黃芪根部黑斑病菌的分離鑒定及培養(yǎng)特征研究

摘 要 旨在明確西北鹽堿地種植的黃芪根部黑斑病的主要致病因子。首先采用組織分離法從發(fā)病部位分離病原菌，通過純化和離體回接確定其致病菌，基于形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步研究不同培養(yǎng)條件對其生長繁殖的影響。結(jié)果表明，引起黃芪根部黑斑并導(dǎo)致斷根腐爛的致病菌主要包括三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。F.tricinctum HT2生長的最適pH、NaCl含量、碳源及氮源分別為pH 8、NaCl 2.0%、甘露醇及蛋白胨，產(chǎn)孢的最適碳氮源分別為葡萄糖和酵母粉；F.solani HT4生長的最適條件分別為pH 8、NaCl 0.0%、蔗糖及酵母粉，產(chǎn)孢的最適碳氮源分別為蔗糖和酵母粉。[JP]

關(guān)鍵詞 黃芪；黑斑?。恢虏【?；鑒定；培養(yǎng)特征

中藥材黃芪的物種多屬于豆科（Leguminosae）黃芪屬（Astragalus）的植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.var.mongholicus （Bge.） Hsiao]或膜莢黃芪[A.membranaceus （Fisch.） Bunge][1]，其多以根部入藥。黃芪根中含有多糖、黃酮和皂苷等成分，具有抗衰老、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降糖調(diào)脂、抗纖維化和抗輻射等多重功效[2-5]。目前市售的中藥材黃芪多為人工種植，在連年種植的土壤中，其根部容易出現(xiàn)腐爛、斷根現(xiàn)象，且多由黑斑病引起，導(dǎo)致黃芪質(zhì)量和產(chǎn)量嚴(yán)重下降。在中國西北地區(qū)的寧夏、甘肅和新疆等地，隨著黃芪人工種植面積的不斷擴(kuò)大，種植年限的增加以及大規(guī)模種植過程中的機(jī)械化程度的提高，黃芪根部病害問題愈發(fā)突出，尤其是黑斑病，嚴(yán)重制約了黃芪產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

關(guān)于黃芪根部病害的研究多集中在根腐病[6-10]，但黃芪黑斑病從發(fā)生部位和病癥上明顯不同于黃芪根腐病，其發(fā)病過程較為復(fù)雜，發(fā)病前期在黃芪根的中部及根尖部位出現(xiàn)大小不一的黑色斑點(diǎn)，隨時間延長斑點(diǎn)面積不斷擴(kuò)大，繼而造成斷根和腐爛。除此之外，黃芪的規(guī)?；N植采用的機(jī)械化挖苗、移栽方式導(dǎo)致黃芪根部破傷率增大，有利于病原菌入侵，加劇了黃芪黑斑病的發(fā)生。本研究對患有黑斑病的黃芪根部進(jìn)行病原菌分離、純化和離體回接，以確定致病菌；基于形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法對致病菌進(jìn)行分類鑒定；進(jìn)一步研究不同培養(yǎng)條件對其菌絲生長和孢子產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果可明確黃芪黑斑病致病菌的種類并為高效生防菌的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

2021年6-7月在寧夏吳忠、新疆鞏留縣黃芪種植基地等多處采集1 a生黃芪的正常與患黑斑病植株，觀察并記錄患病株的癥狀表現(xiàn)。

1.2 致病菌分離純化

將患黑斑病的黃芪根部用流水沖洗表面泥沙，采用常規(guī)組織分離法[3]，在無菌條件下將病變組織切割成小塊（5.0 mm×5.0 mm），于75%的酒精中浸泡5 s后取出并移至1.5%次氯酸鈉溶液中繼續(xù)消毒1 min。用無菌水沖洗3次，晾干后置于PDA平板表面，在28 ℃培養(yǎng)3～4 d，等平板上長出真菌，用接種鏟挑取單一菌落轉(zhuǎn)移至新的無菌PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)純化2～3次。將純化好的菌株分別接種在PDA斜面上培養(yǎng)， 4 ℃保存，備用。

1.3 致病菌致病性分析

采用離體根部組織回接法[11]，選擇生長狀況良好且無任何病害的1 a生黃芪根，用剪刀將其截成約5 cm長的小段。用無菌組織刀在每小段上刺出3個傷口，在超凈工作臺上用75%的酒精對其表面消毒，接種已分離純化培養(yǎng)的菌餅，將菌絲面與黃芪傷口處貼合后用保鮮膜包裹，同時接種無菌PDA培養(yǎng)基為陰性對照。每個處理重復(fù)3次，置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中于培養(yǎng)箱中 28 ℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間定期觀察，待出現(xiàn)黑斑病的典型癥狀后，對其根部組織進(jìn)行解剖拍照記錄。對所有接種后發(fā)病的處理組從發(fā)病部位再次分離病原菌，并觀察其培養(yǎng)形態(tài)、菌絲及孢子與原接種菌是否相同。

1.4 致病菌形態(tài)學(xué)鑒定

將致病菌接種至PDA平板上，培養(yǎng)5～7 d后，觀察并拍照記錄其菌落形態(tài)、菌絲顏色。使用查氏培養(yǎng)基對病原菌HT2進(jìn)行培養(yǎng)以得到其分生孢子，使用光學(xué)顯微鏡對兩株病原菌的菌絲結(jié)構(gòu)、孢子大小和孢子形態(tài)進(jìn)行觀察，根據(jù)《真菌鑒定手冊》的分類方法和標(biāo)準(zhǔn)對致病菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定[12]。

1.5 致病菌分子生物學(xué)鑒定

1.5.1致病真菌基因組DNA的提取 用無菌打孔器打取3～5塊菌餅，置于100 mL PDB培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min培養(yǎng)3～5 d，用抽濾裝置獲得菌絲，將菌絲在液氮中冷凍研磨后，參照真菌DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）中的操作步驟進(jìn)行操作。

1.5.2 真菌rDNA片段PCR擴(kuò)增、凝膠電泳、測序及序列分析 PCR引物序列為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）與ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：2×Taq酶10 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，獲取膠帶處理樣品后送至生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.5.3 rDNA序列比較分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將ITS測序結(jié)果在核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行同源序列分析比對。選擇同源性程度較高的序列進(jìn)行下載，并用Mega11.0軟件通過鄰接法（Neighbor-joining，NJ）進(jìn)行1 000次相似重復(fù)度計(jì)算并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 pH、NaCl濃度和碳氮源種類對致病菌生長的影響

探究不同pH、不同NaCl濃度和不同碳、氮源條件下致病菌菌絲的生長及產(chǎn)孢情況[13]。

1.6.1 pH對致病菌生長的影響 分別用濃度為0.1 mol/L HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)，制成pH分別為5、6、7、8、9、10的PDA平板，用直徑5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅后接至PDA平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理重復(fù)3次。

1.6.2 NaCl含量對致病菌生長的影響 制成NaCl含量分別為0.0%、0.5%、1.0%、2.0%、 3.0%、4.0%的PDA平板。用直徑5 mm打孔器在長好致病菌培養(yǎng)基平板上的菌落邊緣打取菌餅，小心接至各PDA平板上，置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d后用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理重復(fù)3次。

1.6.3 不同碳氮源對致病菌生長的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等質(zhì)量的葡萄糖、甘露醇、淀粉代替原培養(yǎng)基中的蔗糖進(jìn)行最優(yōu)碳源的篩選。在培養(yǎng)基中接種菌餅，在28 ℃，180 r/min下培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計(jì)菌絲干質(zhì)量。以獲取的最優(yōu)碳源組成的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等質(zhì)量的酵母粉、蛋白胨及硫酸銨代替原培養(yǎng)基中的硝酸鈉篩選最優(yōu)氮源。在相同條件下培養(yǎng) 5 d后統(tǒng)計(jì)菌絲干質(zhì)量。每個處理重復(fù)3次。

1.7 碳氮源種類對致病菌產(chǎn)孢的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等質(zhì)量的葡萄糖、甘露醇、淀粉代替原培養(yǎng)基中的蔗糖進(jìn)行最優(yōu)碳源的篩選。在培養(yǎng)基中接種相同大小菌餅的致病菌，在28 ℃，180 r/min培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量。以最優(yōu)碳源組成的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等質(zhì)量的酵母粉、蛋白胨及硫酸銨代替原培養(yǎng)基中的硝酸鈉來篩選最優(yōu)氮源。在相同條件下培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量。每個處理重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Graphpad Prism 9作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪黑斑病癥狀

生長良好的黃芪根部表面光滑，通體淡黃透白，有單根或多須毛根。典型黑斑病的發(fā)病部位主要集中在根尖和根中部，多在根部被機(jī)械損傷處或挖苗時的截?cái)嗵帲l(fā)病處組織顏色呈黑色（發(fā)病組織內(nèi)部初期發(fā)紅）、干枯、成疤、向下洼陷，嚴(yán)重者導(dǎo)致斷根或腐爛。不僅影響植株正常生長發(fā)育，成品后還在根部留有瘢痕，或根部斷根潰爛（圖1）。

2.2 致病菌的分離純化及致病性測定

經(jīng)組織分離和致病性試驗(yàn)，得到兩株具有較強(qiáng)致病性的病原菌菌株HT2與HT4（圖2）。對照組織呈粉紅色，接種HT2和HT4菌餅的組織均出現(xiàn)發(fā)紅、變黑和腐爛現(xiàn)象，與原始病株的發(fā)病癥狀基本一致；從發(fā)病部位分別分離到相同的病原菌。表明HT2與HT4是引起黃芪黑斑病的主要致病菌。

2.3 致病菌的形態(tài)學(xué)特征

2.3.1 致病菌菌落形態(tài)觀察 如圖3所示，HT2致病菌在PDA上菌絲呈致密絨毛狀，基內(nèi)菌絲多為紫紅色，氣生菌絲為白色，從中心處向外呈現(xiàn)出由黃變粉的顏色改變，從側(cè)面圖可以看出，HT2菌絲致密突出，培養(yǎng)平板背面呈現(xiàn)紅色；HT4致病菌在PDA上菌絲為致密羽毛狀，菌絲為白色帶有淡黃色，菌落菌絲以接種點(diǎn)為中心向四周呈規(guī)則圓形擴(kuò)散，從側(cè)面圖可以看出，HT4菌絲茂密但貼壁生長，培養(yǎng)基背面色素顏色不 明顯。

2.3.2 致病菌顯微形態(tài)觀察 如圖4所示為HT2和HT4的菌絲及分生孢子形態(tài)。HT2菌絲細(xì)長平滑有隔膜，菌絲透明（圖4-A），HT2在察氏培養(yǎng)基中有分生孢子產(chǎn)生，分生孢子呈短棒狀，大小在200～500 μm（圖4-C）。HT4菌絲細(xì)長，分枝較多，有隔膜（圖4-B），其在PDA培養(yǎng)基中就有分生孢子產(chǎn)生，其孢子形態(tài)呈鐮刀狀或短臘腸形，大小不一（圖4-D）。

2.4 致病菌的分子生物學(xué)鑒定

將兩種致病菌的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Nucleotide Blast比對，使用Mega 7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。HT2與Fusarium tricinctum具有100%的相似性，最終確定黃芪黑斑病的致病菌HT2為三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）。HT4與Fusarium solani具有99%的相似性，最終確定黃芪黑斑病致病菌HT4為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。

2.5 pH、鹽濃度、碳氮源種類對致病菌生長的影響

2.5.1 pH對致病菌生長的影響 觀察發(fā)現(xiàn)致病菌HT2與HT4在pH為5～10的培養(yǎng)基上均能生長。致病菌HT2在pH為8的平板上生長速度最快，4 d時菌落直徑為4.5 cm。致病菌HT4在pH為8時生長速度最快，4 d時菌落直徑為6.4 cm（圖6）。

2.5.2 鹽度對致病菌生長的影響 觀察發(fā)現(xiàn)致病菌HT2在不同NaCl含量的平板上均能生長。培養(yǎng)2 d時，HT2在NaCl含量為0.5%的平板上的菌落直徑顯著高于其他平板（P<0.05）。培養(yǎng)5 d時，HT2在2.0%的平板上菌落直徑顯著高于其他處理組，而在不含NaCl的平板上的菌落直徑則顯著低于其他處理組，說明低鹽度可能促進(jìn)該菌的生長（圖7）。

致病菌HT4在不含NaCl的平板上的菌落直徑在不同培養(yǎng)時間均顯著高于其他處理組 （P<0.05），培養(yǎng)5 d時的菌落直徑可達(dá)6.7 cm，而在4.0%的平板上的菌落直徑均為最小。不同培養(yǎng)時間內(nèi)的HT4菌落直徑均會隨NaCl含量的增加而逐漸減小，由此可知NaCl對HT4的生長造成不利影響（圖8）。

2.5.3 不同碳氮源對致病菌菌絲生長的影響 不同碳源對HT2和HT4菌絲生長的影響如表1所示。培養(yǎng)5 d后，HT2在以甘露醇為基礎(chǔ)碳源的查氏培養(yǎng)基中獲得最大菌絲干質(zhì)量（0.43 g/100mL），顯著高于其他碳源（P<0.05）；HT4在以蔗糖為基礎(chǔ)碳源的查氏培養(yǎng)基中具有最大菌絲干質(zhì)量，為0.41 g/100mL，顯著高于其他碳源（P<0.05）。

不同氮源對HT2和HT4菌絲生長的影響如表2所示。以表1數(shù)據(jù)為依據(jù)，分別得到了致病菌HT2與HT4最適菌絲生長碳源為甘露醇和蔗糖。培養(yǎng)5 d后，HT2在以酵母粉或蛋白胨為基礎(chǔ)氮源的查氏培養(yǎng)基中具有較大菌絲干質(zhì)量，分別為0.32 g/100mL和0.33 g/100mL，兩者無顯著差異（P>0.05）；培養(yǎng)5 d后，HT4在以酵母粉為基礎(chǔ)氮源的查氏培養(yǎng)基中具有最大菌絲干質(zhì)量，為5.8 g/100mL，顯著高于其他氮源 （P<0.05）。

2.6 不同碳氮源對致病菌產(chǎn)孢的影響

不同碳源對HT2和HT4產(chǎn)孢的影響結(jié)果如表3所示。在培養(yǎng)5 d后，HT2在以葡萄糖為基礎(chǔ)碳源的查氏培養(yǎng)基中產(chǎn)孢最多，孢子數(shù)達(dá)到7.6×107 CFU/mL，顯著高于其他碳源（P< 0.05）；在培養(yǎng)5 d后，HT4在以蔗糖為基礎(chǔ)碳源的查氏培養(yǎng)基中產(chǎn)孢最多，達(dá)到3.7×106 CFU/mL，顯著高于其他碳源（P<0.05）。

不同氮源對HT2和HT4產(chǎn)孢的影響如表4所示。在培養(yǎng)5 d后，HT2在以酵母粉為基礎(chǔ)氮源的查氏培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生孢子，產(chǎn)孢量達(dá)到 1.3×107CFU/mL，在其他氮源的培養(yǎng)基中均無孢子產(chǎn)生；在培養(yǎng)5 d后，HT4在以（NH4）2SO4為基礎(chǔ)氮源的培養(yǎng)基中無孢子產(chǎn)生，在其他3種氮源培養(yǎng)基均可產(chǎn)孢。其中在以酵母粉為氮源的查氏培養(yǎng)基中產(chǎn)孢最多，為2.0×107CFU/mL，顯著高于其他氮源（P<0.05）。

3 討 論

在田間，患黑斑病黃芪根部會出現(xiàn)面積大小不同的黑色斑點(diǎn)，嚴(yán)重時導(dǎo)致植株死亡，造成損失。本研究結(jié)果表明，引起黃芪根部黑斑病的主要致病菌為鐮刀屬（Fusarium spp.）的三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。三線鐮刀菌作為引起黃連、苜蓿等作物根部病害的主要致病菌被研究報(bào)道過[14-15]，但其引起黃芪根部黑斑病為本研究首次發(fā)現(xiàn)。腐皮鐮刀菌為最常見的植物根腐病致病菌，能夠引起人參、生姜、甘薯和當(dāng)歸[16-19]等作物根腐病的發(fā)生，腐皮鐮刀菌作為引起根莖類作物根部病害最為常見的病原菌之一，在黃芪黑斑病的防治中應(yīng)引起重視。

對兩株致病菌的培養(yǎng)條件研究時發(fā)現(xiàn)，這兩株真菌都能夠耐受一定程度的鹽堿脅迫，pH為8、NaCl含量為2.0%的堿性含鹽培養(yǎng)基更適宜三線鐮刀菌HT2的生長，pH為8、不含NaCl的堿性無鹽培養(yǎng)基更適宜腐皮鐮刀菌HT4的生長。由結(jié)果可知，腐皮鐮刀菌HT4隨培養(yǎng)基中NaCl含量的增加而生長減慢，但其在高NaCl含量（4.0%）的培養(yǎng)基仍可以形成一定直徑的菌落，說明其具有一定的鹽堿耐受性。由此可知，鹽堿土壤為這些致病真菌提供了更適宜的生長環(huán)境。

土壤鹽漬化和酸漬化被認(rèn)為是導(dǎo)致三七連作障礙的主要原因之一[20]，馬超等[21]的研究也發(fā)現(xiàn)土壤鹽漬化會通過影響青枯菌在土壤中的存活能力來影響作物青枯病的發(fā)病率，Haddoudi等[22]通過對蠶豆根腐病病原菌在鹽脅迫下的體外生長情況及對植株侵染率的探究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫會促進(jìn)病原菌的生長，提高病原菌對植株的侵染率而增加根腐病的發(fā)病率。土壤鹽堿化除會通過直接影響病原微生物的生存及其對植株的侵染率加劇植物病害的發(fā)生外，還會通過影響植物自身的生理和防御反應(yīng)來影響植物與病原體之間的相互作用，進(jìn)而加劇病害的發(fā)生。

綜上，鹽堿地黃芪種植過程中黑斑病的頻發(fā)可能受到多方面因素的影響，但黑斑病病原菌對鹽堿環(huán)境的耐受性可能是加劇黃芪黑斑病發(fā)生的主要原因。因此在后續(xù)對鹽堿地種植的黃芪根部黑斑病的防治中，注重對鹽堿土壤的改良可能會對黑斑病的防治起到事半功倍的效果。

目前，根莖類中草藥種植的病害問題仍以根部病害問題為主，明確病害發(fā)生的根本原因是進(jìn)行病害防治最為關(guān)鍵的步驟之一，通過本研究明確了引起黃芪黑斑病的病因，為黑斑病的防治奠定了基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中將尋找高效且綠色的生物防治手段。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：283-284.

Chinese Pharmacopoeia Commission.Chinese Pharmacopoeia[M].Beijing：China Medical Science Press，2010：283-284.

[2]劉旭峰，馮 佳，王述進(jìn)，等.黃芪多糖對糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激和自噬的影響及機(jī)制[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，54（3）：343-351.

LIU X F，F(xiàn)ENG J，WANG SH J，et al. Effect and mechanism of Astragalus polysaccharide on oxidative stress and autophagy in diabetic nephropathy rats[J].Journal of Shanxi Medical University，2023，54（3）：343-351.

[3]劉建華，孔麗宇，萬建偉，等.兩種黃酮對HepG-2肝癌細(xì)胞增殖抑制作用的對比研究[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2022， 43（5）：346-348.

LIU J H，KONG L Y，WANG J W，et al.Comparative study on the inhibitory effects of two flavonoids on the proliferation of HepG-2 hepatoma cells[J].Journal of Jilin Medical College，2022，43（5）：346-348.

[4]LI Z，QI J，GUO T，et al.Research progress of Astragalus membranaceus in treating peritoneal metastatic cancer[J].Journal of Ethnopharmacology，2023，305：116086.

[5]REN C，ZHAO X，LIU K，et al.Research progress of natural medicine Astragalus mongholicus Bunge in treatment of myocardial fibrosis[J].Journal of Ethnopharmacology，2023，305：116128.

[6]張愛梅，李曦冉，郭保民，等.黃芪根腐病生防菌株的篩選鑒定及其防效評價[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，30（12）：1905-1913.

ZHANG A M，LI X R，GUO B M，et al.Screening，identification，and biocontrol effect of antagonistic bacteria against Astragalus membranaceus root rot[J].Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2021，30（12）：1905-1913.

[7]沈煜鎧，李昭煜，李佳佳，等.黃芪根腐病菌分離鑒定及細(xì)胞壁降解酶活性比較[J].蘭州交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，40（3）：101-109，132.

SHEN Y K，LI ZH Y，LI J J，et al.Isolation and identification of Astragalus membranaceus var.root rot and comparison of cell wall degrading enzyme activities[J].Journal of Lanzhou Jiaotong University，2021，40（3）：101-109，132.

[8]高 芬，趙曉霞，秦雪梅，等.山西省蒙古黃芪根腐病優(yōu)勢致病菌群分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2018，45（4）：878-885.

GAO F，ZHAO X X，QIN X M，et al.Analysis of dominant pathogen community causing Astragalus membranaceus var.mongholicus root rot in Shanxi province[J].Journal of Plant Protection，2018，45（4）：878-885.

[9]牛世全，趙 丹，豆建濤，等.敦煌鹽堿土中抗黃芪根腐病放線菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，54（3）：71-76.

NIU SH Q，ZHAO D，DOU J T，et al.Screening，identification and optimization of fermentation conditions of actinomycetes on Astragalus membranaceus root rot isolated from saline-alkali soils in Dunhuang[J].Journal of Northwest Normal University（Natural Science），2018，54（3）：71-76.

[10] 馬桂花，段曉明，徐文華，等.蒙古黃芪根腐病病原鑒定及防治藥劑室內(nèi)篩選[J].草地學(xué)報(bào)，2022，30（5）：1122-1130.

MA G H，DUAN X M，XU W H，et al.Identification and laboratory screening of chemical agents of root rot pathogens of Astragalus mongolicus var.mongholicus[J].Acta Agrestia Sinica，2022，30（5）：1122-1130.

[11]張永芳，曹 捷，李 俠，等.黃芪不同部位營養(yǎng)成分比較[J].山西大同大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，38（4）：5-7，21.

ZHANG Y F，CAO J，LI X，et al.Comparison of nutritional components in different parts of Astragalus membranaceus[J].Journal of Shanxi Datong University（Natural Science Edition），2022，38（4）：5-7，21.

[12]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

WEI J CH.Fungal Identification Manual[M].Shanghai：Shanghai Scientific and Technical Publishers，1979.

[13]張曉云，李維蛟.黃花蒿煙草醋液對三線鐮刀菌生長的抑制作用[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2020，36（1）：131-134.

ZHANG X Y，LI W J.Inhibitory effect of Artemisia annua tobacco vinegar on the growth of Fusarium tricinctum[J].China Agronomy Bulletin，2020，36（1）：131-134.

[14]伍曉麗，王 鈺，劉 飛，等.黃連根腐病鐮刀菌屬病原真菌鑒定[J].中國中藥雜志，2020，45（6）：1323-1328.

WU X L，WANG Y，LIU F，et al.Identification of Coptis chinensis root rot disease pathogenic Fusarium spp.fungi[J].China Journal of Materia Medica，2020，45（6）：1323-1328.

[15]李敏權(quán)，柴兆祥，李金花，等.定西地區(qū)苜蓿根和根頸腐爛病病原研究[J].草地學(xué)報(bào)，2003，11（1）：83-86.

LI M Q，CHAI ZH X，LI J H，et al.Study on the pathogen of alfalfa root a35735f38b25e74e3711bf8c1dfbb0bf7nd root rot in Dingxi area[J].Journal of Grassland，2003，11（1）：83-86.

[16]馮 琳，孫 茹，趙貴佳，等.腐皮鐮刀菌對人參根部生理變化的響應(yīng)機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2022，60（5）：1209-1216.

FENG L，SUN R，ZHAO G J，et al.Response mechanism of Fusarium putrescens to physiological changes of ginseng root[J].Journal of Jilin University（Science Edition），2022，60（5）：1209-1216.

[17]周 潔，張玲玲，朱永興，等.生姜腐皮鐮刀菌的分離鑒定及PCR快速檢測方法構(gòu)建[J].植物病理學(xué)報(bào)，2022， 52（4）：681-690.

ZHOU J，ZHANG L L，ZHU Y X，et al.Isolation and identification of Fusarium solani and construction of PCR rapid detection method[J].Journal of Plant Pathology，2022，52（4）：681-690.

[18]ZHANG Z，ZHANG W，WANG X，et al.Isolation and identification of antagonistic bacteria of Angelica root rot and their mechanism as biological control[J].Biological Control，2023，177：105120.

[19]KIM S，KIM T H，CHUNG M N，et al.Incidence rates of root rot in sweetpotato caused by cultivation soil and soil microorganisms during storage periods[J].Frontiers in Plant Science，2022，13：1178.

[20]孫雪婷，李 磊，龍光強(qiáng)，等.三七連作障礙研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)雜志，2015，34（3）：885-893.

SUN X T，LI L，LONG G Q，et al.The progress and prospect on consecutive monoculture problems of Panax notoginseng[J].Chinese Journal of Ecology，2015，34（3）：885-893.

[21]馬 超，楊欣潤，江高飛，等.病原青枯菌土壤存活的影響因素研究進(jìn)展[J].土壤學(xué)報(bào)，2021，58（6）：1359-1367.

MA CH，YANG X R，JIANG G F，et al.Research progresses on key factors affecting survival of Ralstonia solanacearum in soils[J].Acta Pedologica Sinica，2021， 58（6）：1359-1367.

[22]HADDOUDI I，MHADHBI H，GARGOURI M，et al.Occurrence of fungal diseases in faba bean （Vicia faba L.） under salt and drought stress[J].European Journal of Plant Pathology，2021，159：385-398.

Isolation，Identification and Cultivation Characteristics of Black-spot Disease Pathogen in Roots of Astragalus membranaceus

ZHANG Xiaochen1，LIANG Jian1，2，WANG Qiaoxia1，YANG Jinhui3，SUN Jiahao1，YANG Quansheng4 and MA Xiaokui1

（1.Key Laboratory of Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China，Shaanxi Normal University， Xi’an 710055，China; 2.College of Biology and Geography，Yili Normal University，Yining Xinjiang 835000，China;3.College of Modern Agricultural，Changchun Vocational and Technical College，Changchun 130504，China；4.Ningxia Tuoming Agricultural Development Corporation，Wuzhong Ningxia 751503，China）

Abstract The aim of this study is to identify main pathogenic factors of black spot disease in the roots of Astragalus membranaceus in saline-alkali areas of northwest China.In this study，potential fungal pathogens were isolated and purified from the tissue blocks of the diseased parts of root of A.membranaceus in large-scale planting.The taxonomic identification of the obtained pathogens were conducted using the morphological and molecular biological methods.The effects of different culture conditions on the growth and reproduction of the determined pathogenic fungi were further investigated.The results showed that Fusarium tricinctum HT2 and Fusarium solani HT4 were determined to be the main pathogenic fungi causing black spots on the roots of A.membranaceus.The conditions of pH 8，NaCl 2%，mannitol as carbon source，and peptone as nitro9244aca15557589faabcb11e41c44d29gen source were conducive to the growth of F.tricitrium HT2，and the optimum carbon and nitrogen source for sporulation of F.tricitrium HT2 were glucose and yeast powder，respectively.The conditions of pH 8，NaCl 0，sucrose as carbon source and yeast powder as nitrogen source were conducive to the growth of F.solani HT4 and the optimum carbon and nitrogen sources for sporulation were sucrose and yeast powder，respectively.

Key words Astragalus membranaceus; Black-spot disease; Pathogen; Identification; Culture characteristics

Received 2023-03-09 Returned 2023-06-05

Foundation item Natural Science Foundation of Xinjing Uygur Autonomous Region （No.2022D01C458） ; Funds of Ningxia Tuoming Agricultural Co.，Ltd.（No.2021064）.

First author ZHANG Xiaochen，female，master student.Research area：fermentation and environmental microorganism.E-mail：ZXiaochen228@163.com

Corresponding author MA Xiaokui，male，associate professor.Research area：microbiology and biological control of medicinal plants，and exploration of molecular mechanisms for the synthesis of natural metabolites of medicinal fungi.E-mail：bioma2003@163.com

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2022D01C458）；寧夏拓明農(nóng)業(yè)有限公司資金及場地支持（2021064）。

第一作者：張曉塵，女，研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵與環(huán)境微生物。E-mail：ZXiaochen228@163.com

通信作者：馬小魁，男，副教授，主要從事藥用植物的生物防治及藥用真菌天然代謝產(chǎn)物合成的分子機(jī)制研究。E-mail：bioma2003@163.com