• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    棘孢木霉TspyrG基因選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化體系的建立

    2024-11-02 00:00:00范莉莉韋潤(rùn)玲傅科鶴劉文濤時(shí)晶

    摘 要 旨在從棘孢木霉Ts93中克隆獲得尿嘧啶合成關(guān)鍵酶乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因(TspyrG),該基因無內(nèi)含子,開放式閱讀框大小為1 140 bp,編碼1個(gè)379氨基酸的蛋白。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù),獲得棘孢木霉Ts93 TspyrG基因缺失突變株ΔTspyrG,突變株在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)。同時(shí),以PCAMBIA1300質(zhì)粒為骨架,構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體1300pyrG。以ΔTspyrG突變株為受體菌,成功構(gòu)建以尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷為選擇標(biāo)記的木霉菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。對(duì)綠色熒光蛋白(eGFP)的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明,該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率與抗生素選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)無明顯差異。

    關(guān)鍵詞 棘孢木霉;營(yíng)養(yǎng)缺陷型;農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

    木霉是土壤中廣泛分布的一種絲狀真菌,經(jīng)過近一個(gè)世紀(jì)的研究,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這類菌株在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抑制病原菌、誘導(dǎo)植物抗性等方面都具有明顯效果,是一種應(yīng)用廣泛的生防菌[1-2]。同時(shí),木霉菌具有生長(zhǎng)迅速、基因組小、分生孢子為單倍體、分子遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn),有利于分子操作[3]。目前對(duì)木霉菌的分子操作主要選擇抗生素作為篩選標(biāo)記,如潮霉素、G418[4]等??股剡x擇標(biāo)記由于成本高、環(huán)境污染大等缺點(diǎn),不適于大規(guī)模突變株庫(kù)的構(gòu)建[5]。營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記是較好的代替方案[6-8],在酵母中已報(bào)道多種編碼營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)酶的基因,特別是氨基酸合成(如L-組氨酸、L-亮氨酸、L-色氨酸等)相關(guān)酶[9]。其中乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶(EC:4.1.1.23)基因(pyrG)是常用的篩選標(biāo)記。乳清苷-5′-磷酸脫羧酶是尿嘧啶核苷酸合成途徑中一種關(guān)鍵酶,缺失該酶的突變株無法合成尿嘧啶,需要外源補(bǔ)充;同時(shí),該酶可以將5-氟乳清酸(5-FOA)催化為5-氟乳清苷酸(5-FUMP),5-氟乳清苷酸具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,導(dǎo)致含有pyrG基因的野生株不能在含有5-FOA的培養(yǎng)基中存活。因此5′-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶可以作為遺傳轉(zhuǎn)化的正向反向篩選標(biāo)記[10]。

    隨著生物信息學(xué)技術(shù)在基因功能預(yù)測(cè)方面展示明顯優(yōu)勢(shì),功能基因的篩選已經(jīng)有很強(qiáng)的預(yù)見性。但是,對(duì)于新功能基因的篩選,或者某些已知功能基因的新功能開發(fā)方面,突變株庫(kù)構(gòu)建及篩選仍具有明顯優(yōu)勢(shì)。目前,絲狀真菌中最常用的轉(zhuǎn)化方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium-mediated transformation,ATMT)[11]。經(jīng)過20多年的完善,ATMT已成功應(yīng)用于50多種絲狀真菌的轉(zhuǎn)化[12]。而木霉菌的ATMT轉(zhuǎn)化具有效率高、單拷貝插入概念高等優(yōu)勢(shì)。另外,突變株庫(kù)的構(gòu)建需要廉價(jià)、高效、安全的選擇標(biāo)記。本研究在前期以潮霉、G418作為篩選標(biāo)記的木霉菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建以TspyrG基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系,以棘孢木霉(Trichoderma asperellum)為受體,探討無抗生素篩選標(biāo)記的突變株庫(kù)構(gòu)建的可行性。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與質(zhì)粒

    棘孢木霉Ts93,南昌師范學(xué)院生科院真菌分子遺傳實(shí)驗(yàn)室分離純化,保藏在武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC NO:M2017147),該菌株已完成全基因組測(cè)序。質(zhì)粒PCAMBIA1300、 eGFP、eYFP,南昌師范學(xué)院生科院真菌分子遺傳實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

    PCR相關(guān)酶、內(nèi)切酶、T4連接酶等購(gòu)自Takara公司。5-FOA和尿嘧啶購(gòu)自Sigma公司。5-FOA用DMSO溶解,配制成600 mg/mL母液,備用;尿苷配制成6 mg/mL水溶液過濾除菌備用。

    CA培養(yǎng)基:NaNO3 2 g/L,K2HPO4·3H2O 1 g/L,KCl 0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L,蔗糖 30 g/L,瓊脂粉 15 g/L,滅菌后按量加入尿苷至終濃度為60 mg/L。

    PDA培養(yǎng)基:去皮土豆 200 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂粉15 g/L。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 載體構(gòu)建 以NCBI下載已知的pyrG基因序列,本地BLAST搜索Ts93全基因組序列,獲取TspyrG基因序列。圖1為載體圖,載體構(gòu)建主要過程如下:以pCAMBIA1300載體為骨架,用XhoⅠ單切后自連,去除潮霉素基因。然后擴(kuò)增473 bp eYFP基因序列(只取了部分eYFP基因序列,用于后期敲除突變株的PCR驗(yàn)證,引物為XbeYFPU/BaeYFPL),通過XbaⅠ/BamHⅠ雙切后連接成1300pyrGkh;敲除載體按照同源置換方法,設(shè)計(jì)引物(表1)分別擴(kuò)增基因5′端1 079 bp同源序列(引物HiTspyrGSU/XbTspyrGSL),3′端974 bp同源序列(引物BaTspyrGXU/KpTspyrGXL),酶切連接至1300pyrGkh載體,構(gòu)建TspyrG基因敲除載體1300ΔpyrG。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增TspyrG基因ORF(引物XhTspyrGU/XhTspyrGL),以1300th載體為骨架,通過酶切連結(jié),將其中的潮霉素抗性基因ORF替換為pyrG基因的ORF,構(gòu)建TspyrG基因重組載體1300pyrG。轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)選用綠色熒光eGFP基因(引物XbeGFPU / BaeGFPL),構(gòu)建載體1300pyrGeG(圖1)。eGFP基因重組過程如下:首先將eGFP與TspyrG兩個(gè)基因分別加上啟動(dòng)子與終止子,然后在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中,由于左(left border)右(right border)邊界內(nèi)的序列都會(huì)隨機(jī)整合進(jìn)目標(biāo)菌的基因組中,所以eGFP與pyrG這兩個(gè)蛋白在各自的啟動(dòng)子下分別表達(dá)。所以,如果以TspyrG敲除突變株為受體菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化,成功的轉(zhuǎn)化子就會(huì)因?yàn)橹匦芦@得pyrG蛋白而恢復(fù)表型。而由于eGFP蛋白也成功轉(zhuǎn)入,就會(huì)使轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生熒光現(xiàn)象。

    1.3.2 ATMT轉(zhuǎn)化 PDA培養(yǎng)獲取木霉菌分生孢子,稀釋至5×105 CFU/mL,與等體積已活化含對(duì)應(yīng)載體的農(nóng)桿菌混勻,取200 μL混合液涂板,具體操作方法參見Fu等[13]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 棘孢木霉Ts93pyrG基因克隆

    于NCBI下載10個(gè)pyrG基因序列,通過本地BLAST,在 Ts93全基因組中搜索相似基因,篩選獲得TspyrG基因,該基因無內(nèi)含子,大小 1 140 bp,編碼1個(gè)379氨基酸的蛋白(NCBI登錄號(hào)OP186039),序列比對(duì)表明(圖2),該蛋白與T.asperellum的乳清苷-5-磷酸脫羧酶(NCBI登錄號(hào)GFP54067.1)相似度達(dá)到99.74%,蛋白質(zhì)含有9個(gè)高度保守motif,與該酶的功能密切 相關(guān)。

    2.2 5-FOA對(duì)Ts93菌株致死濃度確定

    5-FOA按量添加至CA培養(yǎng)基,分別配制成終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的平板,接種直徑0.5 cm的Ts93菌餅,測(cè)定對(duì)野生株的致死濃度。結(jié)果見圖3,隨著濃度的升高,菌落直徑逐漸減小,至1.2 mg/mL時(shí),Ts93完全無法生長(zhǎng),因此,為了降低突變株假陽性概率,將篩選濃度提高至1.5 mg/mL。

    2.3 TspyrG基因敲除

    通過ATMT方法進(jìn)行基因敲除,其中TspyrG基因上游片段大小為1 080 bp,下游片段為946 bp,結(jié)果見圖4-A,構(gòu)建成功的載體見圖4-B。共培養(yǎng)15個(gè)平板,挑選了33個(gè)可能的突變株。按照同源置換原理,TspyrG基因會(huì)被敲除載體中eYFP序列替換。因此,隨機(jī)挑選6個(gè)突變株提取DNA,以eYFPU/eYFPL引物,擴(kuò)增eYFP序列。結(jié)果見圖4-C,其中1、3、5、6擴(kuò)增條帶明顯。因此,挑選1號(hào)、3號(hào)兩個(gè)突變株進(jìn)行單孢分離純化,挑取DNA,通過4輪PCR進(jìn)一步確定是否為理想的TspyrG基因敲除突變株(圖4-D)。PCR驗(yàn)證突變株的原理參考Fu等[13]。結(jié)果表明,TspyrG基因敲除突變株能夠擴(kuò)增到eYFP序列,同時(shí),由于eYFP準(zhǔn)確替換了TspyrG基因,所以在該基因5′同源序列上游的引物YZTspyrGu結(jié)合eYFPL引物可以擴(kuò)增出條帶。為了排除基因成功敲除的同時(shí),會(huì)有額外的T-DNA隨機(jī)整合在基因組其他位置,從而影響其他基因的功能,通過設(shè)計(jì)T-DNA的側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。結(jié)合PCR驗(yàn)證結(jié)果,確定TspyrG基因被成功敲除,同時(shí)無額外的T-DNA整合在基因組。

    2.4 敲除突變株特性分析

    隨機(jī)挑選2個(gè)敲除突變株進(jìn)行功能分析(圖5)。在不含5-FOA與尿苷的CA培養(yǎng)基上,Ts93生長(zhǎng)正常,而兩突變株無法生長(zhǎng);添加尿苷后,Ts93與兩株突變株均能正常生長(zhǎng);而在添加了

    5-FOA、不加尿苷的培養(yǎng)基上,3個(gè)菌株均無法生長(zhǎng);同時(shí)添加5-FOA與尿苷情況下,Ts93無法生長(zhǎng),而2個(gè)突變株生長(zhǎng)正常。結(jié)果表明,敲除TspyrG基因后,菌株無法自主合成尿嘧啶,需要額外補(bǔ)充,但突變株同時(shí)具有抗5-FOA的能力(圖5)。

    為了進(jìn)一步確定該基因破壞后是否會(huì)影響菌株其他生理功能,分析突變株的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢能力(圖6)。在PDA培養(yǎng)基上,培養(yǎng)24 h后,Ts93與突變株菌落直徑均達(dá)到7.0 cm左右,三者生長(zhǎng)速度無明顯差異(P>0.05);培養(yǎng)96 h后,菌株都產(chǎn)綠色孢子,孢子量均達(dá)到107CFU/mL,三者產(chǎn)孢量也無明顯差異(P>0.05)。綜合研究結(jié)果表明,TspyrG基因?qū)晟L(zhǎng)等功能無明顯影響。

    2.5 尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株庫(kù)的構(gòu)建

    為驗(yàn)證該基因作為選擇標(biāo)記的可靠性,以ΔTspyrG突變株作為受體菌,以改造后的1300pyrGeG為轉(zhuǎn)化載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由于載體中含有TspyrG基因的完整表達(dá)框,成功轉(zhuǎn)化的菌株可以在不含尿苷的基礎(chǔ)

    培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),以此作為篩選標(biāo)記挑選出成功的轉(zhuǎn)化子。同時(shí),用eGFP(enhanced green fluorescent protein,增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)基因進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)化效果。結(jié)果表明,共培養(yǎng)15個(gè)平板,篩選獲得30個(gè)可能的突變株,與基因敲除中30個(gè)板共獲得33個(gè)突變株無明顯差異。同時(shí),30個(gè)突變株的生長(zhǎng)速度有明顯差異,其中5個(gè)比野生菌Ts93快,7個(gè)比野生株慢,其他菌株無明顯差異(圖1)。隨機(jī)挑選2個(gè)轉(zhuǎn)化成功的突變株(生長(zhǎng)速度與野生株無明顯差異)進(jìn)行分析,其中突變株1在28 ℃培養(yǎng)12 h,突變株2培養(yǎng) 26 h。結(jié)果表明(圖7),在不含5-FOA與尿苷的CA培養(yǎng)基上,Ts93與回補(bǔ)株均能正常生長(zhǎng),但ΔTspyrG由于無法合成尿嘧啶而不能生長(zhǎng);在補(bǔ)充尿苷后,三者都能夠正常生長(zhǎng);而在只加5-FOA但不含尿苷的CA培養(yǎng)基上,三者均不能生長(zhǎng);當(dāng)5-FOA與尿苷都補(bǔ)充后,ΔTspyrG可以生長(zhǎng),其他兩株均無法生長(zhǎng)。eGFP基因成功轉(zhuǎn)化,菌絲與分生孢子梗有明顯熒光。同時(shí),通過PCR對(duì)突變株進(jìn)行驗(yàn)證。選取引物XhTspyrgU/XhTspyrGL擴(kuò)增TspyrG基因ORF(1 156 bp),其中野生株(泳道1)與回補(bǔ)突變株(泳道2)均可以擴(kuò)增到該基因片段,但是敲除突變株無法擴(kuò)增到基因片段。綜合上述結(jié)果表明,以ΔTspyrG為受體菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化后,由于TspyrG基因的回補(bǔ),使ΔTspyrG回復(fù)了野生株特性。

    3 討論與結(jié)論

    在本研究中,建立了一種無抗生素篩選標(biāo)記的木霉菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng),該系統(tǒng)能夠用于隨機(jī)突變株庫(kù)的構(gòu)建,同時(shí),TspyrG基因也可以作為轉(zhuǎn)基因過程的一種篩選標(biāo)記,用于基因操作。該基因在酵母菌中研究很詳細(xì),是常用的一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記[14-15],在絲狀真菌中對(duì)該基因的研究主要集中在曲霉及部分植物病原菌[16-17]。木霉菌中關(guān)于該基因的研究最早是Berges等[18]在里氏木霉中(T.reesei)的突變株庫(kù)中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)相關(guān)基因ura3和ura5。而本研究首次在棘孢木霉中克隆出該基因,同時(shí),也分析了該基因作為篩選標(biāo)記的可行性?;蚍治霰砻?,絲狀真菌中該基因的同源性很高,具有9個(gè)保守的Motif,蛋白質(zhì)大小在300~500氨基酸。進(jìn)一步研究表明,該基因破壞后,對(duì)于菌株的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢等能力無明顯影響,這也為今后用于構(gòu)建隨機(jī)突變株并篩選功能基因提供保障。同時(shí),以ΔTspyrG為受體菌構(gòu)建突變株,只需要使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基即可篩選獲得隨機(jī)突變株,大大節(jié)約了篩選成本,降低了抗生素的環(huán)境污染。對(duì)eGFP基因的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明,成功轉(zhuǎn)化后的突變株在性狀上回復(fù)了野生株的特性,而且該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得的突變株具備T-DNA的隨機(jī)整合特性,產(chǎn)生的突變株大部分生長(zhǎng)無明顯影響,但也有部分菌株出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)孢能力減弱現(xiàn)象,說明T-DNA的隨機(jī)整合造成了部分功能基因的缺失,從而影響菌株生長(zhǎng)。木霉菌是傳統(tǒng)的生防菌,具備誘導(dǎo)植物抗性、拮抗病原菌、降解環(huán)境污染物等多種功能,而且具備基因組小,分生孢子單倍體等適合遺傳轉(zhuǎn)化特性,是很好的基因功能研究材料。而TspyrG基因作為一種遺傳選擇標(biāo)記,可用于基因分子操作如雙敲除、多基因敲除,具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

    本研究從棘孢木霉Ts93中克隆獲得編碼乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因TspyrG,該基因缺失后,菌株無法在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng),需要額外補(bǔ)充尿嘧啶,但突變株能夠耐受1.0 mg/mL的5-FOA。以該基因缺失突變株為受體菌,通過回補(bǔ)試驗(yàn)表明,回補(bǔ)突變株能夠恢復(fù)缺失功能,同時(shí),轉(zhuǎn)化具備隨機(jī)整合特性,說明,該基因可以作為 Ts93基因操作的篩選標(biāo)記。

    參考文獻(xiàn) Reference:

    [1]SOOD M,KAPOOR D,KUMAR V,et al.Trichoderma:the “Secrets” of a multitalented biocontrol agent[J].Plants-Basel,2020,9(6):762-786.

    [2]GUZMAN G P,PORRAS T M D,OLMEDO M V,et al.Trichoderma species:versatile plant symbionts[J].Phytopathology,2019,109(1):6-16.

    [3]MUKHERJEE P K,HORWITZ B A,HERRERA E A, et al.Trichoderma research in the genome era[J].Annual Review of Phytopathology,2013,51:105-129.

    [4]LEE H Y,PARK E H,KIM M D.Cloning of orotidine-5′-phosphate decarboxylase (URA3) gene from sourdough yeast Candida milleri CBS 8195[J].Food Science and Biotechnology,2012,21(5):1251-1255.

    [5]PRONK J T.Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(5):2095-2100.

    [6]URBELIENE N,KUTANOVAS S,MESKIENE R,et al.Application of the uridine auxotrophic host and synthetic nucleosides for a rapid selection of hydrolases from metagenomic libraries[J].Microbial Biotechnology,2019, 12(1):148-160.

    [7]NOH M H,LIM H G,MOON D,et al.Auxotrophic selection strategy for improved production of coenzyme B-12 in Escherichia coli[J].Iscience,2020,23(3):1-8.

    [8]IWASAKI T,MIYAJIMA N Y,F(xiàn)UKAZAWA R,et al.Escherichia coli amino acid auxotrophic expression host strains for investigating protein structure-function relationships[J].Journal of Biochemistry,2021,169(4):387-394.

    [9]CAKAR Z P,SAUER U,BAILEY J E.Metabolic engineering of yeast:the perils of auxotrophic hosts[J].Biotechnology Letters,1999,21(7):611-616.

    [10] VAN B I N A,DEM S L,DEVELTER D,et al.Development of a transformation and selection system for the glycolipid-producing yeast Candida bombicola[J].Yeast,2008,25(4):273-278.

    [11]GROOT M J A,BUNDOCK P,HOOYKAAS P J J,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi[J].Nature Biotechnology,1998, 16(9):839-842.

    [12]HOOYKAAS P J J,VAN HEUSDEN G P H,NIU X L,et al.Agrobacterium-mediated transformation of yeast and fungi[J].Agrobacterium Biology:From Basic Science to Biotechnology,2018,418:349-374.

    [13]FU K H,F(xiàn)AN L L,LI Y Y,et al. Tmac1,a transcription factor which regulated high affinity copper transport in Trichoderma reesei[J].Microbiological Research,2012,167(9):536-543.

    [14]PARK E H,SEO J H,KIM M D.Cloning and characterization of the orotidine-5′-phosphate decarboxylase gene (URA3) from the osmotolerant yeast Candida magnoliae[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,22(5):642-648.

    [15]TSANG P W K,WONG K S,CHU J K M.Isolation and characterization of Candida kefyr orotidine-5 ′-phosphate decarboxylase (URA3) gene[J].Yeast,2010,27(1):53-58.

    [16]SUN X Y,ZHU J F,BAO L,et al.pyrG is required for maintaining stable cellular uracil level and normal sporulation pattern under excess uracil stress in Aspergillus nidulans[J].Science China-Life Sciences,2013,56(5):467-475.

    [17]YING S H,F(xiàn)ENG M G,KEYHANI N O.Use of uridine auxotrophy (ura3) for markerless transformation of the mycoinsecticide Beauveria bassiana[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(7):3017-3025.

    [18]BERGES T,BARREAU C.isolation of uridine auxotrophs from Trichoderma reesei and efficient transformation with the cloned ura3 and ura5 genes[J].Current Genetics,1991,19(5):359-365.

    Establishment of Transformant System for Trichoderma asperellum Using TspyrG as Selected Marker

    FAN Lili,WEI Runling,F(xiàn)U Kehe,LIU Wentao and SHI Jing

    (Department of Biology,Nanchang Normal University,Nanchang 330032,China)

    Abstract In this study,weTcqgh3FJQioCvUKLSL+GYg== cloned a TspyrG gene,which encodes orotidine-5′-phosphate decarboxylase,an essential enzyme in pyrimidine biosynthesis in T.asperellum Ts93 strain.The TspyrG gene,which does not contain introns,comprises an open reading frame of 1 140 codons and encode a 379 aa protein.The ΔtspyrG mutants were obtained via Agrobacterium-mediated transformation,which were unable to grow without the uracil.And the transformant plasmid 1300pyrG was constructed successfully based on the plasmid PCAMBIA1300.Agrobacterium transformation system with uracil auxotroph maker was successfully constructed using ΔTspyrG as recipient strain.Transformant of eGFP showed no significant difference between auxotrophic selection marker and antibiotic selection marker in the transformant system.

    Key words Trichoderma asperellum; Auxotroph; Agrobacterium-mediated transformation

    Received 2023-03-06 Returned 2023-04-06

    Foundation item Project of Jiangxi Provincial Department of Education (No.151252,No.GJJ161233);Regional Project of National Natural Science Foundation of China(No.31660020).

    First author FAN Lili,female,Ph.D,lecturer.Research area:molecular genetics of Trichoderma. E-mail:llfan31@163.com

    Corresponding author FU Kehe,male,Ph.D,lecturer.Research area:microbial soil remediation. E-mail:khfu0112@163.com

    (責(zé)任編輯:郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

    基金項(xiàng)目:江西省教育廳項(xiàng)目(151252,GJJ161233);國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目(31660020)。

    第一作者:范莉莉,女,博士,講師,主要從事木霉菌分子遺傳研究。E-mail:llfan31@163.com

    通信作者:傅科鶴,男,博士,講師,主要從事微生物土壤修復(fù)研究。E-mail:khfu0112@163.com

    最后的刺客免费高清国语| 久久久久久国产a免费观看| 99热网站在线观看| 亚洲av免费在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久国产一区二区| 国产视频首页在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产一级毛片七仙女欲春2| 精品久久久久久电影网| 欧美成人一区二区免费高清观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 黄色一级大片看看| 精品人妻视频免费看| 久久久久久国产a免费观看| 好男人在线观看高清免费视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩欧美精品v在线| 我要看日韩黄色一级片| 成人二区视频| 伦理电影大哥的女人| 日本色播在线视频| 一区二区三区四区激情视频| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美人与善性xxx| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99久国产av精品国产电影| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品久久久久久精品电影| 69av精品久久久久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看 | 九草在线视频观看| 日本午夜av视频| av在线天堂中文字幕| 午夜激情福利司机影院| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品国产三级专区第一集| 97在线视频观看| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩电影二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 一边亲一边摸免费视频| 久久97久久精品| 免费在线观看成人毛片| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产三级在线视频| 欧美zozozo另类| 国产v大片淫在线免费观看| 国产淫语在线视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频 | av免费在线看不卡| 久久久久精品性色| 午夜视频国产福利| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日本免费a在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品酒店卫生间| 最新中文字幕久久久久| 久久国内精品自在自线图片| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品一区二区性色av| 午夜激情久久久久久久| 韩国av在线不卡| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久国内精品自在自线图片| 人人妻人人看人人澡| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久99热6这里只有精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲欧美精品专区久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久久久久国产电影| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 三级国产精品欧美在线观看| 搡老乐熟女国产| 国产乱来视频区| 久久亚洲国产成人精品v| 久久99精品国语久久久| 免费观看无遮挡的男女| 久久久a久久爽久久v久久| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲最大成人av| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久久久久久成人| 久久久久精品久久久久真实原创| 午夜免费激情av| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 床上黄色一级片| 51国产日韩欧美| 亚洲精华国产精华液的使用体验| av国产免费在线观看| 日韩av在线大香蕉| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 女人被狂操c到高潮| 不卡视频在线观看欧美| 最近最新中文字幕免费大全7| 插阴视频在线观看视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品国产亚洲av天美| 99视频精品全部免费 在线| 在线免费观看的www视频| 一本一本综合久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美激情在线99| 久久精品国产亚洲av天美| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美精品国产亚洲| 青春草国产在线视频| 国产成人freesex在线| 欧美bdsm另类| 毛片女人毛片| 国产成人一区二区在线| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久久色成人| 十八禁网站网址无遮挡 | 精品一区二区三卡| 亚洲av中文av极速乱| 一个人免费在线观看电影| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产有黄有色有爽视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费av毛片视频| 亚洲精品,欧美精品| 国产av不卡久久| 毛片一级片免费看久久久久| 久久精品国产亚洲网站| 老女人水多毛片| 大陆偷拍与自拍| 国产精品人妻久久久影院| 最近2019中文字幕mv第一页| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品嫩草影院av在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久久久久久久久久免费av| 激情五月婷婷亚洲| 日本三级黄在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 乱人视频在线观看| 国产成人a区在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 久久6这里有精品| 丝袜喷水一区| 精品人妻视频免费看| 性色avwww在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 观看美女的网站| 欧美极品一区二区三区四区| 久久精品人妻少妇| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 十八禁国产超污无遮挡网站| 哪个播放器可以免费观看大片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成人欧美大片| 久久久久精品久久久久真实原创| 99热6这里只有精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产成年人精品一区二区| 少妇熟女欧美另类| 日本免费在线观看一区| 日韩强制内射视频| 免费黄频网站在线观看国产| 久久久午夜欧美精品| 69av精品久久久久久| 欧美97在线视频| 久久99蜜桃精品久久| 美女内射精品一级片tv| 色5月婷婷丁香| 亚洲国产av新网站| 亚洲成人一二三区av| 大陆偷拍与自拍| 亚洲最大成人av| 伊人久久国产一区二区| 91av网一区二区| 高清欧美精品videossex| 国产精品人妻久久久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲成人av在线免费| 搡老乐熟女国产| 久久久久久久久久久丰满| 一区二区三区高清视频在线| 色播亚洲综合网| 联通29元200g的流量卡| 亚洲精品成人久久久久久| 99久国产av精品国产电影| 内射极品少妇av片p| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久99热6这里只有精品| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品精品国产色婷婷| 国产综合懂色| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产精品国产三级专区第一集| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成人午夜精彩视频在线观看| 美女黄网站色视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 九九在线视频观看精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 免费看不卡的av| 色综合亚洲欧美另类图片| 免费黄色在线免费观看| 国产成人精品久久久久久| 亚洲最大成人av| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 日韩电影二区| 久久久成人免费电影| 少妇熟女欧美另类| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 国产伦在线观看视频一区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品福利在线免费观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 99久久九九国产精品国产免费| 有码 亚洲区| 内地一区二区视频在线| 欧美日韩在线观看h| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 欧美区成人在线视频| 18禁在线播放成人免费| 亚洲人成网站在线观看播放| 美女黄网站色视频| 久热久热在线精品观看| 国产乱人视频| 久久久久网色| 国产黄片美女视频| 欧美zozozo另类| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲欧美精品专区久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 九色成人免费人妻av| av女优亚洲男人天堂| 国产激情偷乱视频一区二区| av网站免费在线观看视频 | 97精品久久久久久久久久精品| 免费看不卡的av| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久6这里有精品| 精品久久久久久久久久久久久| 全区人妻精品视频| 国产精品不卡视频一区二区| av国产免费在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 联通29元200g的流量卡| 日本wwww免费看| 啦啦啦啦在线视频资源| 蜜臀久久99精品久久宅男| 在线 av 中文字幕| 天堂中文最新版在线下载 | 麻豆成人午夜福利视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 毛片一级片免费看久久久久| 99久久九九国产精品国产免费| 激情 狠狠 欧美| 成人美女网站在线观看视频| 一级毛片 在线播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久精品人妻少妇| 国产免费视频播放在线视频 | 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲无线观看免费| 成人国产麻豆网| 精品人妻熟女av久视频| 人人妻人人看人人澡| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久精品久久精品一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品一区二区在线观看99 | 免费观看的影片在线观看| 日韩电影二区| 久久久午夜欧美精品| 视频中文字幕在线观看| 精品久久久久久成人av| 精品熟女少妇av免费看| 精品一区在线观看国产| 国产v大片淫在线免费观看| 最近中文字幕2019免费版| 九色成人免费人妻av| 免费看av在线观看网站| 插逼视频在线观看| videossex国产| 国产毛片a区久久久久| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲精品自拍成人| 国产中年淑女户外野战色| 日本黄大片高清| av卡一久久| 国产探花极品一区二区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 97超碰精品成人国产| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲av成人精品一区久久| 我的女老师完整版在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 成人国产麻豆网| 中文字幕亚洲精品专区| 在线观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲自拍偷在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产乱人视频| 韩国av在线不卡| 男女边摸边吃奶| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 99九九线精品视频在线观看视频| 日韩成人伦理影院| 成人漫画全彩无遮挡| 18+在线观看网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 中文天堂在线官网| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久久午夜欧美精品| 51国产日韩欧美| 国产乱人视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 午夜福利在线在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 午夜激情欧美在线| 国产精品福利在线免费观看| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 男人舔奶头视频| 亚洲人与动物交配视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 国产免费一级a男人的天堂| 国产亚洲精品久久久com| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲精品国产av成人精品| 国产毛片a区久久久久| 色综合站精品国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品人妻少妇| 一区二区三区免费毛片| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久久久久中文| 久久精品综合一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 日韩国内少妇激情av| 国产综合精华液| 搞女人的毛片| 欧美zozozo另类| 成年版毛片免费区| 97热精品久久久久久| 色网站视频免费| 一本久久精品| 成人毛片a级毛片在线播放| av女优亚洲男人天堂| 欧美精品一区二区大全| 免费黄色在线免费观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 午夜久久久久精精品| 国产精品久久久久久精品电影| 中文在线观看免费www的网站| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 波多野结衣巨乳人妻| 我要看日韩黄色一级片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 91久久精品国产一区二区成人| 白带黄色成豆腐渣| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产有黄有色有爽视频| 成人av在线播放网站| 在线观看av片永久免费下载| 三级国产精品片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产69精品久久久久777片| 国产av在哪里看| 女人被狂操c到高潮| 婷婷色综合大香蕉| 极品少妇高潮喷水抽搐| 2018国产大陆天天弄谢| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 成人亚洲欧美一区二区av| 插阴视频在线观看视频| 久久热精品热| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久这里只有精品中国| 精品久久久噜噜| 国国产精品蜜臀av免费| kizo精华| 床上黄色一级片| 丝袜喷水一区| 午夜日本视频在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产亚洲精品久久久com| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜激情久久久久久久| 18禁动态无遮挡网站| 国产永久视频网站| 国产在视频线精品| 欧美激情久久久久久爽电影| av一本久久久久| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲综合色惰| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| ponron亚洲| 大香蕉97超碰在线| 九九在线视频观看精品| 日本午夜av视频| 91久久精品国产一区二区成人| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久久久午夜电影| 亚洲三级黄色毛片| 午夜激情久久久久久久| 国产色婷婷99| 国产精品人妻久久久影院| 国产免费又黄又爽又色| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 午夜久久久久精精品| 亚洲综合色惰| 老女人水多毛片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 色视频www国产| 国产黄频视频在线观看| 能在线免费观看的黄片| 91久久精品电影网| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久久久九九精品二区国产| 2021少妇久久久久久久久久久| .国产精品久久| 日韩av在线大香蕉| 一个人看视频在线观看www免费| 日本色播在线视频| 精品久久久精品久久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产69精品久久久久777片| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美潮喷喷水| 日韩强制内射视频| 人人妻人人看人人澡| 有码 亚洲区| 国产免费又黄又爽又色| 国产精品人妻久久久影院| 男女那种视频在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 中文字幕制服av| 日韩三级伦理在线观看| av在线亚洲专区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲精品中文字幕在线视频 | 如何舔出高潮| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品久久久久久av不卡| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品伦人一区二区| 97超视频在线观看视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 大片免费播放器 马上看| 我的老师免费观看完整版| 亚洲一区高清亚洲精品| 在线免费观看的www视频| 97超碰精品成人国产| 午夜福利视频精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久草成人影院| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产午夜精品论理片| 午夜老司机福利剧场| 午夜日本视频在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 夫妻午夜视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩欧美精品v在线| 国产 一区 欧美 日韩| 久久久精品欧美日韩精品| 老司机影院毛片| 最近的中文字幕免费完整| 看非洲黑人一级黄片| 成人美女网站在线观看视频| 日本av手机在线免费观看| 全区人妻精品视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产成年人精品一区二区| 亚洲,欧美,日韩| 高清欧美精品videossex| av播播在线观看一区| 在线观看人妻少妇| 深爱激情五月婷婷| 熟女电影av网| 国产69精品久久久久777片| 国产 亚洲一区二区三区 | 国产伦精品一区二区三区四那| 嫩草影院新地址| 免费观看在线日韩| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 色尼玛亚洲综合影院| 色综合站精品国产| 在线a可以看的网站| 久久久久性生活片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产伦理片在线播放av一区| 婷婷色综合www| 国产精品福利在线免费观看| 99热这里只有是精品50| 搡老妇女老女人老熟妇| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 免费看a级黄色片| av黄色大香蕉| 免费大片18禁| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品伦人一区二区| 少妇的逼好多水| 国内精品一区二区在线观看| 乱系列少妇在线播放| 久久这里只有精品中国| 亚洲精品一二三| 一区二区三区乱码不卡18| 久久99蜜桃精品久久| 一级爰片在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产高潮美女av| 欧美成人午夜免费资源| 激情 狠狠 欧美| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 成人二区视频| 床上黄色一级片| 波野结衣二区三区在线| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲av福利一区| 99久久九九国产精品国产免费| 51国产日韩欧美| 国产精品一及| 亚洲,欧美,日韩| 麻豆成人午夜福利视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品人妻久久久久久| 婷婷色综合www| 精华霜和精华液先用哪个| 秋霞伦理黄片| 最后的刺客免费高清国语| 国产真实伦视频高清在线观看| 天堂网av新在线| 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| av在线老鸭窝| 欧美激情在线99| freevideosex欧美| 亚洲av成人精品一区久久| 国精品久久久久久国模美| 日韩av不卡免费在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美精品一区二区大全| 国产乱人偷精品视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产高潮美女av| 日日啪夜夜爽| 嫩草影院新地址| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产黄片视频在线免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 中文在线观看免费www的网站| 嫩草影院新地址| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 丝袜美腿在线中文| av在线观看视频网站免费| 日韩电影二区| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲精品成人久久久久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| 大香蕉97超碰在线| 搡女人真爽免费视频火全软件|