四川省道孚縣牦牛源蜱攜帶巴爾通體、無形體和立克次體的檢測與進(jìn)化分析

摘 要 為了解四川省道孚縣牦牛體表蜱的種類及其攜帶病原情況，采集四川省道孚縣七美鄉(xiāng)、龍燈鄉(xiāng)、瓦日鄉(xiāng)和八美鎮(zhèn)的家養(yǎng)牦牛體表寄生蜱，先對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，然后采用巢氏PCR擴(kuò)增蜱類樣本中巴爾通體gltA 和rpoB、無形體16S rRNA 和斑點(diǎn)熱群立克次體ompA基因，再對陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序和比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，共采集蜱蟲1 280只，經(jīng)鑒定，隸屬于1科4屬4種，分別為微小扇頭蜱、卵形硬蜱、森林革蜱和尼泊爾血蜱。PCR檢測結(jié)果顯示，巴爾通體、無形體和斑點(diǎn)熱群立克次體的檢出率分別為18.67%（239/1280）、31.02%（397/1280）和 43.75%（560/1280）。在道孚縣4 個采樣地區(qū)的蜱中，八美鎮(zhèn)巴爾通體檢出率最高，為33.61%（80/238）；七美鄉(xiāng)無形體檢出率最高，為48.71%（170/349）；瓦日鄉(xiāng)斑點(diǎn)熱群立克次體檢出率最高，為57.57%（213/370）。在4 種蜱中，微小扇頭蜱的巴爾通體和斑點(diǎn)熱群立克次體檢出率最高，分別為28.78%（136/473）和62.58%（296/473）；尼泊爾血蜱的無形體檢出率最高，為38.25% （83/217）。另外，有248只蜱存在2種或3種病原的復(fù)合感染，復(fù)合感染率為19.38%（248/1280）。遺傳進(jìn)化分析顯示，巴爾通體、無形體和斑點(diǎn)熱群立克次體均只有1個種，分別是B.melophagi、A.marginale和Candidatus R.longicornii。表明道孚縣存在微小扇頭蜱、卵形硬蜱、森林革蜱和尼泊爾血蜱，蜱中廣泛存在B.melophagi、A.marginale和Candidatus R.longicornii的感染，同時存在病原復(fù)合感染，因此需要重點(diǎn)加強(qiáng)該地區(qū)蜱媒傳染病的監(jiān)測和預(yù)防。

關(guān)鍵zRfAXJxcHsxIWVbFhgXXR9sQ4kiFtJ6q92r1hNyoa0o=詞 牦牛；蜱；巴爾通體；無形體；斑點(diǎn)熱群立克次體

蜱隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、蛛形綱（Arachnida）、蜱目（Ixodida）的吸血外寄生蟲，它主要游離于自然界和牛、羊、馬等宿主動物體表，并通過吸食宿主血液以獲取營養(yǎng)物質(zhì)[1]。蜱在吸血時不僅能對宿主造成局部充血、水腫、瘙癢及炎癥反應(yīng)等直接危害，而且還能生物性傳播或機(jī)械傳播多種細(xì)菌、病毒、血液原蟲、立克次氏體、螺旋體等人獸共患病原微生物[2]。近年來，蜱媒病在世界各地頻發(fā)[3]，尤其在中國多地發(fā)生了蜱叮咬人致病事件，比如在延邊地區(qū)2015-2019年間僅森林腦炎病例就超過130例[4]，海南省2009-2019年間人感染立克次體病例超過1 507例[5]，這給公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)發(fā)展帶來威脅。

道孚縣位于四川省甘孜藏族自治州東北部（東經(jīng)100°32′～101°44′，北緯32°21′～30°32′），地處青藏高原東南緣的鮮水河斷裂帶，地形復(fù)雜，環(huán)境多樣，境內(nèi)擁有草原、森林、高山、河谷和峽谷，同時植被豐富。該縣以畜牧業(yè)為主，牦牛數(shù)量多（約10萬頭），養(yǎng)殖方式粗放，且驅(qū)蟲意識淡薄，這促進(jìn)了蜱的生長、繁殖。牧民在日常放牧中與牦牛接觸頻繁，易被牦牛體表蜱叮咬繼而感染相關(guān)蜱媒病。西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室曾在甘孜州石渠縣蜱中檢出Candidatus R.longicornii、饒氏立克次體（R.raoultii）[6]、綿羊無形體（A.ovis）、牛無形體（A.bovis）、疏螺旋體[7]和巴爾通體（B.melophagi）[8]，后又在九龍縣蜱中檢出饒氏立克次體（R.raoultii）[9]，但道孚縣蜱媒病的研究鮮見報道。因此，本研究以道孚縣牦牛體表寄生蜱為對象進(jìn)行調(diào)查，以期進(jìn)一步掌握巴爾通體、無形體和斑點(diǎn)熱群立克次體的感染現(xiàn)狀，從而豐富甘孜州蜱媒病的資料，為青藏高原蜱媒病的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2018年7-9月和2019年4-8 月，從甘孜州道孚縣七美鄉(xiāng)、龍燈鄉(xiāng)、瓦日鄉(xiāng)和八美鎮(zhèn)采集家養(yǎng)牦牛體表寄生蜱，其中七美鄉(xiāng)和龍燈鄉(xiāng)是純牧區(qū)，而瓦日鄉(xiāng)和八美鎮(zhèn)是半農(nóng)半牧區(qū)。每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)選擇3～4個村，每個村選擇9～10戶的牦牛群，從牦牛的頸、耳、背、尾等部位分別采集1～2只蜱，共計(jì)1 280 只（含飽血成蜱）。將采集的蜱置于收集管中，塞入酒精棉，帶回實(shí)驗(yàn)室，待完成初步形態(tài)學(xué)分類后，再放入75%酒精中，4 ℃冰箱保存，待檢。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

參照《中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志》[10]和《中國畜禽外寄生蟲形態(tài)分類彩色圖譜》[11]分類檢索表的描述，在體視顯微鏡（Leica S9D）下進(jìn)行蜱形態(tài)學(xué)鑒定，并拍照保存。

1.3 DNA提取

取出75%乙醇溶液中的蜱，用無菌水清洗 6 次，放在干凈載玻片上晾干后沿著縱向中軸線切開。再分別裝入 2 mL 離心管中，半只于-80 ℃保存，另外半只放入裝有 400 μL 無菌水的Bertin Precellys 24研磨器充分研磨。研磨參數(shù)：加入陶瓷珠（直徑0.5 mm的20珠和2 mm的5珠）， 8 000 r/min研磨2次；5 500 r/min研磨1次。取200 μL研磨液，采用北京全式金公司的組織 DNA 提取試劑盒，按說明書操作步驟提取總DNA。

1.4 蜱 ITS-2基因擴(kuò)增

蜱的分子生物學(xué)鑒定基于 ITS-2基因片段，參照Lü等[12]報道的引物序列對樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，目的基因片段大小為750～1 800 bp，引物序列為，ITS2-F：ACATTGCGGCCTTGGGT-CTT和ITS2-R：TCGCCTGATCTGAGGTCG-AC。引物由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（成都公司）合成。反應(yīng)體系：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL（擎科生物）、上下游引物各1 μL（10 μmol/L）、模板1 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性 60 s；98 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸 27 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保存。

1.5 病原體基因擴(kuò)增

采用靈敏度和特異度較高的巢式PCR分別檢測蜱中的巴爾通體、無形體和斑點(diǎn)熱群立克次體。巴爾通體的檢測先采用gltA 基因進(jìn)行初篩，再進(jìn)一步對初篩陽性樣本的rpoB 基因進(jìn)行確認(rèn)，無形體以16S rRNA 、斑點(diǎn)熱群立克次體ompA 作為靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增中使用的各種特異性引物均由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（成都公司）合成（信息詳見表1）。所有反應(yīng)均采用 25 μL PCR 反應(yīng)體系：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL（擎科生物）、上下游引物各1 μL（10 μmol/L）和模板1 μL。每次試驗(yàn)均設(shè)陽性對照（B.melophagi、A.bovis和R.raoultii的DNA由實(shí)驗(yàn)室保存）和陰性對照（ddH2O）。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性60 s；98 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸（時間根據(jù)片段大小而定，見表1），35 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.3%瓊脂糖凝膠中100 V電泳30 min后，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果并 拍照。

1.6 PCR產(chǎn)物測序及分析

PCR產(chǎn)物送生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（成都公司）進(jìn)行雙向測序，所得序列用DNAStar軟件進(jìn)行拼接并進(jìn)行人工校對，再上傳至GenBank獲得登錄號。然后在BLAST中進(jìn)行同源性比對，并用MEGA 11.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 22.0軟件對巴爾通體、無形體和SFGR的陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ２檢驗(yàn)分析不同地區(qū)蜱和不同蜱種之間3種病原陽性率的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜱形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)形態(tài)鑒定共1科4屬4種，分別為微小扇頭蜱473只（36.95%）、卵形硬蜱323只 （25.23%）、森林革蜱267只（20.87%）和尼泊爾血蜱217只（16.95%）。

各蜱外部形態(tài)特征如下（圖1）：微小扇頭蜱無緣垛，無緣溝，無肛溝，有眼，假頭基呈六邊形，氣門板呈長圓形。卵形硬蜱無眼，無緣垛，肛前溝，假頭基近五邊形，氣門板呈卵圓形。

森林革蜱有眼，有盾板，有緣垛，肛后溝，假頭基短且呈矩形。

尼泊爾血蜱無眼，有緣垛，肛后溝，假頭基呈矩形。

2.2 蜱分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 蜱ITS-2基因擴(kuò)增結(jié)果隨機(jī)挑選經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為微小扇頭蜱、卵形硬蜱、森林革蜱和尼泊爾血蜱各20只，基于  ITS-2基因片段進(jìn)行PCR鑒定，均出現(xiàn)目的條帶。

2.2.2 蜱ITS-2基因遺傳進(jìn)化分析 對蜱 ITS-2基因擴(kuò)增后的產(chǎn)物測序，所得序列經(jīng)拼接比對后，共得9條不同序列，將9條序列提交到GenBank獲得序列號分別為：微小扇頭蜱序列3條（OP947624、OP947625和OP947626），卵形硬蜱序列1條（OP947618），森林革蜱序列3條（OP947621、OP947622和OP947623），尼泊爾血蜱序列2條（OP947619和OP947620）。再分別與GenBank中注冊的扇頭蜱屬、硬蜱屬、革蜱屬和血蜱屬的 ITS-2基因序列進(jìn)行同源性比對，并下載相關(guān)序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示，各屬內(nèi)各蜱種均聚類在一起，為屬分支，其中微小扇頭蜱的3條序列均與河南微小扇頭蜱24-2株（KX450289）、甘肅微小扇頭蜱（JQ737124）和貴州微小扇頭蜱（JQ737125）聚為一支，親緣關(guān)系最近，同源性分別為98.42%、97.79%和 98.64%。卵形硬蜱序列與云南卵形硬蜱YNP2株（KU664537）聚為一支，親緣關(guān)系最近，同源性最高為95.45%。森林革蜱3條序列與甘肅民樂縣的森林革蜱（JQ737113）聚為一支，親緣關(guān)系最近，同源性分別為99.87%、99.86%和99.23%。尼泊爾血蜱2條序列與云南尼泊爾血蜱DQ12株（KY777483）聚為一支，親緣關(guān)系最近，同源性最高，分別為99.73%和99.75%。

2.3 巴爾通體gltA 和rpoB 基因遺傳進(jìn)化分析

對所有巴爾通體PCR陽性產(chǎn)物測序，所得序列經(jīng)拼接比對后，共得7條不同序列，其中g(shù)ltA序列4條（OP933402、OP933403、OP933404和OP933405）；rpoB序列3條（OP93339、OP933400和OP933401）。再分別與GenBank中注冊的巴爾通體gltA和rpoB 基因序列進(jìn)行同源性比對，下載相關(guān)序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖3和圖4）。結(jié)果顯示，基于gltA和rpoB基因均只鑒定出B.melophagi，其中g(shù)ltA基因的4條序列與美國B.melophagi K-2C株（AY724768）、墨西哥綿羊未定種巴爾通體（MH282928）、秘魯B.melophagi R209株（MT154626）及中國甘肅的B.melophagi聚為同一分支，blast比對結(jié)果顯示，與美國B.melophagi K-2C株同源性最高，為99.4%以上?；趓poB基因的3條序列與美國B.melophagi K-2C株（EF605288）、波蘭B.melophagi Mov8株（MW484896）和泰國B.melophagi S302株（MT268362）聚為同一分支，親緣關(guān)系最近，同源性分別為99.68%、98.33%和99.34%。

2.4 無形體16S rRNA 基因遺傳進(jìn)化分析

對所有無形體 PCR陽性產(chǎn)物測序，所得序列經(jīng)拼接比對后，共得4 條不同序列，提交GenBank獲得序列號分別為OP889254、OP889255、OP889256和OP889257，4 條序列之間的相似性為 99.95%～99.97%。將4條序列與NCBI中注冊的序列進(jìn)行同源性比較，下載同源性最高的幾條序列，并下載其他無形體的16S rRNA基因序列等作為參考序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。結(jié)果顯示，該地區(qū)蜱主要攜帶邊緣無形體，其中OP889254、OP889255和OP889256與巴基斯坦西北部邊緣無形體（MK680807）、匈牙利邊緣無形體（MH020201）、肯尼亞邊緣無形體（OM090743）、澳大利亞邊緣無形體（AF414874）、南非邊緣無形體（AF414871）和中國武漢的邊緣無形體WHBMXZ-130（KX987330）株聚于一個分支上，同源性最高，分別為99.53%、99.54%和99.07%。OP889257單獨(dú)與沙特阿拉伯邊緣無形體（OM090740）聚為另一個分支，同源性為99.67%。

2.5 斑點(diǎn)熱群立克次體ompA 基因的遺傳進(jìn)化分析

對所有SFGR的陽性產(chǎn)物測序，所得序列經(jīng)拼接比對后，共得3 條不同序列，提交到GenBank獲得序列號分別為OP948033、OP948034和OP948035，再與GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊的斑點(diǎn)熱群立克次體ompA基因序列進(jìn)行同源性比對，下載相關(guān)序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖6）。結(jié)果顯示，該地區(qū)蜱主要攜帶Candidatus R.longicornii，3 條序列與中國檢測到的Candidatus R.longicornii YBHC-T32株（MN026548）和韓國檢測到的Candidatus R.longicornii ROK-HL727株（MG906676）聚于一支，親緣關(guān)系最近，同源性分別為99.60%、99.59%和99.19%。

2.6 巴爾通體、無形體和SFGR的檢測結(jié)果

1 280只蜱中共檢出巴爾通體 239 份、無形體397 份和斑點(diǎn)熱群立克次體 560 份，檢出率分別為18.67%、31.02%和 43.75%。

2.6.1 不同地區(qū)蜱攜帶病原體情況 在道孚縣4 個采樣地區(qū)的蜱中，巴爾通體檢出率從高到低依次為八美鎮(zhèn)33.61%、瓦日鄉(xiāng)20%、七美鄉(xiāng) 18.05%、龍燈鄉(xiāng)6.81%，經(jīng) χ2 檢驗(yàn)，八美鎮(zhèn)的檢出率顯著高于其他 3 個地點(diǎn)（P<0.05）。無形體檢出率從高到低依次為七美鄉(xiāng)48.71%、龍燈鄉(xiāng) 46.75%、瓦日鄉(xiāng)20.54%、其中八美鎮(zhèn)并未檢出，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，龍燈鄉(xiāng)和七美鄉(xiāng)的檢出率顯著高于瓦日鄉(xiāng)（P<0.05）。斑點(diǎn)熱群立克次體檢出率從高到低依次為瓦日鄉(xiāng)57.57%、七美鄉(xiāng) 46.42%、龍燈鄉(xiāng)33.44%、八美鎮(zhèn)32.35%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，瓦日鄉(xiāng)的SFGR檢出率顯著高于龍燈鄉(xiāng)和八美鎮(zhèn) （P<0.05）（表2）。

2.6.2 不同蜱攜帶病原體情況 在道孚縣4 個種類的蜱中，巴爾通體檢出率從高到低依次為微小扇頭蜱28.78%、卵形硬蜱23.84%、森林革蜱6.74%、尼泊爾血蜱3.69%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，微小扇頭蜱和卵形硬蜱的巴爾通體檢出率顯著高于森林革蜱和尼泊爾血蜱（P<0.05）。無形體檢出率從高到低依次為尼泊爾血蜱38.25%、卵形硬蜱 33.13%、微小扇頭蜱28.33%、森林革蜱 26.59%，經(jīng)χ2 檢驗(yàn)，4種蜱的無形體檢出率差異不顯著（P>0.05）。斑點(diǎn)熱群立克次體檢出率從高到低依次為微小扇頭蜱62.58%、尼泊爾血蜱36.41%、卵形硬蜱34.67%、森林革蜱27.34%，經(jīng)χ2 檢驗(yàn)，微小扇頭蜱的SFGR檢出率顯著高于卵形硬蜱、森林革蜱和尼泊爾血蜱（P<0.05）（表3）。

2.6.3 不同地區(qū)蜱的復(fù)合感染情況 道孚縣有248只蜱存在復(fù)合感染，復(fù)合感染率為19.38%，其中復(fù)合感染率最高的地區(qū)是龍燈鄉(xiāng)，達(dá) 29.10%（94/323）。雙重復(fù)合感染率為18.28%，其中巴爾通體與SFGR復(fù)合感染率最高，為 8.67%（111/1 280）。三重復(fù)合感染率為1.09%（14/1 280），其中龍燈鄉(xiāng)三重病原體復(fù)合感染最高，達(dá)2.43%（9/323）（表2）。

2.6.4 不同蜱復(fù)合感染情況 道孚縣4個種類的蜱中均存在復(fù)合感染，其中復(fù)合感染率最高的是卵形硬蜱，達(dá)26.62%（86/323）。另外，巴爾通體+SFGR和無形體+SFGR復(fù)合感染率最高的也是卵形硬蜱，分別為14.86%（48/323）和 10.80%（35/323）。巴爾通體+無形體和3 種病原體復(fù)合感染率最高的是微小扇頭蜱，分別為 3.38%（16/473）和2.33%（11/473）（表3）。

3 討 論

本研究在道孚縣共采集到4種蜱，分別是微小扇頭蜱、卵形硬蜱、森林革蜱和尼泊爾血蜱，其中微小扇頭蜱和卵形硬蜱在半農(nóng)牧區(qū)和純牧區(qū)均有分布，但主要分布在半農(nóng)牧區(qū)，而森林革蜱和尼泊爾血蜱只分布在純牧區(qū)，這可能與當(dāng)?shù)睾０?、自然環(huán)境和蜱的生活習(xí)性有關(guān)。道孚縣地形復(fù)雜、地貌多樣（包括平壩、臺地、中山、高山、極高山、高平壩），境內(nèi)海拔差異大，其中本次采樣點(diǎn)半農(nóng)牧區(qū)的八美鎮(zhèn)和瓦日鄉(xiāng)海拔約為3 500 m[JP]和3 800 m，純牧區(qū)的龍燈鄉(xiāng)和七美鄉(xiāng)海拔分別約為4 276 m和4 000 m。李凱瑞等[17]研究表明蜱的分布受氣候和地理分隔的影響。劉凱等[18]在氣候環(huán)境因子對中國森林革蜱適生區(qū)的影響研究表明：海拔是影響森林革蜱分布的主要因素，主要分布在高海拔山區(qū)。尼泊爾血蜱屬于爬中血蜱亞屬，主要分布在中亞高原，源于尼泊爾地區(qū)，后傳入中國西藏樟木口岸、日喀則、那曲和云南。因此純牧區(qū)七美鄉(xiāng)和龍燈鄉(xiāng)的海拔和環(huán)境，更適合尼泊爾血蜱和森林革蜱的孳生。馬奔等[19]研究表明，卵形硬蜱分布受季節(jié)、降水量和海拔的影響，主要分布在中國西南部海拔較高雨量較充沛的山地林區(qū)。姚曉燕等[20]研究表明，微小扇頭蜱主要分布于中國南方海拔較低氣候溫暖濕潤的地區(qū)，海拔主要在 4 000 m以下，而本研究有少部分微小扇頭蜱從海拔超過4 000 m的龍燈鄉(xiāng)和七美鄉(xiāng)采集，這可能與微小扇頭蜱為單宿主蜱有關(guān)。本研究的蜱從牦牛體表采集，該地牦牛以夏季高山放牧，冬季河谷放牧為主的飼養(yǎng)方式，牦牛的流動性大，所以在海拔超過4 000 m的地區(qū)采集到微小扇頭蜱。因此，后期可采用拖布法采集游離蜱，從而進(jìn)一步掌握該地微小扇頭蜱的分布。

本次分子檢測結(jié)果顯示，道孚縣蜱的SFGR檢出率與石渠縣和九龍縣相似[6，9]，但種類有一定的差異，根據(jù)遺傳進(jìn)化分析表明，道孚縣的蜱主要檢出Candidatus R.longicornii，而石渠縣和九龍縣以R.raoultii為主。 Candidatus R.longicornii首次從韓國的長角血蜱中發(fā)現(xiàn)[21]，也是中國新發(fā)的蜱傳立克次體，近年來先后從吉林延邊和琿春、廣東、廣西、云南和四川德陽等多地蜱中被檢測到[22-25]。目前，已從長角血蜱、森林革蜱、嗜群血蜱、日本血蜱、全溝硬蜱、微小扇頭蜱等檢出了Candidatus R.longicornii。另外，本研究微小扇頭蜱的檢出率顯著高于卵形硬蜱、森林革蜱和尼泊爾血蜱，這可能與蜱的種類有關(guān)。李基旭研究表明長角血蜱攜帶Candidatus R.longicornii基因型存在種特異性，且能經(jīng)卵傳播，其感染率明顯高于其他蜱種[22]。張明珠[23]研究表明微小扇頭蜱也可經(jīng)卵垂直傳播Candidatus R.longicornii，傳遞給下一代，使之長期在該種蜱中流行。

道孚縣蜱的巴爾通體檢出率為18.67%，低于石渠縣蜱中的報道（30.70%）[8]，但感染種類一致，均為B.melophagi。該種是中國近年新發(fā)的巴爾通體之一，現(xiàn)已證實(shí)具有感染人的特性，截止目前，在四川省甘孜州和阿壩州、甘肅、新疆[26]、西藏[27]和云南相繼有報道。研究表明巴爾通體種類多，其已知的宿主動物較廣泛，不同巴爾通體的主要宿主有差異，比如家貓（流浪貓）是B.henselae的主要宿主，嚙齒類動物是大多數(shù)巴爾通體的最大貯存宿主。然而，目前尚無從嚙齒類動物體內(nèi)檢出B.melophagi的報道，國內(nèi)外的B.melophagi主要從羊血中檢出[28-30]，Kosoy等[28]從圈養(yǎng)綿羊中檢出B.melophagi，結(jié)果表明綿羊是 B.melophagi 的天然宿主。本試驗(yàn)從牦牛體表采集的4種蜱中均檢出B.melophagi，也曾抽取部分牦牛血液進(jìn)行檢測，但并未檢出。因此下一步將對該地的藏綿羊進(jìn)行檢測，從而進(jìn)一步驗(yàn)證藏綿羊是否同樣為B.melophagi的重要宿主。

本研究采用16S rRNA基因進(jìn)行無形體檢測，僅檢出邊緣無形體，檢出率為31.02%。不同地區(qū)蜱無形體檢出率差異較大，龍燈鄉(xiāng)、七美鄉(xiāng)、瓦日鄉(xiāng)的檢出率分別為46.75%、48.71%和 20.54%，純牧區(qū)的龍燈鄉(xiāng)和七美鄉(xiāng)檢出率遠(yuǎn)高于半農(nóng)牧區(qū)的瓦日鄉(xiāng)。另外，無形體感染種類與石渠縣的有所不同，其原因可能與兩地的環(huán)境和蜱的種類有關(guān)。許多研究表明不同蜱攜帶無形體的種類不同，比如孟慶玲等[31]從古爾班通古特沙漠南緣的殘緣璃眼蜱中攜帶邊緣無形體，長角血蜱中攜帶綿羊無形體（A.ovis）。武琳等[32]從內(nèi)蒙古地區(qū)的草原革蜱中僅檢出綿羊無形體。而在石渠縣的報道中青海血蜱僅檢出牛無形體，西藏革蜱僅檢出綿羊無形體。

本研究中蜱攜多種病原體的復(fù)合感染率為19.38%，與劉丹[33]在內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)牙克石段（19.50%）的研究結(jié)果相似，高于李伊娜在內(nèi)蒙古中西部口岸地區(qū)的報道（13.65%）。越來越多的研究表明，復(fù)合感染在斑點(diǎn)熱群立克次體中多見[33-34]。本研究蜱中SFGR與巴爾通體和SFGR與無形體的復(fù)合感染率較高，分別為8.67%和7.99%。此外，微小扇頭蜱、卵形硬蜱、森林革蜱和尼泊爾血蜱均存在 2 種或 3 種病原混合感染的情況。

蜱能傳播多種不同自然疫源性疾病和人畜共患病，且臨床表現(xiàn)多樣，甚至造成死亡。本研究表明，道孚縣蜱中B.melophagi、Candidatus R.longicuBdamlqHMXlCwVpZZiwmmg==ornii和A.marginale的感染率較高，且存在復(fù)合感染，加上當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)方式粗放、牧民驅(qū)蟲意識淡薄，這增加了人－蜱－家畜接觸的機(jī)會，對公共衛(wèi)生安全存在威脅，對畜牧業(yè)發(fā)展造成極大制約。因此，接下來開展進(jìn)一步研究，一是要開展持續(xù)性、系統(tǒng)性的監(jiān)測；二要加強(qiáng)驅(qū)蟲宣傳，提高牧民驅(qū)蟲意識；三要關(guān)注家畜和不明原因發(fā)熱患者感染蜱媒病原的相關(guān)報道，從而掌握更詳盡的資料，為青藏高原相關(guān)蜱媒病的防控提供參考。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ CHEN Z，YANG X，BU F，et al.Ticks（Acari：Ixodoidea：Argasidae，Ixodidae） of China [J].Experimental Applied Acarolgy，2010，51（4）：393-404.

［2］KAYOKO Y，HIROKA A，HIROTAKA K.Distribution of tick borne diseases in Japan：past patterns and implications for the future [J]. Journal of Infect Chemotherapy， 2018，24（7）：499-504.

［3］ZAHRA R，ALI R C，ZAKKYEH T，et al.Ticks（Acari：Ixodidae） of livestock and their seasonal activities，northwest of Iran [J].Asian Pac J Trop Diseases，2014，4（2）：574-578.

［4］葉尚儀，李香淑，鄭善子.延邊地區(qū)130例森林腦炎回顧性分析[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報，2020，43（3）：199-201.

YE SH Y，LI X SH，ZHENG SH Z.Retrospective analysis of 130 cases of tick- borne encephalitis in Yanbian area [J].Journal of Medical Science Yanbian University，2020， 43（3）：199-201.

［5］高浩然，劉 水，王凱新，等.1 507例立克次體病患者的流行病學(xué)特征[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2022，22（2）：283-286，290.

GAO H R，LIU SH，WANG K X，et al.Epidemiological investigation of 1 507 patients with rickettsial disease [J].Journal of Tropical Medicine，2022，22（2）：283-286，290.

［6］劉城成，唐天才，塔 英，等.四川石渠縣牦牛源蜱感染斑點(diǎn)熱群立克次體分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國人獸共患病學(xué)報，2020，36（1）：50-55.

LIU CH CH，TANG T C，TA Y，et al.Molecular detection of spotted fever group rickettsiae-infected ticks collected from yaks in Shiqu County of Sichuan Province，China [J].Chinese Journal of Zoonoses，2020，36（1）：50-55.

［7］唐天才，劉城成，魏 巍，等.四川石渠縣牦牛體表蜱攜帶無形體和疏螺旋體的分子檢測[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2020，40（9）：1758-1764.

TANG T C，LIU CH CH，WEI W，et al.Molecular identification of Anaplasma species and Borrelia species in ticks collected from yaks in Shiqu of Sichuan Province [J].Chinese Journal of Veterinary Science，2020，40（9）：1758-1764.

［8］唐天才，劉城成，袁東波，等.四川石渠縣牦牛源蜱感染巴爾通體的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，31（7）：1066-1072.

TANG T C，LIU CH CH，YUAN D B，et al.Molecular detection of Bartonella infection in ixodid ticks collected from yaks in Shiqu County of Sichuan Province [J].Acta Agriculturae Zhejiangensis，2019，31（7）：1066-1072.

［9］肖晨冬，袁東波，尹念春，等.四川九龍縣牦牛源蜱感染SFGR分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國動物傳染病學(xué)報，2023，31（5）：159-167.

XIAO CH D，YUAN D B，YIN N CH，et al.Molecular detection of SFGR in ticks collected from Yaks in Jiulong county of Sichuan Province，China [J].Chinese Journal of Animal Infectious Diseases，2023，31（5）：159-167.

［10］ 鄧國藩，姜在階.中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志（ 第三十九冊）[M].北京：科學(xué)出版社，1991.

DENG G P，JIANG Z J.Economic insect fauna of China（ Fasc 39） [M].Beijing：Science Press，1991.

［11］劉光遠(yuǎn)，黃 兵，郭憲國.中國畜禽外寄生蟲形態(tài)分類彩色圖譜[M].北京：科學(xué)出版社，2020.

LIU G Y，HUANG B，GUO X G.Color Atlas of Ectozoa Morphological Classification for Livestock and Poultry in China[M].LOpOFV0oamZZdU3zBs8z5edfpMmGtlX7YrU9T+BR3n4=Beijing：China Science Press，2020.

［12］L J ZH，WU SH Q，ZHANG Y N，et al.AssessmeGxnZdCWIa15oNjkfMH0epKs60aQGMGsEPjILLi3xtJA=nt of four DNA fragments（COI，16S rDNA，ITS2，12S rDNA） for species identification of the Ixodida（Acari：Ixodida） [J].Parasit Vectors，2014，7：93.

［13］REIS C，COTE M，PAUL R E，et al.Questing ticks in suburban forest are infected by at least six tick-borne pathogens [J].Vector Borne and Zoonotic Diseases，2011，11（7）：907-916.

［14］BLACK W C，PIESMAN J.Phylogeny of hard- and soft-tick taxa（Acari：Ixodida） based on mitochondrial 16S rDNA sequences [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1994，91（21）：10034-10041.

［15］HAN D G，RYU J H，CHAE J B，et al.First report of Anaplasma phagocytophilum infection in Holstein cattle in the Republic of Korea [J].Acta Tropica，2018，183：110-113.

［16］ISABEL G，F(xiàn)ERNANDEZ DE MERA，VALERIA BLANDA，et al.Identification and molecular characterization of spotted fever group rickettsiae in ticks collected from farm ruminants in Lebanon [J].Ticks and Tick-borne Diseases，2018，9（1）：104-108.

［17］李凱瑞，李 飛，何 波，等.新疆南疆部分地區(qū)3種璃眼蜱的分子生物學(xué)鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，27（12）：1716-1722.

LI K R，LI F，HE B，et al.Molecular identification of three species of ticks in southern Xinjiang [J].Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica， 2018，27（12）：1716-1722.

［18］劉 凱，姚曉燕，寸得嬌，等.氣候環(huán)境因子對我國森林革蜱適生區(qū)的影響研究[J].中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2021，32（6）：732-735.

LIU K，YAO X Y，CUN D J，et a1.Effects of climatic and environmental factors on the potential geographic distribution of Dermacentor silvarum in China [J].Chinese Journal of Vector Biology and Control，2021，32（6）：732-735.

［19］馬 奔，馬曉羽，陳會波，等.環(huán)境因子對我國卵形硬蜱適生區(qū)分布的影響研究（英文）[J].中國血吸蟲病防治雜志，2021，33（3）：281-286.

MA B，MA X Y，CHEN H B，et al.Effects of environmental factors on the distribution of suitable habitats of Ixodes ovatus in China（English）[J].Chinese Journal of Schistosomiasis Control，2021，33（3）：281-286.

［20］姚曉燕，田 娜，馬 奔，等.氣候變化對我國微小扇頭蜱分布區(qū)的影響[J].中國血吸蟲病防治雜志，2021，33（3）：267-273.

YAO X Y，TIAN N，MA B，et al.Effects of climate changes on the distribution of Rhipicephalus microplus in China[J].Chinese Journal of Schistosomiasis Control，2021，33（3）：267-273.

［21］JIANG J，AN H J，JOHN S L，et al.Molecular characterization of Haemaphysalis longicornis-borne rickettsiae，Republic of Korea and China[J].Ticks and Tick-borne Diseases，2018，9（6）：1606-1613.

［22］李基旭，樸 文，金光俊.長角血蜱經(jīng)卵傳播斑點(diǎn)熱群立克次體新基因型Candidatus Rickettsia longicornii的研究[J].中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2021，32（2）：139-143.

LI J X，PIAO W，JIN G J.Transovarial transmission of a new genotype Candidatus Rickettsia longicornii of spotted fever group Rickettsia in Haemaphysalis longicornis [J].Chinese Journal of Vector Biology and Control，2021，32（2）：139-143.

［23］YUAN T T，DU C H，XIA L Y，et al.Molecular evidence of candidatus Rickettsia longicornii and a novel Rickettsia strain from ticks in southern China [J].Ticks and Tick-borne Diseases，2021，12（3）：101679.

［24］張明珠.新發(fā)山丘立克次體的流行病學(xué)、生物學(xué)和基因組學(xué)特征分析[D].北京：軍事科學(xué)院，2022.

ZHANG M ZH.Investigations on epidemiological，biological and genomic characteristics of newly discovered Rickettsia hills [D].Beijing：Academy of Military Sciences，2022.

［25］JIANG J，AN H，LEE J S，et al.Molecular characterization of Haemaphysalis longicornis-borne rickettsiae，Republic of Korea and China [J].Ticks and Tick-borne Diseases，2018，9（6）：1606-1613.

［26］NI J，REN Q Y，LIN，H L，et al.Molecular evidence of Bartonella melophagi in Ticks in Border Areas of Xinjiang，China [J].Frontiers in Veterinary Science，2021，8：675457.

［27］周賽賽，謝太鳳，錢雯嫻，等.西藏羊蜱蠅中巴爾通體檢測及gltA基因序列分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2020，51（5）：1119-1125.

ZHOU S S，XIE T F，QIAN W X，et al.Detection of Bartonella and sequence analysis of gltA gene in Tibetan Melophagus ovinus [J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2020，51（5）：1119-1125.

［28］KOSOY M，BAI Y，ENSCORE R，et al.Bartonella melophagi in blood of domestic sheep（Ovis aries） and sheep keds（Melophagus ovinus） from the southwestern US：Cultures，genetic characterization，and ecological connections [J].Veterinary Microbiology，2016，190：43-49.

［29］KUMSA B，PAROLA P，RAOULT D，et al.Bartonella melophagi in Melophagus ovinus（sheep ked） collected from sheep in northern Oromia，Ethiopia [J].Comp Immunol Microbiol Infect Diseases，2014，37（1）：69-76.

［30］LIU Y，HE B，LI F，et al.Molecular identification of Bartonella melophagi and Wolbachia Supergroup from sheep keds in Xinjiang，China [J].The Korean Journal of Parasitology，2018，56（4）：365-370.

［31］孟慶玲，喬 軍，盛金良，等.古爾班通古特沙漠南緣蜱攜帶無形體的調(diào)查[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2012，32（8）：1158-1163.

MENG Q L，QIAO J，SHENG J L，et al.Survey on tick-borne anaplasmataceae in the south edge of Gurbantunggut desert [J].Chinese Journal of Veterinary Science，2012，32（8）：1158-1163.

［32］武 琳，祁冬冬，邢麗麗，等.內(nèi)蒙古部分地區(qū)草原革蜱攜帶無形體檢測與進(jìn)化分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2021，37（12）：1084-1090.

WU L，QI D D，XING L L，et al.Identification and evolution analysis of Anaplasmas carried by Dermacentor nuttalli in some areas of Inner Mongolia [J].Chinese Journal of Zoonoses，2021，37（12）：1084-1090.

［33］劉 丹，烏蘭圖雅，殷旭紅，等.內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)牙克石段的蜱種及蜱攜病原體感染調(diào)查[J].中國人獸共患病學(xué)報，2021，37（9）：845-850，857.

LIU D，WULANTUYA，YIN X H，et al.Investigation of tick species and pathogen infection status in the Yakeshi Section of the Greater Khingan Mountains，Inner Mongolia，China [J].Chinese Journal of Zoonoses，2021，37（9）：845-850，857.

［34］DANIEL H，DANIELA J，ANDREA S，et al.Transovarial transmission of Borrelia spp.，Rickettsia spp.and Anaplasma phagocytophilum in Ixodes ricinus under field conditions extrapolated from DNA detection in questing larvae [J].Parasit Vectors，2020，13（1）：176.

Detection and Phylogenetic Analysis of Bartonella，Anaplasma and Spotted Fever Group Rickettsia in Ticks from Yaks in Daofu County of Sichuan Province

TANG Tiancai1，LAN Lan2，GAO Wenwu2，CHEN Tianxiang3，XIAO Chendong4，HAO Lili5，LUO Yong6，CHEN Heqiang7，YANG Xingkang8，PAN Yao2 and YIN Nianchun9

（1.Yibin University，Yibin Sichuan 644000，China; 2.Animal Husbandry Research Institute of Ganzi Tibetan Autonomous

Prefecture，Ganzi Sichuan 626000，China；3.Ruoergai County Bureau of Science，Technology，Agriculture，and Animal Husbandry，Ruoergai Sichuan 624000，China; 4.Center for Animal Disease Control and Prevention of Xiangcheng County，Xiangcheng Sichuan 627850，China; 5.Southwest Minzu University，Chengdu 610041，China;6.Center for Animal Disease Control and Prevention of Seda County，Seda Sichuan 624300，China; 7.Centerfor Animal Disease Control and Prevention of Ganzi Prefecture，Ganzi Sichuan 626000，China; 8.Center forAnimal Disease Control and Prevention of Jiulong County，Jiulong Sichuan 616200，China;9.Suining Agriculture and Rural Bureau，Suining Sichuan 629000，China）

Abstract To investigate tick species and tick-borne pathogens from yaks in Daofu County，Sichuan Province，the ticks were collected from domesticated yaks in Qimei，Wari，Longdeng and Bamei，Daofu County，Sichuan Province.The ticks were then classified by morphological and molecular identification.The partial sequences of gltA and rpoB gene of Bartonella，the 16S rRNA gene of Anplasma and ompA gene of Spotted Fever Group Rickettsia（SFGR） were amplified using nested PCR，respectively.The positive products were sequenced and compared through the NCBI database.Phylogenetic trees were constructed using the adjoining method.The results showed that a total of 1 280 ticks were collected and identified，belonging to 4 species，4 genera and 1 family.The identified tick species were Rhipicephalus microplus，Ixodes ovatus，Dermacentor silvarum and Haemaphysalis nepalensis.Based on the PCR results，the detection rates of Bartonella，Anaplasma and SFGR in these ticks were 18.67%（239/1280），31.02%（397/1280） and 43.75%（560/1280），respectively.Among the four sampling areas，the highest detection rates of Bartonella，Anaplasma，and SFGR were observed in ticks collected from Bamei（36.1%，80/238），Qimei（48.71%，170/349），and Wari（57.57%，213/370），respectively.Among the four tick species，R.microplus exhibited the highest infection rates of Bartonella（28.78%，136/473） and SFGR（62.58%，296/473），while H.nepalensis had the highest detection rate of Anaplasma（38.25%，83/217）.In addition，248 ticks were found to be infected with two or three pathogens，resulting in a co-infection rate of 19.38%（248/1280）.Phylogenetic analysis revealed that Bartonella，Anaplasma and SFGR each had only one species，which were B.melophagi，A.marginale and Candidatus R.longicornii，respectively.Four tick species， R.microplus，I.ovatus， D.silvarum and H.nepalensis， were found in Daofu County.B.melophagi，A.marginale and Candidatus R.longicornii were highly prevalent in the ticks.Meanwhile，co-infection of at least two pathogens was observed in 19.38% ticks.The results here indicate that it is necessary to strengthen the surveillance and prevention of tick-borne diseases in the future.

Key words Yaks; Ticks; Bartonella; Anaplasma; SFGR Received 2023-03-24 Returned 2023-06-05

Foundation item The Teacher Cultivation Project of Yibin University（No.412-2021PY066）.

First author TANG Tiancai，male，master.Research area：animal disease control and prevention. E-mail： 495390522@qq.com

Corresponding author PAN Yao，female，master.Research area：animal disease control and prevention.E-mail：1398254175@qq.com

YIN Nianchun，female，senior veterinarian.Research area：animal disease control and prevention.E-mail：68781715@qq.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）