全紅楊與2025楊抗銹性差異比較

摘要：[目的]為明確紅葉楊品種全紅楊與其親本2025楊對葉銹病的抗性差異及其作用機制。[方法]通過在紅葉楊品種全紅楊和其親本2025楊上人工接種北美柵銹菌，對兩種楊樹的發(fā)病狀況、銹菌基因表達量、活性氧和抗氧化酶活性的動態(tài)變化進行了測定。[結果]表明兩種楊樹對北美柵銹菌均表現為感病，其中全紅楊為中度感病，2025楊為高度感病。相比全紅楊，銹菌在2025楊葉片內發(fā)育更快、潛育期更短、夏孢子堆更大更密。全紅楊的3種抗氧化酶活性（POD、CAT、SOD）均高于2025楊，而2025楊中的活性氧水平高于全紅楊。[結論]說明全紅楊應對銹菌入侵較2025楊能更快的啟動免疫應答反應，平衡活性氧水平，從而表現出較強的抗病性。

關鍵詞：紅葉楊；北美柵銹菌；抗銹性

中圖分類號：S763.15 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）05-0178-08

楊樹（Populus spp.）是我國分布廣泛，具有重要經濟價值的木材資源。美洲黑楊（Populusdeltoides W．Bartram ex Marshall）原產于北美洲，20世紀70年代我國引進種植，現已成為我國商業(yè)化楊樹的主栽品種和雜交育種親本。紅葉楊品種“全紅楊”（P．deltoids cv.‘Quanhong’）是2000年春由1棵美洲黑楊“2025”（P.deltoides cv．‘Zhonglin 2025’）平茬苗上發(fā)現的一個紫紅色芽經過兩次芽變育種而來，該品種的培育填補了楊樹彩葉品種的空白。轉錄組數據表明，許多與花青素合成相關結構基因表達量的上調使全紅楊葉片呈現鮮艷的紫紅色，使該品種具備更高的觀賞價值，因此在園林綠化、景觀布局中發(fā)揮了重要作用。

由柵銹菌屬（Melampsora）真菌引起的楊樹葉銹病為楊樹重要病害之一。大量銹菌寄生于楊樹葉部，嚴重影響楊樹光合作用，導致寄主樹勢衰弱，進而誘發(fā)其他病蟲害侵染，可造成楊樹干重減輕2g%～32%，材積損失31 %～42%。美洲黑楊及其歐美楊雜交種對國內普遍流行的楊樹葉銹病菌（M. larici-populina Kleb.）分別表現為免疫和中抗狀態(tài)，但近年來，北美柵銹菌（Melampsoramedusae Thum）入侵導致美州楊及其雜交種發(fā)病嚴重，并在國內廣泛傳播，對楊樹產業(yè)和國土生態(tài)安全造成了不良影響。

相比2025楊，紅葉楊田間發(fā)病輕而且晚，大多出現在10月初期；而2025楊發(fā)病大多出現在9月初期，其幼葉也呈紫紅色，通常不發(fā)病。為分析二者抗銹性差異，本研究選擇廣泛栽培的紅葉楊品種“全紅楊”為研究對象，以其親本2025楊為對照，通過人工接種M. medusae后，統計銹菌發(fā)病率，采用化學組織染色法觀察葉肉組織內銹菌的侵染進程以及結合qRT-PCR技術測定銹菌的基因表達量，測定楊樹葉片的活性氧含量和防御酶活性等生理指標的變化等方法，探究紅葉楊和2025楊對葉銹病的抗性差異和機制，以期為楊樹彩葉品種抗銹性育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

全紅楊（Populus. deltoids cv.‘Quanhong’，簡稱QHY）和2025楊（P．deltoides cv.‘Zhonglin 2025’，簡稱L2025）1年生苗木購自河南商丘中興苗木有限公司，培養(yǎng)于溫室，相對濕度50%～60%，溫度25℃。

北美柵銹菌（M. medusae，簡稱mmd）單孢子株系采自陜西省寶雞市麟游縣，由西北農林科技大學林學院森林病理實驗室保存。

1.2 夏孢子接種和病情指數測定

參考沈闊型9）的方法進行人工接種，利用太白楊（P．purdomii Rehd）擴繁銹菌并收集夏孢子，制備終濃度為1 × 106 cfu·mL-1的孢子懸浮液，均勻噴施至健康生長的1年生全紅楊和2025楊的葉片上，至葉片有水滴流下，均選擇葉間隔期指數（LPI，leaf Plastochron index） 5～8的葉片，

以噴施等量無菌水為對照，每個樹種接種5株，每株接種3個葉片，置于黑暗條件下保濕24 h后解除黑暗，轉為常規(guī)培養(yǎng)，相對濕度50%～60%，溫度25℃。每天觀察葉片發(fā)病情況，接種8d后統計孢子堆密度，確定寄主反應型，每個處理15個重復。寄主反應型分級標準參考曹支敏等的方法，見表1。

1.3 侵染葉片的組織學染色

參考朱書生等的方法稍作改動：取接種銹菌的紅葉楊與2025楊葉片，剪成1 cm × 1 cm大小的15個方形葉盤置于50 mL離心管中。首先在離心管內加入20 mL 100 g·L-1 KOH溶液至完全浸泡葉片，90℃水浴5 min，后用無菌水沖洗干凈；而后加入20 mL 30% H202溶液漂白5 min，后用無菌水沖洗葉表；最后加乳酸于室溫下酸化5 min。加入苯胺藍染液避光染色3～5 min，染色結束后用無菌水清洗葉片表面，清洗后將葉片浸泡人乳酸甘油（1：1）中，室溫脫色12 h。用顯微鏡觀察其菌落的染色情況并統計染色區(qū)域面積，計算銹菌侵入率：P=（m／M）×100%，式中：P為銹菌侵入率，m為視野內深色區(qū)域面積，M為顯微鏡觀察時視野總面積。

1.4 小麥胚芽凝集素（WGA-Alexa 488）熒光染色

銹菌發(fā)育過程的染色參考莊華的方法稍作改動：采用1.2的方法對兩種楊樹接種銹菌夏孢子，在接種后24、48、96、168 h分別采集葉片樣本，放置于固定透明液（乙醇：冰醋酸體積比=1：1）進行脫色，使葉盤綠色完全脫去；將透明過的葉盤用50%的乙醇沖洗1次后蒸餾水漂洗3次，棄去蒸餾水，加入1.5 mL 1 mol·L-1 KOH，高溫高壓處理（121℃，103.4 kPa）5 min使葉片纖維組織變軟，葉肉完全脫去；處理后的樣品用蒸餾水漂洗并轉入新的離心管中，加入10 mL50 mmol·L-1 Tris-HCI（pH=7.0～7.4）緩沖液，浸泡30 min，棄去緩沖液；用20 μg·mL-1的WGA-Alexa 488熒光染料避光染色2h以上，用蒸餾水漂洗3次后用50%甘油保存。處理后樣品的在熒光顯微鏡（Olympus BX-53）下對病菌侵染結構及生長狀況進行觀察（激發(fā)光波長450～480 nm，發(fā)射光波長515 nm），每個處理15個重復。

1.5 葉肉中銹菌基因表達量測定

參考ZHENG等的方法，選取在銹菌中穩(wěn)定表達的ITS區(qū)域序列設計特異性引物，采用1.2的方法對兩種楊樹接種銹菌夏孢子，于Oh（未接種）、24、48、96、168 h采集葉片進行實時熒光定量PCR反應。使用Primer軟件設計兩對特異性引物：ITS-Mmd-F/ITS-Mmd-R（目的基因）和Q-TUB-Fla-TUB-R（內參基因），引物序列見表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用2-△△CT法進行相對表達量分析，每處理5個生物學重復I14l。

所用試劑有：植物總RNA提取試劑盒為Omega E.Z.N.A.Plant RNA Kit;反轉錄試劑盒Hifair@V one-step RT-gDNA digestion SuperMixfor qRT-PCR、實時熒光定量試劑Hieff UNICONRUniversal Blue qRT-PCR SYBR Green MasterMix均購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。微量核酸蛋白質分析儀為NANODROP ONE；反應所用儀器為美國伯樂CFX connect。

1.6 生理指標測定

參考《植物生理學指導》。采用1.2的方法對兩種楊樹接種銹菌夏孢子，于Oh（未接種）、24、48、96、168 h采集葉片樣品，錫紙包裹后放入液氮速凍，后轉移至-80℃超低溫冰箱待測。H202含量測定采用鈦復合物測定法、02-含量測定采用羥胺氧化法、過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法、過氧化氫酶（CAT）活性利用H202的減少量表示，每處理5個生物學重復。

1.7 數據統計與分析

采用Microsoft Excel對試驗數據進行統計整理，利用SPSS Statistics 22.0對數據進行分析，采用一元方差分析（ANOVA）和Duncan’s多重范圍檢驗進行組間的顯著差異分析（p＜0.05），最后用Origin 2021進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 紅葉楊與2025楊人工接種反應比較

室內接種后對兩種楊樹的潛育期、孢子堆密度和病情指數進行調查統計，見表3。結果發(fā)現接種銹菌后，兩種楊樹均未出現褪綠或過敏性壞死反應；全紅楊在第7天發(fā)病，而2025楊在第6天發(fā)病，全紅楊發(fā)病速度慢于2025楊；全紅楊產孢量較少，每平方厘米葉片上約12.6個孢子堆，夏孢子堆中等大小，多散生（圖1a）；而2025楊產孢量多，每平方厘米葉片上約29.2個孢子堆，夏孢子堆大而密（圖1b），常連接成片。參考表1的反應型分級標準，全紅楊表現為中感反應（4級），2025楊則表現為高感反應（5級）。苯胺藍染色結果表明，接種7天后，全紅楊葉肉組織中藍色菌體結構明顯少于2025楊。統計染色區(qū)域侵染率結果表明，全紅楊中銹菌侵染率（14.8%）低于2025楊（26.3%）。全紅楊比2025楊發(fā)病更輕，表現為推遲發(fā)病、孢子堆密度小以及侵染率低。

2.2 北美柵銹菌在紅葉楊和2025楊中侵染過程比較

為進一步了解銹菌夏孢子侵染全紅楊和2025楊的過程和特征，對侵染不同階段的葉肉組織內的銹菌菌體結構進行染色，顯微觀察如圖2所示，銹菌夏孢子在楊樹葉片表面萌發(fā)并產生芽管，并在接種1d （24h）后成功從葉片氣孔入侵（圖2a、e）；2d （48h）后銹菌開始在葉肉細胞內發(fā)育產生大量侵染菌絲并侵染鄰近細胞（圖2b、f）；接種4d （96 h）后菌絲大量繁殖（圖2c、g）；2025楊在接種6d （144 h）后開始產孢，可以觀察到夏孢子堆（圖2d），而全紅楊在接種7d （168d）后開始產孢（圖2h）。銹菌在侵染前期在兩種楊樹中的侵染進程基本保持一致，但在2025楊中能更快產孢，且在發(fā)育過程中形成的菌絲團和孢子堆都較全紅楊大、產孢量多。

2.3 葉肉組織中銹菌基因表達量比較

圖3結果表明，接種銹菌后，隨著時間的推移，銹菌在兩種楊樹葉肉細胞中的基因表達量均逐漸升高，2025楊中銹菌的基因表達量高于全紅楊，且在接種銹菌后4 d（96 h）后到和第7d （168h）銹菌在2025楊中的表達量顯著高于全紅楊（p＜0.01），整體發(fā)育過程中，2025楊中表達量均高于全紅楊，說明銹菌在2025楊葉肉組織內能夠更快的發(fā)育繁殖。

2.4 紅葉楊和2025楊對銹菌的抗氧化活性指標比較

2.4.1 接種銹菌后兩種楊樹活性氧含量的比較

測定兩種楊樹接種銹菌后的H2O2和O2-含量如圖4所示，接種前（0h）健康植株中全紅楊的H2O2和O2-含量均低于2025楊，接種銹菌后24 h內，全紅楊中的H2O2含量迅速升高，而后趨于平緩；2025楊中接種前期H2O2含量未發(fā)生明顯變化，24 h后開始升高，96 h達到峰值，而后開始下降。O2-含量在兩種楊樹感病過程中的變化趨勢呈相反狀態(tài)，全紅楊中O2-含量在接種銹菌后開始下降，48 h后開始逐漸上升，96 h后大幅增長，而2025楊在接種前期02-含量升高，48 h開始下降。

2.4.2 接種銹菌后兩種楊樹抗氧化酶活性動態(tài)變化比較

測定兩種楊樹接種銹菌后的抗氧化酶活性結果如圖5所示，接種前（0h）健康植株中全紅楊的POD酶活性高于2025楊，接種銹菌后兩種楊樹的POD酶活性變化一致，均呈現先上升后下降的趨勢，但紅葉楊中的POD酶活性高于2025楊，接種病原24 h內，全紅楊和2025楊POD酶活性均迅速升高，并在24 h達到峰值，24 h后開始下降，但全紅楊中POD酶活性始終處于較高水平。全紅楊中接種前（0 h） CAT酶活性低于2025楊，但二者的變化趨勢總體一致，接種銹菌后24 h內兩種楊樹的CAT酶活性均開始上升，且全紅楊漲幅高，在接種后24 h達到峰值，而后開始下降，在病程中期紅葉楊中CAT酶活性高于2025楊。接種前（0h）健康植株中全紅楊的SOD酶活性高于2025楊，接種銹菌后兩種楊樹中SOD酶活性變化趨勢與POD酶相似，均呈現先升高后降低最后趨于平緩的趨勢，兩者均在接種后24 h達到峰值，而后開始下降，但全紅楊中SOD活性始終高于2025楊，且在發(fā)病初期增幅更大。在整個病程中，全紅楊的3種抗氧化酶活性總體水平均高于2025楊。

3 討論

抗病性鑒定是抗病育種與植物資源評價工作的重要依據。本研究采用孢子懸液噴施活體植株對全紅楊和2025楊的抗銹性進行了鑒定，表明兩種楊樹均為感病品種，但全紅楊發(fā)病較輕，二者在表型上的差異主要表現在孢子堆密度、孢子堆大小方面，全紅楊較2025楊發(fā)病更遲、夏孢子堆密度更小。

本研究兩種染色結果顯示，銹菌在2025楊中相較全紅楊有更高的侵染率，成功入侵后能發(fā)育繁殖產生更多的侵染菌絲，產孢量也更高。對葉肉組織內的銹菌的基因表達量進行定量測定結果表明，銹菌入侵葉片后開始發(fā)育繁殖，在整體病程中呈現逐漸增加的趨勢，而銹菌入侵后在2025楊葉肉組織內發(fā)育繁殖速度比全紅楊中更快，這與Zheng等在太白楊中接種M. larici-populina的葉肉組織中菌體生物量變化趨勢一致。銹菌入侵植物細胞后發(fā)育繁殖需要吸收寄主大量營養(yǎng)，然而前期研究表明全紅楊中花青素含量遠高于2025楊，而植物光合作用所需色素葉綠素a和葉綠素b均低于2025楊，這會嚴重影響全紅楊的光合速率和能量積累，高苗琴等的研究也證實了這一點，因此全紅楊中較低的營養(yǎng)水平可能也是制約銹菌在葉肉組織中發(fā)育繁殖速度的因素之一，這還有待進一步研究。

ROS是一系列化學性質活躍的氧化合物小分子的統稱，其不僅是簡單的毒性代謝產物，還可以作為信號分子參與植物體內的代謝活動，在植物免疫防衛(wèi)反應中起著重要的作用。本研究發(fā)現，全紅楊在接種初期H2O2含量增加，在侵染24 h后積累速度逐漸達到穩(wěn)態(tài)；2025楊在病程中O2-含量始終保持較高水平，而全紅楊中在接種初期就呈現下降趨勢，與陳祖靜等在美洲黑楊接種松-楊柵銹菌的抗性反應一致。在植物防衛(wèi)病原物侵染的防御機制中，受病原菌的入侵寄主體內的ROS被激發(fā)，且有研究表明楊樹品種的抗銹性越強，ROS升高幅度越大。銹菌入侵后，2025楊較全紅楊具有更強的ROS積累能力，但二者均未出現ROS爆發(fā)的現象，且ROS積累量不足以引發(fā)細胞程序性死亡，感病葉片未出現褪綠反應。此外，正常狀態(tài)下植物體內ROS水平處于穩(wěn)定狀態(tài)．受到病原菌侵染后，ROS大量積累，導致膜質過氧化損傷。全紅楊感病前后O2-水平保持穩(wěn)定，表明全紅楊的抗氧化酶系統及高含量花青素類物質能更快平衡ROS水平，能防止細胞膜過氧化損傷，維持細胞穩(wěn)態(tài)，因此，ROS水平不同可能也是造成全紅楊與2025楊對銹菌感染出現差異的重要原因之一。

抗氧化系統是植物在長期進化過程中形成的活性氧平衡機制，SOD、POD和CAT等抗氧化酶可以清除病原物入侵后植物體內過多的ROS，有效防止細胞膜過氧化損傷，在抗病反應中起著關鍵作用。本研究中接種銹菌后，全紅楊和2025楊的POD酶活性在整個病程中呈現先上升后下降的趨勢，且全紅楊在整個病程中的POD酶活性比2025楊高，這與抗、感種源青錢柳對炭疽病的抗性響應結果一致。且有研究表明，POD可以催化植物體內酚類物質的氧化，從而對病原菌產生毒害作用，抑制其生長繁殖，證明POD活性與植物抗病性呈現正相關。而SOD酶活性在病程中的變化趨勢與POD酶活性基本一致，均隨著銹菌侵染先上升后下降，SOD可以催化超氧陰離子對H2O2和O2的歧化，代表了植物防御ROS超標造成細胞膜過氧化的第一道防線。CAT活性在接種前2025楊較高，而接種病原后全紅楊中CAT酶活性迅速升高，而后降低，這與抗性獼猴桃品種“徐香”對潰瘍病的抗性響應結果一致，此外，在甘蔗感染黑穗病菌后的生理響應測定中發(fā)現，抗病基因型的CAT活性在接種前期漲幅高，而后期酶活性變化低于感病基因型，這說明CAT在對病原物的早期防御中發(fā)揮了一定的作用。綜上，全紅楊能在應對銹菌侵染時保持較高的抗氧化酶活性，且感病初期全紅楊中抗氧化酶活性增長速率更快，這說明全紅楊相較2025楊能夠更快啟動免疫應答反應，可有效防止ROS含量過高對細胞產生毒害作用。

4 結論

本研究從表型鑒定、組織化學染色以及生理生化指標等方面比較了全紅楊和2025楊對北美柵銹菌的抗性差異，并對二者的抗病機制進行了測定、分析和討論，發(fā)現二者產生抗性差異的主要原因可能有以下幾點：全紅楊較低的營養(yǎng)水平制約了銹菌在全紅楊葉肉組織內的發(fā)育速度；全紅楊能夠在銹菌入侵后更快平衡ROS水平，維持細胞穩(wěn)態(tài)；此外全紅楊較2025楊有更高水平的抗氧化酶活性使其在應對銹菌入侵時能快啟動免疫應答反應。但紅葉楊抗病的分子機制及其與生理調控的內在聯系尚未可知，這還有待進一步研究。未來可以采用轉錄組加代謝組的多組學聯合分析手段，進一步明晰紅葉楊抗銹病的內在機制，為病害防控和彩葉楊抗病育種提供參考。

（責任編輯：崔貝）

基金項目：國家自然科學基金（No.31670650）