(yǎng)基（WPM+10g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.025 mg·L-1、NAA+ 0.05 mg·L-1 IBA+ 0.1 g·L-1 AC+ 0.8 mg·L-1草銨膦+ 800 mg·L-1特美汀，pH 5.9）上，2 100～2 300 lx光照條件下進行培養(yǎng)，根基部和根系剪切傷口處產(chǎn)生的同一條根誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽分別取1和2株進行接種生根。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的檢測

1.5.1 GUS染色鑒定

GUS染液的配制：首先，配制20 mmol·L-1的Na3PO4（pH 7.2）：6.2 mL的0.2 mol·L-1的Na2HPO4和3.8 mL的0.2 mol·L-1的NaH2PO4混合，并加入88 mL的純水，混合后，充分溶解；然后，1 mmol·L-1的5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷（X-Gluc）的配制為：100 mg的X-Gluc用1.92 mL的DMF進行溶解；最后，進行混合配置總量為100.2 mL的使用染液：取20mmol·L-1的Na3PO4 （pH 7.2） 97 mL;1 mmol·L-1的K3Fe（CN）6 1 mL;1 mmol·L-1的K4Fe（CN）61 mL;曲拉通X-100 （Triton X-100） 0.2 mL;1 mmol·L-1 X-Gluc 1 mL。

取完整的抗性植株和野生型植株組培苗放入不同的50 mL離心管進行GUS染色鑒定，加入配制好的GUS染液（完全覆蓋材料），用鋁箔紙覆蓋包住，37℃過夜染色。將染色好的材料轉(zhuǎn)入90%酒精中脫色2次，再轉(zhuǎn)入75%酒精中脫色1次，直至葉綠素完全溶解到酒精中。GUS染色實時監(jiān)控和追蹤觀察的染色方法也是此方法。

1.5.2 PCR鑒定

提取在抗性生根培養(yǎng)基上生長了1個月左右的抗性幼苗，同時取野生型植株和抗性植株1.0～2.0 cm2大小的葉片，用CTAB法提取DNA，并設(shè)計抗除草劑基因的特異性引物進行PCR鑒定，擴增片段長度為242 bp（bar-F： AGTCGACCGTGTACGTCTCC;bar-R：GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC）。轉(zhuǎn)化效率的計算如下：η=（W/Q）×100%，式中，η為轉(zhuǎn)化效率，W為獲得陽性植株數(shù)，Q為接種外植體數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用IBMSPSS Statistics 27軟件進行不同處理間的差異顯著性分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素對‘44號，抗蟲黑楊的組培再生體系的影響

2.1.1 外源激素對‘44號’抗蟲黑楊生根的影響

將生長1個月左右的‘44號’抗蟲黑楊的幼苗取帶頂芽的1.5～2.0 cm莖段接種到含有不同NAA、IBA配比的生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中只添加NAA的生根效率總體高于同時添加IBA和NAA，并且當(dāng)NAA濃度大于或等于0.05 mg·L-1時，生根率隨著NAA濃度的升高而提高；當(dāng)NAA濃度小于或等于0.05 mg·L-1時，生根率隨著NAA濃度的升高而下降（表1）。但是對于不同組合的生根率存在明顯差異，其中在NAA 0.025 mg·L-1與IBA 0.05 mg·L-1（組合1）濃度下，生根率和平均側(cè)根數(shù)在8個組合中均是最佳效率和數(shù)量，因此，處理1（NAA 0.025 mg·L-1，IBA 0.05 mg·L-1）是最適宜‘44號，抗蟲黑楊生根的生長素濃度。同時，根據(jù)主根和側(cè)根的生長情況，發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NAA濃度小于0.075 mg·L-1時，側(cè)根數(shù)量隨著NAA濃度的升高而升高（表1）。在處理1條件下，側(cè)根數(shù)量達到最多，同時生根率也達到最高，達到75.00%（表1）。在處理7條件下，主根數(shù)量達到最多，并且側(cè)根數(shù)量也相對較高（表1）。以上結(jié)果表明，最優(yōu)的生根培養(yǎng)基為WPM+10g·L-1蔗糖+ 0.025 mg·L-1 NAA+0.05 mg·L-1IBA+0.1 g·L-1 AC和WPM+10 g·L-1蔗糖+0.075 mg·L-1 NAA+0.1 g·L-1 AC，pH二5.9（表1）。

2.1.2 外源激素對‘44號’黑楊根段誘導(dǎo)不定芽分化的影響

選取剪切成長度2 cm左右無菌苗頂芽或莖段，扦插在生根培養(yǎng)基上生長1個月大小的‘44號’抗蟲黑楊的根系，剪切成1.0 cm大小的小段，放置到含有不同6-BA、NAA、TDZ配比的分化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。試驗顯示：在不同激素配比的培養(yǎng)基上，不定芽出芽效率最高的是4號配比（6-BA為0.25 mg·L-1，TDZ為0 mg·L-1，NAA為0.05 mg·L-1），其出芽率達到了86.67%；其次是5號，其出芽率為73.33%（表2）。同時通過實驗發(fā)現(xiàn)不添加TDZ更有利于‘44號，抗蟲黑楊根系的不定芽誘導(dǎo)，TDZ的添加并沒有出現(xiàn)出芽率提升的結(jié)果，并且出芽率降低，并且隨著6-BA的升高出芽率不斷降低，可能是由于根系細(xì)胞已經(jīng)具有很強的生長和分裂活性，不需要外源添加細(xì)胞分裂素來促進根系的不定芽的誘導(dǎo)。綜合以上結(jié)果，‘44號’抗蟲黑楊最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+20 g·L-1蔗糖+ 7.8 g·L-1瓊脂+ 0.25 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA，pH=5.9.

2.2 除草劑草銨膦濃度的選擇

在含有0.4、0.8、1.2和1.6 mg·L-1草銨膦的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d以篩選不定芽誘導(dǎo)的最適草銨膦濃度。結(jié)果顯示：在不定芽誘導(dǎo)階段，當(dāng)草銨膦濃度在0.8 mg·L-1以下時，根段會發(fā)生膨大，可以正常誘導(dǎo)出不定芽（圖1a、f）；當(dāng)草銨膦為0.8 mg·L-1時，根段膨大被明顯抑制（圖1c、g），同時不定芽誘導(dǎo)也受到明顯抑制，不能誘導(dǎo)出芽（圖1b-e）；而當(dāng)草銨膦濃度大于0.8 mg·L-1時，外植體根段幾乎不膨大，無法正常誘導(dǎo)出不定芽，并開始出現(xiàn)褐化的情況（圖1c～e）。以上研究結(jié)果表明，不定芽誘導(dǎo)過程中草銨膦最適篩選濃度為0.8 mg.L-1左右（表3）。

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的‘44號，抗蟲黑楊遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株分子檢測

如圖2所示選取生長至1個月左右的‘44號’抗蟲黑楊，剪掉根系尖端，留0.5～1.0 cm的根基部進行農(nóng)桿菌侵染；侵染10～15 min后，無菌濾紙吸干凈材料上殘留的菌液；共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)48 h后，外植體邊緣長出農(nóng)桿菌，用無菌濾紙吸除多余的農(nóng)桿菌后放到到0.8 mg·L-1的草銨膦生根培養(yǎng)基中再生抗性根；培養(yǎng)10～20 d后，抗性根系長度達到3.0～5.0 cm; GUS染色實時監(jiān)控和追蹤觀察能夠快速的判斷轉(zhuǎn)化情況，如在完成侵染后的染色或共培養(yǎng)結(jié)束后的染色或侵染完成后進行再生根后新生根系的染色等，新生的根系為陽性時，整個根系表現(xiàn)為陽性，快速確定侵染條件優(yōu)劣（圖3）；抗性根系剪切成1.0 cm左右大小的根段，轉(zhuǎn)移到0.8 mg·L-1的草銨膦分化培養(yǎng)基中，1-2個月后產(chǎn)生不定芽；0.5～1.0 cm左右大小的不定芽轉(zhuǎn)移至0.8 mg·L-1的草銨膦生根培養(yǎng)基，1周左右生根。從農(nóng)桿菌侵染根基部至產(chǎn)生抗性不定芽需要約2-3個月時間。

采用GUS染色檢測了陽性轉(zhuǎn)化植株，如圖4所示，GUS染色后，轉(zhuǎn)基因植株可以觀測到明顯的GUS信號，與之相反，未轉(zhuǎn)基因植株沒有檢測到GUS信號（圖4a、b）。隨后，利用特異性引物通過PCR擴增草銨膦抗性基因的片段，進一步鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。共檢測了31個外植體獲得的再生植株，其中，能夠GUS染色和擴增出草銨膦抗性基因片段的植株為9株，可確認(rèn)為轉(zhuǎn)化成功植株。每次接種的根段數(shù)為16個，根據(jù)所獲得的陽性植株的株數(shù)來計算轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率為29.0%（圖4c）。

3 討論

3.1 高效穩(wěn)定的‘44號’抗蟲黑楊組培再生體系

分子育種經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)在品種改良和優(yōu)良性狀聚合方面展現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭，如水稻淀粉品質(zhì)的改良，林木抗病、抗蟲、耐干旱和木材性質(zhì)改良，抗食葉害蟲轉(zhuǎn)基因楊樹品種進入環(huán)境釋放及商業(yè)化應(yīng)用階段等等。黑楊作為我國楊樹人工林主要造林樹種，具有多種優(yōu)良性狀。但是黑楊的遺傳轉(zhuǎn)化困難、效率低下、周期長，限制了黑楊基因工程育種的發(fā)展。本研究以‘44號’抗蟲黑楊根為外植體，先誘導(dǎo)不定根再誘導(dǎo)不定芽，建立了高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為后期通過基因工程技術(shù)將外源基因整合到已經(jīng)具有多種優(yōu)良性狀的‘44號’抗蟲黑楊中，實現(xiàn)多種優(yōu)良性狀聚合奠定了基礎(chǔ)。

在植物組織培養(yǎng)中，植物激素發(fā)揮重要作用，如NAA能夠有效誘導(dǎo)生根，KT、ZT、IBA、IAA等對不定芽的誘導(dǎo)有一定作用，6-BA，NAA和GA則對珠心、胚珠培養(yǎng)物的生根有良好的作用，相反，2，4-D對芽和根的誘導(dǎo)有抑制作用。同時，還有一些不常用的激素，如乙烯和脫落酸（ABA）可以控制生根過程，乙烯和ABA可以抑制植物細(xì)胞的伸長。在本研究中，通過設(shè)置不同激素配比的培養(yǎng)基來探索適合‘44號，抗蟲黑楊根系不定芽誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因苗生根的培養(yǎng)基。TDZ是一種人工合成的多功能植物激素，被廣泛應(yīng)用于木本植物，認(rèn)為能夠促進不定芽的增殖和愈傷組織的形成。在不定芽的誘導(dǎo)過程中，保持0.05 mg·L-1NAA的比例不變，通過是否添加0.05 mg·L-1 TDZ搭配0.25、0.5、0.75 mg·L-1 6-BA的濃度梯度篩選最佳的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本研究發(fā)現(xiàn)添加0.05 mg·L-1 TDZ不僅不能促進不定芽的誘導(dǎo)反而有抑制作用，推測原因可能是培養(yǎng)基中添加的6-BA和NAA，或者根中內(nèi)源激素水平，已經(jīng)可以滿足根段不定芽誘導(dǎo)的需求，再添加TDZ后致使激素濃度過高，打破不定芽誘導(dǎo)的激素需求平衡，過多的細(xì)胞分裂素導(dǎo)致細(xì)胞增值反而不利于芽的分化。在不添加TDZ的情況下，出芽率隨著6-BA濃度的提高而降低，且0.25 mg·L-1的6-BA可以有效促進不定芽的產(chǎn)生，效率可高達86.7%。不定芽生根是完整植株的最后一步，該過程中細(xì)胞分裂素與生長素具有相反的作用，前者抑制而后者促進，兩者之間比例關(guān)系的變化會產(chǎn)生不同的作用。如在礬根扦插生根過程中，單一的IBA就能夠很好的促進生根，而半夏組培苗的生根則是IBA和NAA按照一定比例才能夠達到最理想的生根效果H2l。本研究通過是否添加0.05 mg·L-1IBA配合0.025、0.05、0.075、0.1 mg·L-1 NAA的濃度梯度來篩選最佳的誘導(dǎo)不定芽生根培養(yǎng)基。發(fā)現(xiàn)不管是否添加IBA，不定芽生根均隨NAA含量的增加先降低后升高。但在IBA存在時，0.025 mg·L-1 NAA就能有效促進生根，而當(dāng)IBA不存在時，0.1 mg·L-1 NAA才能促進不定芽高效生根，反映出IBA的存在能夠促進‘44號’抗蟲黑楊根系NAA誘導(dǎo)的不定芽生根。值得一提的是，優(yōu)化后‘44號，抗蟲黑楊根系不定芽的生根率可提高到75.0%。

3.2 ‘44號’抗蟲黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

植物的遺傳轉(zhuǎn)化要高效獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株，抗性篩選壓的確定至關(guān)重要，抗性篩選試劑濃度過高不利于不定芽的誘導(dǎo)及芽的正常生長，過低不能有效篩選出抗性植株。草銨膦是一種在世界范圍內(nèi)廣泛使用的內(nèi)吸型除草劑，具有廣譜、高效和低毒的特點，利用草銨膦進行抗性篩選已經(jīng)在油菜、蓖麻和楊樹等多種植物上進行，不同植物對草銨膦的抗性存在較大差異，如在84k楊中篩選壓濃度范圍在2～8 mg·L-1，相較于黑楊濃度0.8 mg·L-1偏高。本研究中所用載體攜帶的BAR基因是一種抗草銨膦的基因，來自于土壤細(xì)菌吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus），可以使植物體內(nèi)的草銨膦自由氨基乙?；瘡亩档筒蒌@膦毒性。本研究發(fā)現(xiàn)草銨膦對根段不定芽的誘導(dǎo)具有顯著的抑制作用，在濃度0.8 mg·L-1時，添加了草銨膦的根段均未出芽。表明草銨膦對根段不定芽的誘導(dǎo)具有很強的抑制作用，這與已報道的草銨膦對84K楊葉片不定芽誘導(dǎo)的影響具有相似性，但不像對根段抑制的這么強烈，當(dāng)濃度升到2 mg·L-1時才會出現(xiàn)完全抑制的情況。

本研究成功建立了抗蟲‘44號’黑楊根段侵染的遺傳轉(zhuǎn)化方法。楊樹中常用的葉盤法和愈傷組織轉(zhuǎn)化方法，在葉和愈傷組織獲取階段就需要1-2個月時間，而根段侵染遺傳轉(zhuǎn)化方法所用的根系材料豐富，僅需莖誘導(dǎo)7～10 d。根段還具有較強的補充損傷或干細(xì)胞再生的潛力，細(xì)胞全能性的特性突出，可以作為較好的受體材料。另外，在侵染完成后，根段不定芽產(chǎn)生較快，在分化培養(yǎng)基上僅需1-2個月就可產(chǎn)生不定芽，整個遺傳轉(zhuǎn)化周期可控制在3個月左右，且較之前報道的黑楊遺傳轉(zhuǎn)化方法平均陽性率提升接近30.0%。黑楊通常被認(rèn)為難以進行遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化效率低下，本研究建立的遺傳轉(zhuǎn)化方法克服了這一難題，可以為后續(xù)其他黑楊品種以及難轉(zhuǎn)化的木本植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化提供思路。值得一提的是，根系侵染具有不受外植體材料生長環(huán)境限制、轉(zhuǎn)化后生長快、鑒定和檢測方便以及不定芽產(chǎn)生快等優(yōu)勢。

本研究中使用GUS基因作為轉(zhuǎn)化材料的指示，能夠穩(wěn)定高效表達，且不需要借助特定的設(shè)備。表達蛋白的表達載體以方便在遺傳轉(zhuǎn)化的前期和后期對轉(zhuǎn)基因材料進行鑒定，快速獲取轉(zhuǎn)化的根用于芽的誘導(dǎo)，即在遺傳轉(zhuǎn)化的早期，就可采用GUS染色對侵染后的根系進行鑒定，不僅可以對轉(zhuǎn)化效率進行隨時判斷，而且可以取一部分侵染根段GUS染色進行初篩，選擇陽性的根開展后續(xù)的不定芽誘導(dǎo)及植株再生，有效減少了轉(zhuǎn)基因植株的假陽性。因此，在‘44號’黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系建立中GUS報告基因的應(yīng)用不僅保證了轉(zhuǎn)化的效率，而且為陽性鑒定提供了快速、方便的方法。

4 結(jié)論

本研究建立了‘44號，抗蟲黑楊基于根段的組培再生體系，誘導(dǎo)莖段生根率達到75.00%，根段出芽率達到86.67%，為黑楊和其他難以進行組織培養(yǎng)的木本植物提供新的外植體選取思路和有效的技術(shù)支撐。同時，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的‘44號’抗蟲黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系，確定了最適的草銨膦篩選濃度，轉(zhuǎn)化效率達到29.0%，為黑楊的基因功能研究、基因聚合育種提供了關(guān)鍵技術(shù)體系，也為其他木本植物在克服遺傳轉(zhuǎn)化瓶頸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)提供了參考。

（責(zé)任編輯：張研）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃“林木多性狀高效聚合育種技術(shù)”（2021YFD2200205）國家級；浙江省“十四五”育種專項林木協(xié)作組 課題（2021C02070-1）省市級